ГОСУДАРСТВЕННОЕ

САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЕ НОРМИРОВАНИЕ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

т шшашвт

Часть 12

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Сборник

методических документов, необходимых для обеспечения применения Федерального закона от 12 июня 2008 г. № 88-ФЗ «Технический регламент на молоко и молочную продукцию»

Часть 12

4. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

-    10,0 г    Стерилизация    автоклавированием

-5,0.г    при    121    °С    ±    1    °С

-    20,0 т    20    мин    ±    3    мин

-    до 1000 мл -7,0 ±0,1

Среда №3

Бульон Хоттингера с содержанием аминного азота 100 мг%- 1000 мл Агал-агар 20,0 ±0,1

Глюкоза /добавляют в расплавленный агар 40 % глюкозу в количестве 2,5 мл на 100 мл среды/

pH среды после стерилизации 6,4 ± 0,1 Стерилизация автоклавированием

при 121 °С± 1 °С 20 мин ± 3 мин

Среда № 4

Бульон Хоттингера с содержанием аминного азота 33 мг% - 1000 мл Агар-агар    - 25,0 ± 0,1 г Стерилизация автоклавированием

pH среды    - 6,1 ± 0,1    при 121 °С ± 1 °С

20 мин ± 3 мин

Среда № 5

Бульон Хоттингера с содержанием аминного азота 33 мг% - 1000 мл

Агар-агар NaHP0₄ pH среды

-10,0 ± 0,1 г    Стерилизация автоклавированием

-    5,0 ± 0,05 г при 121 °С ± 1 °С

-    20,0 ± 0,1 г 20 мин +3 мин

-    до 1000 мл -6,5 ±0,1

52

Среда № 7 Пептон    -6,0 ±0,1 г

Панкреатический гидролизат казеина, сухой - 4,0 ± 0,05 г, /или 40,0 ± 1 мл жидкого/

Дрожжевой экстракт, сухой - 3,0 ± 0,05 г /или 30,0 ± 1 мл жидкого/

Мясной экстракт, сухой - 1,5 ± 0,01 г /или 15,0 ± 0,5 мл мясной воды/ Глюкоза    - 1,0 ± 0,01 г Стерилизация автоклавированием

Агар-агар    - 20,0 ± 0,1 г при 115 °С ±3 °С- 20мин ± 3 мин

Вода дистиллированная - до 1000 мл pH среды    - 6,5 ± 0,1

Среда № 8

Мясная вода 1:2    - 500 ± 1 мл Стерилизация автоклавированием

Пептон    -5,0 ±0,05 г при 121 °С± 1 °С-20мин±3 мин

Хлористый натрий    - 2; 5 г

Фосфат калия двухзамещенный - 3,0г

Агар-агар    - 6,0

Вода дистиллированая до 1000 мл

pH среды    - 7,8—8,0

5. БУФЕРНЫЕ РАСТВОРЫ для экстракции антибиотиков из исследуемого материала

1. Физиологический раствор NaCl - 8,5 г Н₂0 - до 1 л

5.2 % раствор пепсина на фосфатном буфере с pH 6,0 пепсин медицинский - 2 г буфер    -100    мл 6. Фосфатный буфер pH 7,9 ± 0,1 К2НР04 -16,73 г КН2Р04 - 0,523 г Н20 - до 1 л

/Асегггично взвешенную навеску Пепсина вносят в стреильный буфф перед проведением анализа/ Стерилизация автоклавированием при 121 °С ± 1 °С - 20 мин ± 3 мин

---

7. Цитратно-солянокислый, pH 3,1 ± 0,1

I    раствор - 22,6 г лимоннокислого натрия растворяют в 1 л воды;

II    раствор - 8,2 мл конц. НС1 с уд* весом 1,19 растворяют в 1 л дистиллированной воды

Буфер готовят при смешивании двух растворов;

62 мл I раствора + 100 мл II раствора, pH буфера 3,0 ± ОД

Стерилизация - 121 °С ± I °С - 20 мин ± 3 мин.

6. ВЫРАЩИВАНИЕ ТЕСТ-КУЛЬТУР И ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАБОЧИХ КОНЦЕНТРАЦИЙ

Тест-культурами служат специально отобранные, образующие и необразующие опоры, непатогенные или условнопатогенные штаммы микроорганизмов, обладающие высокой чувствительностью к антибиотикам. Они должны хорошо расти на применяемых средах, образуя сплошной газон и четко очерченные зоны задержки роста в местах диффузии антибиотиков в агар,

6.1. Приготовление спор Вас. cereus АТСС 11778

Культуру высевают в пробирки со скошенный агаром /2 % МПА, pH 7,1 ± ОД/ и выращивают при 29,0 ± 1,0 °С в течение 20,0 ± 2,0 часов. Эту культуру смывают со скошенного агара 80 ± 2,0 мл стерильной дистиллированной воды. Весь объем образовавшейся суспензии вносят в матрацы с 200 ± 1,0 мл 2 % МПА и выращивают в течение 7 дней при температуре 30 °С. Через 7 суток из культуры готовят мазки, окрашивают по Граму и, если в поле зрения содержится 80—90 % спор, культуру смывают 50 мл стерильной дистиллированной вода. Взвесь спор прогревают на водяной бане при 65—70 °С в течение 30,0 ±1,0 мин, трижды центрифугируют при 3 тыс. оборотов в минуту в течение 10 мин, каждый раз промывая осадок стерильной дистиллированной водой до полу-

чения прозрачной надосадочной жидкости. Промытую взвесь спор прогревают вновь на водяной бане 30,0 + 1,0 мин при 65—70 °С. Полученную взвесь спор стерильно разливают в пробирки или ампулы, запаивают и хранят при температуре не выше 4 °С и используют до тех пор, пока споры образуют хороший газон и четко очерченные края зон.

6.2. Приготовление рабочей концентрации Вас cereus АТСС 11778.

Небольшое количество /0,2 мл/споровой взвеси Вас. сегеш вносят в стандартную пробирку с 5 мл стерильного физиологического раствора и хорошо перемешивают. По стандарту мутности на 5 ед полученную взвесь доводят до концентрации 5 х 10⁸ микробных тел в 1 мл. Затем 0,2, мл данной взвеси вносят в 100 мл расплавленной и охлажденной до 60 ° питательной среды. В итоге нагрузка тест-культуры в питательной среде составляет 10⁶ спор в 1 мл.

6.3. Выращивание спор Bac.micoidis 537.

Культуру пересевают на скошенный агар 12 % МПА, среда № 2, pH 7,9 ± 0,1/ и выращивают при 37 °С в течение 20 ± 2,0 часа. В мазках культуры должны быть обнаружены грамположительные палочки с закругленными концами, располагающиеся отдельно или цепочками. Затем эту культуру со скошенного агара смывают 7 ± 2,0 мл стерильной дистиллированной воды. Образовавшуюся суспензию вносят в матрацы с 2 % агаризированной средой, приготовленной на бульоне Хотгингера с содержанием 33 мг% аминного азота, pH 6,1 ±0,1 /среда №4/. Засеянные матрацы выдерживают при 37 °С в течение 7 дней, после чего готовят мазки и, если в мазках, окрашенных по Граму, имеется в поле зрения 85 ± 5,0 % спор, культуру смывают стерильной дистиллированной водой.

Полученную взвесь спор прогревают при 65—40 °С в течение 30 мин, а затем поступают также, как и при получении спор. Вас. АТСС 11778, п. 6.1.

55

Таблица 1 Тест-культуры, питательные среды, буферные растворы, рабочие концентрации стандартов антибиотиков, применяемые для определения антибиотиков в пищевых продуктах

Антибиотик Тест-микроб Ориентировочная посевная доза на 1 мл среды Пита тельные среды Буферные растворы Кол-во среды на чашку Рабочая концентрация стандарта антибиотика в мкг/мл Тетрациклины Bac.cereus АТСС 11778 1 млн спор № 2, Ха 3 Ха 2, Ха 3 10мл 0,05 Стрептомицин Вас. mycoidis 537 20 млн спор №2,№4 Ха 4, Хаб 10 мл 2,0 Пенициллин Sur. lutea АТСС 9341 15 млн микробных тел №7 Ха 4, Ха 5 10 мл 0,05 Гризин Вас. cubtilis АТСС 6633 5 млн спор №5, №6, Ха 8, Ха 1, Ха 7 10 0,4 Цинкбацитра- цин М. flavus АТСС 10240 10 млн микробных тел Хаб 10 0,1

6.4. Приготовление рабочей концентрации Вас. mycoidis 537

В стандартную пробирку с 5 мл стерильной дистиллированной воды добавляют 0,1—0,2 мл взвеси спор Вас. mycoidis 537 и по стандарту мутности на 10 ед разводят споры до 1 млрд микробных тел в 1 мл. Взвесь спор вносят в охлажденную до 60 °С питательную среду из расчета 20 млн спор в 1 мл среды, т. е. 2 мл 1 млрд взвеси в 100 мл среды.

6.5. Выращивание S. lutea АТСС 9341 и приготовление микробной взвеси

Культуру выращивают в течение 20 ± 2,0 час. в пробирках со средой № 7, после чего её смывают стерильным физиологическим раствором и хранят при 4 °С, Микробную взвесь суточной культуры разводят до 1 млрд микробных тел также, как и Вас. mycoidis 537. Готовую взвесь засевают в расплавленную и остывшую до 50 °С питательную среду № 7 из расчета 30 млн микробных тел на 1 мл среды, т. е. 3 мл 1 млрд взвеси на 100 мл среды.

56

6.6. Выращивание спор Вас. cubtilis АТСС 6633.

Культуру высевают в пробирки со скошенным агаром / 2 % МПА, pH 6,5 ± 0,1/ и выращивают при 37 °С в течение 18—20 часов. Затем эту культуру со скошенного агара смывают 7 ± 2,0 мл стерильной дистиллированной воды и засевают матрацы с 2 % агаризированной средой, приготовленной на бульоне Хоттингера с содержанием 33 мг% аминного азота, pH 7,9 ± 0,1 /среда № 5/. Выращивают при 37 °С в течение 7 суток, а затем поступают также как при получении спор Вас. cereus АТСС 11778.

6.7. Приготовление взвеси спор Вас. cubtilis АТСС 6633.

В стандартную пробирку с 5 мл стерильной дистиллированной воды добавляют небольшое количество /0,1—0,2 мл/ споровой взвеси Вас. cubtilis АТСС 6633 и хорошо перемешивают. По стандарту мутности на 5 ед полученную взвесь доводят до концентрации 5 х 10⁸ спор в 1 мл. Затем 1 мл данной взвеси вносят в 100 мл расплавленной и охлажденной до 60 °С ± 1 °С питательной среды.

6.8. Выращивание М. flavus АТСС 10240.

Культуру выращивают в пробирках со скошенным МПА с pH 6; 5 ± 0,1 / среда № 6 /. Используется суточная культура тест-микроба, выращенная на скошенном МПА pH 6,5 ±0,1 при 37 °С в течение 19 ± 1,0 час. Выращенную культуру смывают физиологическим раствором, разводят до 1 млрд микробных тел по стандарту мутности на 10 ед. Готовую взвесь засевают в расплавленную и остывшую до 50 °С питательную среду из расчета 1 мл 1 млрд взвеси на 100 мл среды.

7. ПРИГОТОВЛЕНИЕ КОНТРОЛЬНЫХ /РАБОЧИХ/ КОНЦЕНТРАЦИЙ СТАНДАРТНЫХ АНТИБИОТИКОВ.

При определении остаточных количеств антибиотиков для приготовления контрольных концентраций используют стандарты антибиотиков т. е. очищенные образцы препарата, содержащие строго определенное количество единиц действия в 1 мг.

7.1. Приготовление рабочей концентрации хлортетрациклина /ХТЦ/.

Произвольную навеску хлортетрациклина /5—15 мг/ растворяют в 0,1 н соляной кислоте в соотношении 1 :1 /1 мг антибиотика растворяют

57

в 1 мл кислоты/ и получают основной раствор. Далее по схеме № 1 на буфере № 2 готовят контрольное разведение антибиотика.

Пример: Стандарт ХТЦ содержит 930 ед/мг. Навеску в 10 ± 0,0001 мг растворяют в 10 ± 0,0001 мл 0,1 н НС1. Основной раствор содержит 930 ед/мл. Из основного раствора готовят контрольное разведение, равное 0,05 ед/мл.

Схема № 1

ш* раствора Соотношение растворов Концентрация антибиотиков ед/мл 1 1 мл основного раствора + 8,3 буфера pH 5,2 100 2 1 мл раствора № 1 + 9 мл буфера pH 5,2 10 3 0,1 мл р-ра № 2 + 9,9 мл -м- 0,1 4 5 мл раствора № 3 + 5 мл -1'- 0,05

Основной раствор хранится в холодильнике 30 суток.

7.2. Приготовление контрольной концентрации стрептомицина.

Навеску стандарта растворяют в фосфатном буфере pH 6,0 /К« 4/ в соотношении 1 : 1 /1 мг антибиотика растворяют в 1 мл буфера/. Этот раствор является основным и хранится в холодильнике до 30 дн. Из основного раствора на фосфатном буфере pH 7,9 ± 0,1 /буф. № 6/ готовят рабочую концентрацию стрептомицина, равную 2 ед/мл.

Основной раствор хранится в холодильнике 30 суток.

Схема № 2

№№ раствора Соотношение растворов Концентрация антибиотика, ед/мл 1 1 мл основного раствора + 9 мл буфера pH 7,8 ±0,10 76 2 1 мл 1 раствора + 9 мл 7,6 3 1 мл 2 раствора + 3,8 мл - - 2,0

7.3. Приготовление контрольной концентрации пенициллина.

Навеску пенициллина растворяют в фосфатном буфере pH 6,0 /буф. № 4/ в соотношении 1 : 1, т. е.1 мг антибиотика в 1 мл буфера. Этот раствор является основным и хранится в холодильнике 7 дней. Из него на том буфере готовят контрольную концентрацию пенициллина -

0,05 ед/мл.

58

Схема Ns 3

Примерная схема приготовления растворов пенициллина из стандартного активностью 1586 ед/мл

Ш& раствора Соотношение растворов Концентрация антибиотика, ед/мл 1 0,6 мл стандартного раствора + 0,4 мл буфера pH 6,0 1000 2 0,1 мл раствора + 9,9 мл буфера pH 6,0 10 3 1 мл 2 раствора + 9 мл ~и- 1 4 1 мл 3 раствора + 9 мл 0,1 5 1 мл4раствора + 1 мл 0,05

7.4. Приготовление контрольной концентрации гризина.

Для приготовления основного раствора берут произвольную навеску стандарта гризина / 5—15 иг/ и растворяют её в 0,01 н НС1 из, расчета 1 мг или 1000 ед/мг.

Основной раствор хранится в течение 30 дней. Дальнейшие разведения делают на буфере № 7 / pH 3,2/ по схеме № 4.

Схема Ns 4

раствора Соотношение растворов Концентрация антибиотика, ед/мл 1 1 мл основного раствора + 9 мл буфера 100 2 1 мл раствора № 1 + 9 мл - - 10 3 4 мл раствора №2 +6 мл 4

7.5. Приготовление контрольной концентрации бацитрацина.

Для приготовления основного раствора стандарта бацитрацина берут произвольную навеску стандарта бацитрацина /10—20мг/ и растворяют её в фосфатном буфере pH 6,0 /буфер № 4/ до получения концентрации 100 ед/мл.

Основной раствор стандарта бацитрацина можно хранить в течение 30 дней. Из основного раствора готовят /рабочее/ контрольное разведение, равное 0,2 ед/мл по схеме № 5.

Схема № 5

раствора	Соотношение растворов	Концентрация антибиотика, ед/мл
1	1 мл основного раствора + 9 мл буфера	10
2	2 мл раствора № 1 + 8 мл	2
3	1 мл раствора № 2 + 9 мл	0,2

59

8. ПОДГОТОВКА ЧАШЕК ПЕТРИ.

Колбы с агаром помещают в кипящую водяную баню. Дня определения тетрациклинов используется среда № 3, стрептомицина - №4, пенициллина Х° 7, гризина - № 8, цинкбацитрацина - Ха 6, Расплавленный агар охлаждают до определенной температуры и вносят в него необходимое количество взвеси тест-культуры: аспорогенные культуры /Sur. lutea, М. flavus/ засевают при температуре среды не выше 48 °С ± 2 °С, а споровые /Вас. cereus, Вас. cubtilis. Вас. mycoidis/ при 58°±2,0°С. Среду перемешивают круговыми движениями и разливают в чашки Петри по 10,0 ± ОД мл, установленные строго на горизонтальном столе.

После застывания сред под дно чашек подкладывают трафарет /рис. 1/ и пробочным сверлом Ха 3 /9 мм/ вырезают 6 лунок, вырезанные блоки вынимают скальпелем,

9. ХОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ.

9Д. Исследование молока, молочных продуктов, яиц.

Пробы молока и жидких молочных, продуктов по 10,0 ±0,1 мл, творога по 10,0 ± ОД г вносят в колбочки емкостью 50 мл и добавляют 10,0 ± ОД мл буферного раствора соответственно определяемому антибиотику, т. е. при определении тетрациклинов - буфер Ха 3; для стрептомицина - буфер Ха 6; пенициллина - буфер Ха 5 /см. раздел 5, Буферные растворы для экстрагирования антибиотиков/. Таким образом, получается разведение 1 :2.

Яйца, предназначенные для исследования, предварительно прогревают на водяной бане при 65,0 ± 5,0 °С в течение 10 ± ОД мин. Яйца освобождают от скорлупы, затем отвешивают по 10,0 ± 0,1 г смешанного содержимого каждого яйца в колбочки и приливают 10,0 + 0,1 мл буфера соответственно определяемому антибиотику, т. е. при определении тетрациклинов - буфер Ха 3, стрептомицина - буфер Ха 6.

Подготовленные пробы помещают в термостат для экстракции антибиотиков на 90,0 ± 1 мин. при 37 °С ± 0,1 °С, периодически встряхивая содержимое колбочек, после чего смесь прогревают на водяной бане при температуре 60,0 ± 1,0 °С в течение 20,0 ± ОД мин.

Пробы переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют при 3000 ± 100 об/мин в течение 10,0 ± ОД мин. Надосадочная жидкость является первым разведением /1 : 2/ и готова для внесения в лунки. Второе разведение /1 :4/ готовят в химических пробирках - 1,0 ±0,1 мл

надсадочной жидкости приливают к 1,0 ± 0,1 мл буфера соответственно определяемому антибиотику (без пепсина).

В подготовленные для исследований на соответствующий антибиотик чашки Петри, в три заранее отмеченные стеклографом лунки, вносят контрольное разведение стандарта, соответствующего определяемому антибиотику, по 0,05 ± 0,01 мл, а в три другие вносят такое же количество одного из разведений испытуемых растворов. Для каждого антибиотика на одну пробу необходимо 2—4 чашки Петри, т. е. на каждое раз-ведение по 1—2 чашки.

После внесения в лунки экстрактов и стандарта антибиотика с определяемой концентрацией чашки помещают в термостат на 20 ± 2 часа при температуре 29 ± 1,0 °С /при определении тетрациклинов и пенициллина/ или при 37 ± 1,0 °С /при определении стрептомицина/.

На следующий день замеряют зоны задержки роста тест-культуры и производят расчет содержания антибиотиков в исследуемых продуктах/п.п. 10.1/.

9.2. Исследование мяса и мясных продуктов.

Навески по 10,0 ±0,1 г. мышечной ткани, почки, печени, легкого и др. органов, вырезанные из средней части образца, измельчают режущим инструментом с последующим растиранием в ступке с кварцевым песком /предварительно простерилизованным/, приливая 20,0 ±0,1 мл буфера соответственно определяемому антибиотику, т. е. при определении тетрациклинов - буфер №3, цинкбацитрацина -№ 4, гризина-физиологический раствор /0,85 % NaCl/. При наличии микроразмельчи-теля тканей к измельченной ножницами пробе добавляют 20,0 ±0,1 мл буфера, тщательно перемешивают, переносят в стакан от микроразмель-чителя и гомогенизируют образец при максимальной скорости оборотов в течение 3 мин.

Экстракцию антибиотиков проводят в течение 1,5 ± 0,5 час.

При исследовании на гризин и цинкбацитрацин гомогенат прогревают на водяной бане при 65 ± 5 °С 30 мин для инактивации возможных ингибиторных веществ и лучшей десорбции антибиотика.

Центрифугируют пробы при 3000 об/мин в течение 20 ± 1 мин.

Затем поступают либо соответственно ходу определения, описанному в предыдущем п. 9.1 /когда надосадочную жидкость, являющуюся разведением 1:3, и приготовленное из неё разведение 1:6 вносят в лунки зараженной тест-микробом среде, далее по тексту п. 9.1, либо следующим образом;

61

ББК 51.23 С23

С23 Сборник методических документов, необходимых для обеспечения применения Федерального закона от 12 июня 2008 г. № 88-ФЗ «Технический регламент на молоко и молочную продукцию»,—М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009.—76 с.

ISBN 5-7508—0771—1

В сборник включены методические документы, содержащие правила и методы исследований (испытаний) и измерений, а также правила отбора образцов для проведения исследований (испытаний) и измерений, в соответствии с постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации Г. Г. Онищенко от 08.12.2008 № 67.

Настоящие «Методические указания» предназначены санитарно-эпидемиологических станций Минздрава СССР, а также ветеринарных, агрохимических, контрольно-токсикологических лабораторий Минсельхоза СССР к лабораторий других министерств и ведомств занижающихся анализом остаточных количеств пестицидов и биопрепаратов в продуктах питания, кормах и внешней среде.

«Методические указания» подготовлены Главным санитарно-эпидемиологическим управлением Министерства здравоохранения СССР, Государственной комиссией по химическим средствам борьбы с вредителями, болезнями растений и сорняками при Министерстве сельского хозяйства СССР, Всесоюзным научно-исследовательским институтом гигиены и токсикологии пестицидов (лаборатория аналитической химии пестицидов и лаборатория кибернетических исследований пестицидов в окружающей среде), Всесоюзным научно-исследовательским институтом химических средств защиты растений (сектор анализа пестицидов).

ББК 51.23

Технический редактор Г. И. Климова

Подписано в печать 16.12.09 Формат 60x88/16    Печ. л. 4,75

Т ираж 200 экз.    Заказ 100

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия чело вею 127994, Москва, Вадковский пер., д. 18, стр. 5,7

Оригинал-макет подготовлен к печати и тиражирован отделом издательского обеспечения Федерального центра гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора 117105, Москва, Варшавское ш., 19а Отделение реализации, телефакс 952-50-89

© Роспотребнадзор, 2009 © Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009

Надосадочиую жидкость в количестве 0,05 + 0,001 мл от каждого исследуемого образца вносят в 2—3 лунки на 2 параллельные чашки Петри. При определении гризина чашки ставят на 3 часа в холодильник при + 4 °С для преддиффузии.

Засеянные чашки с внесенной в лунки надосадочной жидкостью инкубируют в течение 18 ±0,5 час. при 29 ± 1 °С /определение тетра-циклинов/, либо при 37 ± 0,1 °С/ определение гризина и цинкбацитраци-на/, после чего измеряют диаметры зон задержки роста тест-культуры и производят расчет активности остаточных количеств антибиотиков в исследуемых субстратах /п.п. 10.1,10.2/.

10. УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Измеряют зоны задержки роста тест-культур и производят расчет содержания антибиотиков в исследуемых продуктах либо по таблицам, составленным В. С. Дмитриевой и С. М. Семеновым /Дмитриева В. С., Семенов С. М «Микробиологический контроль активности антибиотических препаратов», М., 1965 г./, /п. ЮЛ/ или по стандартным кривым /п. 10.2/.

10.1. Форма записи измерения зон задержки роста тест-микробов при расчете активности антибиотиков, содержащихся в виде остаточных количеств в пищевых продуктах, по таблицам Дмитриевой В. С.

/Примерный образец/

№ чашки	Диаметры зон задержки роста тесг-микробов в мм
	испытуемое разведение /1 : 3/	стандартное разведение 0,05 ед/мл /контроль/	испытуемое разведение /1 : 6/	стандартное разведение 0,05 ед/мл /контроль/
1	20	16,5	16	16
	20	16,5	16	16
	19,5	16,5	16,5	16
среднее	19,8	16,5	16,1	16
2	19	16	17,5	16,5
	19	16	17,0	16,5
	19,5	16	16,5	16,5
среднее	19,1	16	17	16,5

В среднее зон стандарта каждой чашки вносят поправку по постоянной зоне таблиц, которая равна 17 мм, что соответствует контрольной концентрации стандарта 0,05 ед/мл, а затем поправку вносят в величину зон испытуемого препарата.

62

Содержание

Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей

среды для определения микроколичеств пестицидов...........................4

Методические указания по определению хлорорганических пестицидов в воде, продуктах питания, кормах и табачных

изделиях методом хроматографии в тонком слое................................29

Методические указания по определению остаточных количеств

антибиотиков в продуктах животноводства.........................................46

Методика определения афлатоксинов в пищевых продуктах с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии..............69

3

Утверждаю Заместитель Главного государственного санитарного врача СССР

А. И. ЗАЙЧЕНКО 29 июня 1984 г, № 3049—84

Методические указания по определению остаточных количеств антибиотиков в продуктах животноводства

В целях дальнейшей интенсификации животноводства и птицеводства, повышения производства мяса и других продуктов животного происхождения в сельском хозяйстве нашей страны применяются антибиотики для стимуляции роста, повышения эффективности откорма скота и птицы, а также в качестве лечебно-профилактических средств. Среди них препараты, содержащие тетрациклин, пенициллин, стрептомицин, немедицинские антибиотики гризин, цинкбацитрацин и прочие.

Условия применения антибиотиков для выращивания, откорма и лечения сельскохозяйственных животных и птицы регламентированы Инструкцией, утвержденной МСХ СССР в 1980 г. и Методическими указаниями по применению антибиотиков в ветеринарии (М., 1973 г.), соблюдение которых должно гарантировать безопасность для здоровья населения продуктов, полученных от леченных или стимулированных антибиотиками животных. Однако в силу различных причин в пищевых продуктах, полученных от этих животных в ряде случаев содержатся остатки антибиотиков.

Антибиотики тетрациклинового ряда могут попадать в продукты питания в результате неправильного использования их в качестве и лечебных средств. Наличие в молоке стрептомицина, пенициллина и др. обусловлено чаще всего использованием для лечения маститов коров препаратов длительного действия на масляной основе. Присутствие немедицинских антибиотиков (гризина и пр.) отмечено при включении в корма в экспериментальных условиях в превышенных количествах этих препаратов. Материалы научных исследований свидетельствуют о наличии остаточных количеств антибиотиков в мясных, молочных продуктах, яйцах. Вместе с тем, длительное использование в пищу продуктов, содержащих остаточные количества антибиотиков, может вызвать неблагоприятные для здоровья человека последствия - аллергические реакции, дисбактериоз, образование и передачу резистентных форм мик-

46

робов. Экспериментально установленные при этом уровни неблагоприятного действия антибиотиков на организм позволили обосновать величины максимально-допустимого суточного поступления их в организм человека с продуктами питания и сделать вывод, что при санитарном контроле продуктов питания остаточные количества антибиотиков в них не должны допускаться при использовании предлагаемых ниже утверждённых методов исследования в пределах их чувствительности /для хлортетрациклина пенициллина - 0,01, стрептомицина - 0,5, гризи-на и цинкбацитрина - 0,1 и 0,02 ЕД на г/мл/продукта).

Повышение эффективности санитарного надзора по предупреждению попадания в продукты питания антибиотиков должно осуществляться путем периодического отбора на мясокомбинатах, молочных заводах, в животноводческих и птицеводческих хозяйствах, торговой сети проб молока, молочных продуктов, мяса, субпродуктов, яиц для определения в них антибиотиков. Необходимо выявлять хозяйства, поставляющие пищевые продукты, загрязненные антибиотиками, выявлять причины попадания в них антибиотиков и принимать меры для устранения этих нарушений, не допускать снабжения пищевыми продуктами, содержащими остаточные количества антибиотиков, детских учреждений, больниц и т. л.

Реализация молока с наличием остаточных количеств антибиотиков решается в каждом конкретном случае представителями Государственного санитарного и ветеринарного надзора.

Молоко, содержащее остаточные количества любых антибиотиков, может использоваться в качестве дополнительного кормового средства при откорме молодняка сельскохозяйственных животных.

Творог, сметану, яйца содержащие остаточные количества антибиотиков тетрациклинового ряда, пенициллина, следует направлять на изготовление хлебобулочных и кондитерских изделий с расчетом, чтобы соотношение «загрязненных продуктов» с другими компонентами изделий было не меньшим, чем 1 :4 /при содержании остаточных количеств антибиотиков до 0,05 ЕД/г/, 1 :10 и 1 : 100 - при содержании остаточных количеств антибиотиков до 0,1 ЕД/г и до 1,0 ЕД/г и более, соответственно.

Мясо и субпродукты, содержащие остаточные количества антибиотиков, не следует в необработанном виде реализовывать населению. Такое мясо должно направляться на изготовление мясных, мясорастительных консервов, за исключением консервов для детского питания, концентратов I и II блюд, вареных и варено-копченых колбас при условии

47

обязательной подсортировки к мясу или компонентам блюд, не содержащих остаточных количеств антибиотиков. Средне-расчетная кратность разведения «загрязненного» антибиотиками мяса незагрязненным должна составлять 17 /по данным Института питания АМН СССР/. В каждом конкретном случае вопрос о реализации и использовании мяса с наличием остаточных количеств антибиотиков решается представителями Государственного санитарного и ветеринарного надзора с условием, что при подсортировке кратность соотношения «загрязненных» и незагрязненных продуктов должна зависеть от выявленной концентрации антибиотика, с тем, чтобы в конечном итоге содержание остаточного количества антибиотика было ниже уровня чувствительности утвержденных методов исследования.

Например, в образцах мышечной ткани от говяжьей туши № «    »,

поступившей на забой из с-х «... -окий», выявлено содержание хлортет-рациклина на уровне 0,2 ЕД/г. Следовательно, чтобы содержание антибиотика в продукте снизилось до менее 0,01 ЕД/г, мясо от этой туши должно быть направлено на приготовление колбас при условии введения в фарш в размере не более 5 % к общей массе продукта. В совхоз должно быть направлено предписание о нарушении инструкций по применению антибиотиков в ветеринарии или при откорме животных, а к руководителю хозяйства приняты административные меры.

При реализации продуктов питания, содержащих остаточные количества стрептомицина, гризина, цинкбацитрацина, должен использоваться такой же подход подсортировки к незагрязненному антибиотиками сырью с учетом выявленной концентрации антибиотика и соответствующей кратностью разведения.

Обеспечить полную безопасность продуктов, содержащих остаточные количества антибиотиков, для потребителей может только четкая организация проведения гигиенических мероприятий, строгий контроль за применением антибиотиков в животноводстве и ветеринарии и выявление их в продуктах питания животного происхождения с помощью чувствительных методов.

6 целях систематического контроля в стране за загрязнением продуктов животноводства антибиотиками предлагаются данные «Методические указания по определению остаточных количеств антибиотиков в продуктах животноводства». Наиболее широкое применение как в научных исследованиях, так и в практических учреждениях, нашли микробиологические методы, позволяющие определять минимальные концентрации антибиотиков в исследуемом материале. Они основаны на непо-

48

средственном биологическом действии антибиотиков на чувствительные штаммы микроорганизмов и поэтому наиболее специфичны и объективны. Ниже рекомендуются методы определения некоторых антибиотиков:

а)    тетрациклиновой группы - в молоке, молочных продуктах, яйцах, мясе, мясных продуктах, в т. ч. мясе и субпродуктах птицы;

б)    стрептомицина - в молоке и молочных продуктах, яйцах;

в)    пенициллина - в молоке и молочных продуктах;

г)    гризина - в мясе;

д)    цинкбацитрацина - в мясе.

Содержание антибиотиков выявляют микробиологическим методом диффузии в агар по величине торможения роста следующих тест-культур, внесенных в питательные среды:

-для тетрациклиновых антибиотиков - Вас. cereus АТСС 11778 /чувствительность-0,01 ЕД/г/мл/;

-    для стрепомицина - Вас. micoidis 537 /чувст. 0,5 ЕД/г/мл/;

-для пиницилина-5. lutea АТСС 9341 /чувст. 0,01 ЕД/г/мл/;

-    для гризина - Вас. cubtilis АТСС 6633/чувст. 0,5 ЕД/г/мл/;

-    для цинкбацитрацина - М. flavus АТСС 10240 /чувст. 0,02 ЕД/г/мл/.

Молоко рекомендуется исследовать на присутствие остаточных количеств антибиотиков в том случае, когда при предварительном исследовании по ГОСТ 23454-79 в нем обнаружены ингибирующие вещества и исключено наличие химических веществ.

ОТБОР ПРОБ, САНИТАРНЫЙ КОНТРОЛЬ И ОТЧЕТНОСТЬ

Отбор проб молока и молочных продуктов производится по ГОСТ 13928-68 и 9225-68, но не более 50 мл каждой пробы; мяса и мясных продуктов по ГОСТ 7269-79, но не более 50 гр. каждой пробы; яйца отбирают в пределах 0,5—1 % /в зависимости от объема партии/.

Санитарный контроль за содержанием антибиотиков в молочных, мясных продуктах, яйцах следует проводить не реже 1 раза в квартал. Количество проб для анализа и перечень антибиотиков определяют в зависимости от состояния вопроса в каждой местности. Органы ветнадзора должны информировать санитарно-эпидемиологическую службу о применяемых в данном районе, области в животноводческих хозяйствах антибиотиках в качестве кормовых или лечебных препаратов.

В случае обнаружения антибиотиков в пищевых продуктах необходимо применять административные меры к руководителям хозяйств за нарушение Инструкций по применению антибиотиков в ветеринарии и

49

при, выращивании скота. Врачам по гигиене питания, специалистам ведомственной санитарной службы, ветнадзора следует проводить разъяснительную работу о недопустимости загрязнения пищевых продуктов остаточными количествами антибиотиков.

Материалы по результатам исследований продуктов животноводства на загрязнение антибиотиками в целом по району, области, республике должны ежегодно обобщаться и анализироваться в целях принятие конкретных профилактических мер.

1. АППАРАТУРА

1.    Автоклав /стерилизатор паровой/, ГОСТ 19569-74.

2.    Бумага масштабно-координатная марки ПЛН ГОСТ 334-73 / полулогарифмическая сетка для расчета активности растворов антибиотиков/.

3.    Весы лабораторные равноплечие ВЛР-200 г ТУ 25.06.1131—75.

4.    Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания 1х10'³- 0,2 кг по ГОСТу 24104-80.

5.    Водяная баня лабораторная /Аппарат для инактивирования сыворотки крови МРТУ 42 Л091—63/.

6.    Горелка газовая или спиртовая по ГОСТу 10090—74.

7.    Ионометр универсальный /pH-метр/ ЭВ-74.

8.    Колбы стеклянные конические вместимостью 50, 100, 200, 1000 см³ по ГОСТу 10394—72.

9.    Линейка по ГОСТу 17435—72.

10.    Матрацы стеклянные лабораторные вместимостью 1000 см³.

11.    Мерные колбы и стаканы стеклянные лабораторные на 50, 100, 500 и 1000 ом³ по ГОСТу 23932—79.

12.    Микроскоп МБИ или МБР по ГОСТу 8284—78.

13.    Микроразмельчитель тканей типа РТ-2 МРТУ 04.1.1505—63 /или фарфоровая ступка с пестиком по ГОСТу 9147—73 и кварцевый песок/.

14.    Ножницы по ГОСТу 21239—77, скальпель ГОСТ 21240-77, пинцеты по ГОСТу 31241—77.

15.    Палочки стеклянные

16.    Петля бактериологическая

17.    Пробочное сверло 9 мм

18.    Пипетки измерительные градуированные вместимостью 1,0, 2,0, 5,0, 10,0 см³ по ГОСТу 20292—74.

19.    Пробирки стеклянные химические 16 мм по ГОСТу 23932—79.

20.    Пробирки центрифужные емкостью 10 см³.

50

21.    Стеклянный стандарт мутности для оптической стандартизации бактерийных взвесей.

22.    Сушильный шкаф круглый по ТУ 64-1-1411.

23.    Термостаты электрические с водяной рубашкой по МРТУ 421878—60.

24.    Трафарет для вырезания лунок.

25.    Уровень для установления горизонтальной поверхности.

26.    Холодильник бытовой по ГОСТу 16317—70.

27.    Центрифуга лабораторная стационарная ЦЛС-31М по ГОСТу 51107—71; центрифуга настольная ЦЛН-2 МРТУ 421742—63.

28.    Цилиндры мерные на 50,100,250,1000 см³ по ГОСТу 1770—74.

29.    Чашки биологические стеклянные тип Петри по ГОСТу 23932—79, а также чашки из полимерных материалов.

30.    Штативы для пробирок на 20—40 гнезд по ТУ 64-1-2669—78.

2. КОМПОНЕНТЫ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

1.    Агар-агар микроскопический по ГОСТу 17206—71

2.    Мясо-пептонный бульон по ГОСТу 20730—75

3.    Дрожжевой экстракт /экстракт кормовых дрожжей, сухой производство МНИИВС/

4.    Мясная вода по ГОСТу 20729—75

5.    Панкреатический гидролизат казеина

6.    Пепсин медицинский

7.    Пептон сухой ферментативный ГОСТ 13805-76

8.    Бульоны Хоттингера с содержанием аминного азота 33 мг%, 100 мг%, 130—140 мг% по ГОСТу 10444.1—75

3. РЕАКТИВЫ

1.    Глюкоза кристаллическая ХЧ по ГОСТу 975—76

2.    Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72

3.    Натрия гидрат окиси /натр едкий/ ГОСТ 4328-66,10 р-р

4.    Натрия лимоннокислый, х.ч. ГОСТ 22280-76

5.    Калия фосфат однозамещенный, х.ч. ГОСТ 4198-65

6.    Калия фосфат двухзамещенный, х.ч. ГОСТ 2493-65

7.    Натрия фосфат двухзамещенный, х.ч. ГОСТ 11773-66

8.    Спирт этиловый, ректификованный по ГОСТ 5262-67

9.    Кислота соляная, х.ч. уд. вес 1.18—1.19

10.    Натрий хлористый, х.ч. по ГОСТу 4233—77

11.    Стандарты антибиотиков производства ГИСК им. ЛА.Тарасевича

51