МУ 3.3.1.1113-02
Основные требования к вакцинным штаммам чумного микроба

Основные требования к вакцинным штаммам чумного микроба

Методические указания МУ 3.3.1.1113 —02

ББК 52.6 075

075 Основные требования к вакцинным штаммам чумного микроба: Методические указания.—М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России. 2002.— 63 с.

1.    Разработаны: Государственным на\чно-исслсдовательским инеппуюм стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича (Т. И. Анисимова. Л. В. Саяпина. Г. М. Сергеева). Российским научно-исследовательским противочумным институтом «Микроб» (И. В. Исупов. Р. А. Белобородов. Л .В. Самойлова. А Л. Анисимов, М. Ю. Ледванов. Г. П. Шведун. С. Ю. Задумина. А. Ф. Касьян. А. Л. Кравцов), Научно-исследовательским институтом микробиологии министерства обороны РФ (И. В. Маракулин. А. В. Ежов. Е. М. Дармова).

2.    Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Минздраве России (протокол № 12 от 14.02.02).

3.    Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г. Г. Онищенко 2 марта 2002 г.

4.    Введены взамен методических указаний «Основные критерии отбора вакцинных штаммов чумного микроба», утв. Минздравом СССР 08.08.74.

БНК 52.6

Редакторы Кожока II. В.. Максакова Е. И.

Технические редакторы Климова Г. И.. Григорьев А. А.

Подписано в печать 06.08.02 Формат 60x88 16    Печ.    л.    4.0

Тираж 3000 эю.    'Заказ    44

Министерство здравоохранения Российской Федерации 101431. Москва. Рахмановский пер., д. 3

Оригинал-макет подготовлен к печати и тиражирован Издательским отделом Федерального центра госсанэпиднадзора Минздрава России 125167. Москва, проезд Аэропорта. 11. Отделение реализации, тел. 198-61-01

© Минздрав России, 2002 ■© Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России, 2002

лых мышей не должен реверсировать в вирулентную форму, способную в организме восприимчивого животного вызывать изменения, свойственные чумной инфекции.

8. Определение реактогенности штамма для морских свинок (прижизненные наблюдения) при подкожном способе введения

Методика определения реактогенности вакцинного штамма для морских свинок приведена в прилож. 2.

8.1.    Высокоиммуногенный вакцинный штамм чумного микроба клинически должен вызывать допустимые местную и общую реакции. Интенсивность и продолжительность реактивных изменений у морских свинок зависит от дозы введенных вакцинных микробов и степени остаточной вирулентности изучаемого штамма. Малая доза (10* м. к.) вызывает у морских свинок незначительное повышение температуры тела и снижение массы. В течение 7—10 сут. в месте введения могут пальпироваться ограниченные очаги уплотнения мягких тканей, регионарные лимфатические узлы могут быть увеличены, но должны быть подвижными. т. с. нс спаянными с окружающими мягкими тканями.

8.2.    При испытании массивных доз (2 • 10⁹ и 1,5 • 10^ю м. к.) у отдельных животных возможно повышение температу ры тела на 1.5—2 °С. Среднее повышение температуры тела хля группы морских свинок (30—40 голов). которым было введено 10², 10,2 10⁹ и 1,5 ■ 10^1Ом. к. исследуемого штамма нс должно превышать 1 °С. К 7—12 дню после введения вакцинного штамма температура тела морских свинок должна снизиться до нормальных исходных значений.

8.3.    В ответ на введение 2 10⁹ и 1.5 Ю¹⁰ м. к. вакцинного штамма чумного микроба в первые 5 сут может снижаться масса тела морских свинок. К 6—7 суткам после введения испыту емой культуры снижение массы животных нс должно превышать 1/5 се первоначальной величины.

У половины опытных животных допустимо развитие обширных отеков в месте введения культуры, может наблюдаться увеличение, уплотнение и спаянность регионарных лимфатических узлов с мягкими тканями.

9. Определение безвредности исследуемых вакцинных штаммов для морских свинок по морфологическим показателям при подкожном способе введения

Безвредность испытуемых штаммов по морфологическим показателям определяется в экспериментах на морских свинках при подкожном способе введения.

Степень остаточной вирулентности испытуемого штамма характеризуют специфические дзя вакцинального процесса морфологические (макроскопические и гистологические) изменения, возникающие у морских свинок в тканях в месте введения культуры, в регионарных, контрлатеразь-ных и отдаленных лимфатических узлах, а также во внутренних органах (печени, селезенке, почках). Методик! вскрытия и исследования морских свинок приведена в прилож 2.

9.1.    Общие критерии при оценке безвредности испытуемых штаммов.

9.1.1.    Испытуемый штамм не может быть признан вакцинным, если он в соответствующих дозах при всех равных условиях вызывает у морских свинок чаще более выраженные или менее доброкачественные из-менния (см. ниже), чем контрольный штамм EV.

9.1.2.    Вакцинный штамм, введенный морским свинкам в дозах 1 10 и 1 10 ⁹ м. к., вызывает максимальное развитие островоспалительных изменений примерно к 7-м суткам, их стихание с преобладанием продуктивного компонента к 10—12 суткам и полной резорбцией или заживлением без грубых рубцовых изменений к концу срока наблюдения (30—15 сутки);

9.1.3.    При ввсдсниии кулыуры в мазой дозе (10“ м. к.) сроки нарастания и стихания острых признаков могу т затягиваться, соответственно до 14 и 21 су ток.

9.1.4.    Обнаруженные при малом и среднем увеличениях микроскопа типичные скопления чумных микробов в воспалительных очагах, вне их и внутри сосудов, даже очень мелкие и единичные, считаются абсолютно недопустимым признаком.

9.2. При введении морским свинкам культуры безвредного вакцинного штамма допустимы перечисленные ниже изменения.

9.2.1. Место введения. Макроскопическая картина. При введении культуры вакцинного штамма в дозах 10\ 10 и 2 10⁹м. к. допустимо: незначительное или умеренное диффузное или очаговое полнокровие тканей в остром периоде процесса (до 10—12 суток): ограниченные участки полнокровия крупных вен. немногочисленные кровоизлияния, полностью разрешающиеся к 30-м суткам.

При введении культуры в дозе 2 10⁹ м. к. преимущественно в остром периоде (7—10-е сутки) нс более чем в половине случаев также

допустимы: участки воспалительного уплотнения (инфильтраты) размерами до 1.0 1.5 см. в отдельных случаях более крупные; серозное воспалительное пропитывание («отек») тканей бедра и паховой области на месте введения культуры, но без распространения отека на прилежащие области (брюшная и грудная стенка, контрлатсральная паховая область) очаги гнойной инфильтрации и кровоизлияния диаметром до 0.5 см. В единичных случаях (не более 3) допустимы: крупные кровоизлияния, очаги некроза до 0.5—0.7 см в диаметре; осумкованные и инкапсулированные абсцессы с гнойной полостью до 0.5 см в диаметре; язвы и свищи с гнойным отделяемым.

Все вышеуказанные изменения в основном должны разрешаться к 30-м суткам. Допустимы незначительные остаточные явления (фиброз, небольшие рубцовые изменения) у единичных животных через 45 сут.

При введении испытуемой культуры в дозе 10 м. к. у отдельных (3—5) животных допустимы: участки воспалительного уплотнения (инфильтраты) размерами нс более 0.5—0,7 см: умеренный воспалительный «отек» бедра и паховой области с той же стороны; очаги ограниченной гнойной инфильтрации без расплавления тканей и кровоизлияния до 0.5 см в диаметре у единичных животных (1—3).

При введении испытуемой культуры в дозе 1()^: м. к. допустимы только изменения, возможность возникновения которых описана в начале параграфа. Следует обращать внимание на возможность возникновения осумкованных и инкапсулированных абсцессов в тканях в месте введения в поздние сроки (до 45 сут). такие изменения характерны для недостаточно аттенуированных штаммов, и возникновение их не допустимо при введении исследуемой культуры в дозе 10" м. к.

Гистологические изменения. При введении культуры исследуемого штамма во всех указанных дозах допустимы: воспалительные инфильтраты из лейкоцитов (ПМН-лейкоцитов); накопление истинных эозино-филов здесь, а также в других воспалительных очагах не является недопустимым признаком; участки грануляционной ткани без гнойной инфильтрации и расплавления, в т. ч. рубцующейся у половины всех взятых в опыт животных. При введении культу ры исследуемого штамма в дозе 10“ м. к. указанные изменения могу т наблюдаться у единичных животных (2—3).

Кроме того, при введении ку льтуры исследуемого штамма в дозах 1 • 10 —2 • 10⁹ м. к. нс более чем у половины опытных животных допустимы: инфильтраты со значительным участием ПМН-лейкоцитов: умеренно выраженное распространенное серозное, ссрозно-

геморрагическое и гнойно-геморрагическое пропитывание тканей; очаги некроза и гнойного расплавления или инкапсулирующиеся абсцессы, в т. ч. с признаками разрешения в отдельных случаях (не более, чем у 3 — 5 животных): гистологические признаки наличия свищного хода или язвы, в том числе в стадии заживления могут наблюдаться у единичных животных (1 —3): при введении культу ры исследуемого штамма в дозе 10 м. к. допустимо возникновение изменений, указанных выше.

9.2.2. Регионарные лимфатические узлы (паховые и подвздошные). Макроскопическая картина.

При введении культуры испытуемого штамма во всех указанных дозах допустимо: - незначительное или умеренное (до 0.5 см в диаметре) увеличение узлов, с гиперемией и уплотнением преимущественно в остром периоде, значительное (более 0.5 см) увеличение лимфатических узлов воспалительного характера с уплотнением, гиперемией, вовлечением окружающей клетчатки (периаденит) с умеренным воспалительным «отеком», без значительной геморрагической и гнойной инфильтрации. расплавления и некрозов - не более чем у половины опытных животных преимущественно в остром периоде процесса.

Гистологичсскнс изменения. При введении культуры исследуемого штамма во всех указанных дозах допустимы: острый серозный (негнойный) лимфаденит со слабо выраженным периаденитом без некротических изменений; подострый лимфаденит с участками грануляционной ткани, чисто продуктивными изменениями, частичным фиброзом, изредка с небольшими рассасывающимися гранулемами без очагов некроза и нагноения в половине случаев при введении культуры в дозах 2 10⁹ и 1 10' м. к. и. в отдельных случаях (3—5). при дозе 10" м. к.

Кроме того, при введении культу ры в дозе 2 10⁹ м. к. и иногда 10 м. к. допустимы острый очаговый серозно-гнойный и гнойный лимфаденит без значительных геморрагических проявлений, некрозов и гнойного расплавления у 30 % опытных животных: острый или подострый гнойный лимфаденит с небольшими единичными в срезе (1—3) очагами некроза, перифокальной реакцией. <|юрмированисм гранулем, в

т. ч. с «пссвдоабсцессами»¹. в отдельных случаях (3—5); при введении в

дозе в 10" м. к. очаговый серозный лимфаденит с единичными в срезе чисто продуктивными гранулемами в единичных случаях (1—2).

9.2.3.    Контрлатеральные и отдаленные лимфатические узлы. Макроскопическая картина. При введении культуры во всех указанных дозах допустимо: умеренное или незначительное увеличение лимфатических узлов без признаков острых воспалительных изменений. Кроме того, при введении культуры в дозе 2 10⁹ м. к. возможно в отдельных (3—5) случаях уплотнение лимфатических узлов с проявлением умеренной гиперемии кожных покровов.

Гистологические изменения. При введении ку льтуры во всех указанных дозах допустимы: гиперпластические изменения лимфоидных элементов разной степени выраженности: умеренно или незначительно выраженный очаговый серозный лимфаденит, небольшие участки продуктивных изменений и фиброза стромы узлов, при введении ку льту ры в дозе 2 • 10⁹ м. к. у половины опытных животных при иноку ляции культуры вакцинного штамма в других рекомендованных дозах, подобные изменения могут наблюдаться у 30 % животных.

9.2.4.    Селезенка. Макроскопическая картина. При введении исследуемых ку льту р во всех у казанных дозах допустимы: небольшое или умеренное (в 1.5—2 раза) увеличение размеров селезенки с умеренным полнокровием при отсу тствии значительного соскоба на разрезе (чрезмерно сочные отпечатки при посевах) в половине, при введении ку льтуры в дох 2 • 10⁹м. к. 30% животных: признаки гиперплазии фолликулов (выбу хание под капсу лой).

Кроме того, при введении культуры в дох 2 10⁹ м. к. допу стимы: у отдельных морских свинок (нс более 6) возможно развитие единичных или немногочисленных (нс более 10 в органе) преимущественно суб-мнллиарных или отдельных миллиарных у зелков серовато-белого, иногда ро юватого цвета без признаков некротизации. абсцедирования, без слияния в более кру пные очаги, без инкапсу ляции и гру бого рубцевания. полностью разрешающихся к 30-м суткам: при введении исследу емой культу ры в дозах 10 и 10^: м. к. возможно у отдельных животных (1—2) развитие единичных узелков (1—3) без признаков некротизации. без абсцедирования слияния в более крупные очаги, без инкапсу ляции и грубого ру бцевания, полностью разрешающихся к 3-м су ткам.

Гистологические изменения. При введении всех у казанных доз допустимы: гиперплазия клеток белой пу льпы (фолликулов и периартериальных муфт), плазмоклеточная реакция разной степени выраженности: полнокровие сину сов селезенки; острый серозный (нсгнойный) очаго-

вый или диффузный спленит. в поздние сроки стихающий, лимфогисти-оцитарные инфильтраты в строме, небольшие участки грануляционной ткани чисто продуктивного характера, остаточные явления в виде небольших участков незначительного фиброза в строме и капсуле органа при введении культур в дозах 2 К)⁹ и 10 м. к. - у 50 % животных, при введении в дозе 10“ м. к. - у отдельных (3—5) животных.

Кроме того, при введении исследуемой культуры в дозе 2 10⁹ м. к. допустимы: гранулемы единичные (1—2) в срезе, преимущественно микроскопические, эпителиоидноклсточные без очагов некроза и явного абсцедирования, без грубого рубцевания по периферии, иногда с небольшим накоплением полиморфноядерных лейкоцитов («пссвдоаб-сцссс») при процессах резорбции нс более чем у 5—6 опытных животных; при введении исследуемой культу ры в дозе 10 м. к. допустимы у единичных животных гранулемы (1—2) продуктивного характера, единичные в срезе, мелкие до субмилиарных.

9.2.5. Печень. Макроскопическая картина. При введении исследуемой культуры во всех указанных дозах допустимы: признаки умеренных диффузных дистрофических изменений органа (некоторое увеличение размеров, набухание, сероватый оттенок окраски): венозное полнокровие. иногда неравномерное: у единичных (1—2) опытных животных возможно развитие до 3 узелков в органе, преимущественно точечных без признаков некроза, нагноения и грубого рубцевания чисто продуктивного характера: беловатые или сероватые точечные и штрихообраз-ные очаги, просвечивающие под капсулой, единичные (1—3) в органе у 1—3 животных.

Кроме того, при введении исследуемой культуры в дозе 2 10⁹ м. к. допустимы: у отдельных животных (нс более 6) немногочисленные (до 10) преимущественно точечные и субмилнарныс. редко милиарные узелки без признаков некротизации. без абсцедирования, инкапсуляции и грубых рубцовых изменений ткани печени в поздние сроки, иногда с небольшими втяжениями поверхности, при введении исследуемой культуры в дозе 10 м. к. у единичных (1—3) животных возможно развитие точечных и сублимационных узелков без признаков некротизации. без ассцсдировання. без инкапсуляции и грубых рубцовых изменений ткани органа.

Гистологические изменения. При введении исследуемой культуры во всех указанных дозах у 50 % животных допустимы: умеренно выраженная зернистая, зернисто-вакуольная дистрофия, часто неравномерная: небольшие у частки умеренной жировой дистрофии; мелкие, в прс-

делах 10—15 печеночных клеток лимфогистиоцитарные инфильтраты в строме, единичные (2—3) в срезе.

При введении испытуемой культуры в дозе 2 10⁹ м. к. допустимы: гранулемы эпнтслиоидно-клсточныс без фокусов некроза, абсцедирования. инкапсуляции, выраженных рубцовых изменений, преимущественно микроскопических и субмилиарных размеров, изредка до милиарных. с признаками резорбции, не более чем у 6 животных: единичные (1—3) в срезах микроскопические очаги некроза и некробиоза в пределах К)—15 печеночных клеток при наличии хорошо выраженной продуктивной клеточной реакции без склонности к дальнейшей нскротиза-ции и абсцедирования у единичных животных (1—2); при введении исследуемой культуры в дозе 10 м. к. возможны единичные в срезе (1—2) гранулемы чисто продуктивного характера у единичных (1—2) животных: при введении исследуемой культуры в дозе 10" м. к. допустимы единичные (1—2) микроскопические продуктивные гранулемы единичные (1—2) в отдельных срезах у единичных (1—2) животных.

9.2.6. Легкие. Макроскопическая картина. При введении исследуемой культуры во всех дозах допустимы: участки неравномерного полнокровия легких:    участки    пониженной    воздушности    серовато-

синюшного цвета.

При введении исследуемой культу ры в дозе 2 10⁹ м. к. допустимы: милиарные и субмилиарныс очаги уплотнения легочной ткани серовато-розоватого. иногда синюшно-красного цвета, немногочисленные (до К) в обоих легких) в половине случаев при отсутствии бактериологического выделения возбудителя чумы из ткани легких: при введении исследуемой культуры в дозах 10 и 10²м. к. возможно развитие единичных (1—3) милиарных и субмилиарных очагов уплотнения легочной ткани у единичных (1—3) опытных животных при отсутствии позитивных бактериологических данных.

Гистологические изменения. При введении всех указанных доз допустимы: признаки умеренной очаговой интсрстициатьной инфильтрации (преимущественно гиперпластического характера) перегородок между альвеолами лимфоидными и гистиоцнтарными клеточными элементами при отсутствии сужения просветов альвеол, кровоизлияний, значительной примеси в инфильтрате ПМН-лейкоцитов, гиперплазии бронхопу льмонарных лимфатических узелков, крупных лимфогистио-цитарных инфильтратов вокруг сосудов и бронхов. При введении испытуемой культуры в дозе 2 10⁹ м. к. допустимы: вышеописанные изменения преимущественно гиперпластического характера типа интсрсти-

циальной реакции распространенного или диффузного характера с участием бронхопульмональных лимфатических узелков, наличием лимфоги-стиоцитарных инфильтратов умеренных размеров вокруг сосудов и бронхов.

9.2.7. В других органах (сердце, почки, надпочечники) допустимы гиперпластические и умеренные дистрофические изменения в пределах, наблюдаемых при обычном вакцинном процессе после введения культуры эталонного штамма EV.

Все вышеотмеченные изменения, допустимые при развитии вакцинальной реакции, могу т колебаться в известных пределах у отдельных морских свинок по выраженности, срокам развития и полноте резорбции. Оценка изменений в месте введения культу ры и в лимфатических узлах в смысле их допустимости как вакцинальных не представляет трудности. В противоположность этому дать правильную оценку изменениям во вну тренних органах, укладывающимся в пределы вакцинальных реакций, очень сложно. Возникают затруднения даже при подсчете числа узелков в печени и селезенке. Иногда количество узелков может быть решающим в оценке испытуемых культур. Наличие 12—15 узелков в печени и селезенке у 1—2 морских свинок, которым испыту емая культу ра была введена в дох 2 10⁹ м. к., при отсутствии других недопустимых изменений не может быть абсолютным показателем для ее отклонения.

9.3. Отсутствие или слабая выраженность дистрофических процессов в паренхиматозных органах, отсутствие роста испытуемого штамма чумного микроба в посевах из этих органов наряду с другими позитивными характеристиками штамма указывают на безвредность последнего. несмотря на несколько большую узелковую реакцию. В то же время единичные узелки (2—5). заканчивающиеся формированием абсцессов и рубцов, приводящие к нарушению структу ры органа, могут быть показателем высокой степени остаточной виру лентности изу чаемой культуры. и на основании этого штамм может быть поставлен под сомнение как соответству ющий вакцинному.

Наиболее важное значение имеет качество узелков: их характер, развитие и исходы. Узелки должны развиваться в острой, нестерильной фах поствакцинальной реакции, иметь проду ктивный характер. В период резорбции приобретать строение псевдоабсцессов и рассасываться к 30—45 м суткам наблюдения, когда насту паст полное восстановление структуры органов.

Формирование узелков в печени и селезенке может сочетаться с выраженными местными изменениями. Опыт показывает, что это наблюдается чаще. Однако в ряде случаев узелки обнаруживаются у морских свинок, у которых в месте введения культуры и регионарных лимфатических узлах изменения минимальные. Образование очагов некробиоза в печени, по-видимому, обусловлено токсигснными свойствами. которые сохраняют вакцинные штаммы чумного микроба и при введении в максимальной дозе эти свойства микробов иногда проявляются.

9.4. Недопустимо при подкожном введении даже при максимальной дозе (2 10 ’ м. к.) испытуемого вакцинного микроба развитие в месте введения обширных кровоизлияний в подкожной клетчатке с выраженным отеком, гнойным расплавлением или некрозом тканей: в регионарных лимфатических узлах - диффузного гнойного аденита и периаденита с видимыми участками некроза; в легких - сливных очагов интерстициальной пневмонии или микроскопических очагов серозной: серозно-геморрагической и катаральной пневмонии с выделением из легких испыту емой культуры: в печени и селезенке - множественных узелков и очагов некроза, абсцессов, обширных кровоизлияний, а в поздние сроки - рубцовых изменений.

Все вышеизложенное позволяет считать, что изучение в динамике мор<|юлогичсских изменений в тканях и органах морских свинок, которым была введена испыту емая культура в максимальной дозе, даст возможность подойти к решению очень важных вопросов: о степени остаточной вирулентности и реактогенности культу ры, полноценности взятых в опыт животных. Кроме того, при введении ку льтуры вакцинного штамма в минимальной дозе может выявиться неоднородность клеточной популяции аттенуированного штамма.

10. Определение безвредности и реактогенностн испытуемого штамма при аэрогенной иммунизации морских свинок

Аэрогенная вакцинация против чумы, особенно против легочной формы этой инфекции, является высокоэффективным методом, имеющим ряд преимуществ перед накожными, подкожным и внутрикожным путями введения вакцины. Методика определения безвредности вакцинного штамма чумного микроба при аэрогенной иммунизации морских свинок приведена в прилож. 4.

10.1.    Определение приживаемости и распространяемости бактерий испыту емого и вакцинного штаммов чумного микроба.

Для вакцинного штамма чумного микроба при аэрогенном методе введения допустимо выделение чумного микроба: из легких у всех животных с 1-х до 14-х суток; из регионарных (бифуркационных) и других лимфатических узлов до 14-х суток: из печени и селезенки у единичных животных в течение 7 сут. Допустимо выделение единичных бактерий испыту емого вакцинного штамма чумного микроба в первые 1—3 сут из крови. Недопустимо выделение бактерий испытуемого штамма из органов и лимфатических узлов чаще и в более длительные сроки после введения, чем эталонного вакцинного штамма EV.

10.2.    Определение реактогенностн штамма для морских свинок при аэрогенном способе введения.

Рсактогснность штамма при аэрогенном способе введения оценивают по изменению массы и температу ры тела опытных животных.

Иммуногенный вакцинный штамм чумного микроба при аэрогенной иммунизации может вызывать снижение массы морских свинок, но не более чем на 5 % от первоначальной величины. К 7-м суткам масса животных должна восстанавливаться. Температура тела морских свинок в течение недели после иммунизации может повышаться. Среднее повышение температуры для группы животных, иммунизированных культу рой испыту емого штамма, не должно существенно превышать наблюдаемое при иммунизации культурой эталонного вакцинного штамма (для групп животных в среднем увеличение температуры нс должно превышать 1.5 °С).

10.3.    Определение безвредности штамма по морфологическим показателям при аэрогенном способе введения.

При ингаляционном способе введения испыту емого штамма микробы попадают в верхние дыхательные пути и в легкие, поэтому мор-

Содержание

1. Область применения...............................................................................................4

2.11ормативныс ссылки..............................................................................................4

3.    Общие положения...................................................................................................6

4.    Идентификация штамма но видовым признакам.................................................6

5.    Определение степени остаточной вирулентности (безвредности)

испытуемого штамма чумного микроба по распространяемости и приживаемости в органах морских свинок.....................................................................8

6.    Оценка безвредности исследуемого штамма pestis в опытах на белых

мышах........................................................................................................................10

7.    Определение стойкости утраты вирулентности бактериями исследуемого штамма в опытах на морских свинках....................................................10

8.    Определение реактогенносги штамма для морских свинок (прижизненные наблюдения) при подкожном способе введения................................11

9.    Определение безвредности исследуемых вакцинных штаммов для морских свинок но морфологическим показателям при подкожном

способе введения......................................................................................................11

К). Определение безвредности и реактогенносги испытуемого штамма при

аэрогенной иммунизации морских свинок............................................................20

И. Оценка реактогенносги испытуемого штамма по стрессорному действию....................................................................................................................22

12.    Определение влияния испытуемого штамма на иммунную систему

морских свинок.........................................................................................................22

13.    Иммуногенная активность штамма...................................................................23

14.    Испытания стабильности штамма в производственных условиях................25

15.    Испытания вакцины чумной сухой на людях...................................................25

Приложение I. Мето„чики идентификации штаммов чумного

микроба но видовым признакам..............................................................27

Приложение 2. Определение степени остаточной вирулентности (безвредаости) исследуемого штамма но распространяемости и приживаемости в органах и тканях при подкожном способе

введения морским свинкам.......................................................................37

Приложение 3. Определение стойкости \траты вирулентности

штаммами чумного микроба.....................................................................43

Приложение 4. Методика определения безвредности вакцинного штамма чумного микроба при аэрогенной иммунизации морских

свинок.........................................................................................................44

Приложение 3. Мето;щка определения реактогеннос ги вакцинного штамма чумного микроба по стрессорному дейс твию............47

Приложение б. Методы определения влияния вакцинного

штамма чумного микроба на иммунную систему морских свинок.......51

Приложение 7. Методы определения иммуногенной активности вакцинного штамма чумного микроба....................................................63

фологические изменения раньше развиваются в легких, чем в других внутренних органах. При ингаляционной иммунизации живыми чумными микробами при гистологическом исследовании в легких наблюдается развитие продуктивной межуточной реакции в межальвеолярных перегородках, гиперпластических процессов в перибронхиальных. пери-васкулярных лимфоидных образованиях, сочетающихся с увеличением в клеточных элементах количества РНК.

10.3.1.    Допу стимые изменения.

В легких допустимы межу точная продуктивная реакция, при которой имеется инфильтрация межальвеолярных перегородок гистиоцитами. лимфоцитами, эпитслиоидными клетками и макрофагами без резкого сдавления просветов альвеол, наличие в легких эпитслиоидноклсточ-ных гранулем (не более 10—15 в обоих легких).

В регионарных лимфатических узлах допустимы гиперпластические процессы различной степени выраженности, образование эпитс-лиоидноклеточных гранулем (до 6). трансформация единичных гранулем в пссвдоабсцсссы без выраженных явлений некроза в них. В селезенке - гиперпластические процессы и образование эпителиоидноклеточных гранулем (не более 10). большая часть которых не должна превращаться в пссвдоабсцсссы. В печени допу стимы умеренно выраженные дистрофические изменения паренхиматозных элементов, диффу зная или мелкоочаговая пролиферация купфсровских клеток и образование эпитслиоидноклсточных гранулем (до 10). превращение в пссвдоабсцсссы лишь некоторых гранулем.

Почки, надпочечники, сердце - допустимы умеренные дистрофические изменения паренхиматозных элементов этих органов.

10.3.2.    Недопустимые изменения. Недопу стимы в легких диффузная или крупноочаговая межуточная реакция с резким сдавлением просветов альвеол клеточными инфильтратами, наличие больших количеств нейтрофильных лейкоцитов среди клеток межальвеолярных перегородок: множественные, хотя бы и мелкие очаги (в 5 и более альвеол) катарально-десквамативной пневмонии: образование более 10 грану лем и превращение их в пссвдоабсцсссы. катарально-геморрагические пневмонии. гнойные трахеиты и бронхиты, абсцессы, множественные очаговые или сливные кровоизлияния, распространенные перибронхиальные и псриваскулярныс склерозы.

В регионарных лимфатических узлах недопустимо развитие гнойного аденита и периаденита: наличие массивных кровоизлияний, артс-риолонскрозов. образование более 5 гранулем с преимущественной их

УТВЕРЖДАЮ Главный государственный санитарный врач Российской Федерации -Первый заместитель Министра здравоохранения Российской Федерации

Г. Г. Онищенко

2 марта 2002 г.

МУ 3.3.1.1113—02

Дата введения - 1 мая 2002 г.

3.3.1. ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКА

Основные требования к вакцинным штаммам чумного микроба

Методические указания

1.    Область применения

1.1.    Методические указания «Основные требования к вакцинным штаммам чумного микроба» разработаны в помощь специалистам научно-исследовательских учреждений, осуществляющих разработку и контроль вакцинных штаммов.

2.    Нормативные ссылки

В настоящих методических указаниях использованы ссылки на следующие документы.

2.1.    Основы законодательства Российской Федерации об охране здоровья граждан.

2.2.    Методические указания «Основные критерии отбора вакцинных штаммов чумного микроба», утверждены Минздравом СССР 8.08.74.

2.3.    РД 42—28—24—88 «Медицинские иммунобиологические препараты. Основные термины и определения».

2.4.    РД 42—281—91 «Государственные приемочные испытания МИБП. Порядок проведения. Основные положения».

2.5.    Положение о государственной регистрации, сертификации и государственном контроле за качеством медицинских иммунобиологических препаратов в Российской Федерации. Постановление ГКСЭН от

3.07.94 №5.

2.6.    Санитарные правила СП 1.2.011—94 «Безопасность работы с микроорганизмами I—II групп патогенности».

2.7.    Санитарные правила СП 3.3.2.561—96 «Медицинские иммунобиологические препараты. Государственные испытания и регистрация новых медицинских иммунобиологических препаратов».

Введение

Возбудитель чумы относится к особо опасным микроорганизмам I группы патогенности. Для профилактики чумы в России применяют живую вакцину, поэтому безопасность (безвредность) вакцинных штаммов в основном решается на этапе доклинических лабораторных государственных испытаний. Основной задачей настоящих методических указаний является изложение обязательных требований к штаммам чумного микроба - кандидатам в вакцинные, критериев оценки и методов исследования, позволяющих отобрать хдя последующих клинических испытаний безопасные и высокоиммуногснныс штаммы чумного микроба.

Все испытания аттенуированных штаммов чумного микроба, перспективных в качестве вакцинных, проводят в сравнении с эталонным вакцинным штаммом чумного микроба EV линии НИИЭГ. получаемым в Государственном научно-исследовательском институте стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасовича.

На основании результатов государственных лабораторных (доклинических) испытаний, одобренных национальным органом контроля (ГИСК им. Л. А. Тарасовича) и Комитетом медицинских и иммунобиологических препаратов (МИБП). о соответствии нового штамма Y. pestis требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам данными методическими указаниями. Министерство здравоохранения Российской Федерации разрешает проведение клинических ограниченных, затем государственных испытаний на добровольцах живой вакцины, приготовленной на основе этого штамма, по программе, согласованной с национальным органом контроля и Комитетом МИБП. После утверждения Министерством здравоохранения испытуемого штамма в качестве нового

вакцинного, дальнейшие этапы внедрения живой вакцины проводят в соответствии с санитарными правилами СП 3.3. 2.561—96 «Медицинские иммунобиологические препараты. Государственные испытания и регистрация новых медицинских иммунобиологических препаратов».

3. Общие положения

3.1.    Для изготовления живой вакцины используют штаммы чумного микроба, стабильно утратившие патогенность для человека и животных. проявляющие остаточную вирулентность для мышей и. в больших дозах, для морских свинок.

3.2.    Все исследования по испытанию кандидатов в вакцинные штаммы чумного микроба должны проводиться в изолированном помещении. в котором нс должно быть микроорганизмов 1—II групп патогенности.

3.3.    Испытуемый и контрольный эталонный вакцинный штаммы чумного микроба должны быть зашифрованы специалистами, нс принимающими участия в проведении исследований.

3.4.    Вся работа с зашифрованными испытуемым и контрольным штаммом до отнесения испытуемого штамма к III группе патогенности должна проводиться как с микроорганизмами I группы патогенности.

3.5.    Для испытаний используют двухсуточные агаровые культуры второй генерации, полученные из лиофилизированных культур испытуемого штамма и контрольного вакцинного штамма чумного микроба EV линии НИИЭГ из коллекции ГИСК им. Л. А. Тарасовича.

Концентрацию клеток в микробных взвесях агаровых культур определяют по стандарту мутности ГИСК им. Л. А. Тарасовича (ОСО 42—28—59—86П). 10 единиц которого эквивалентны 1 • 10⁹ микробных клеток (м. к.) в 1 мл.

4. Идентификация штамма по видовым признакам

4.1. Чумной микроб относится к роду Yersinia, вида pestis. Y. pestis - облигатный паразит, природный ауксотроф с факультативным анаэробным типом дыхания, грамотрицательная палочка. Чумные микробы <|)срмснтнруют с образованием кислоты без газа глюкозу, галактозу, арабинозу. ксилозу, маннит, мальтозу, нс ферментируют сахарозу, лактозу и рамнозу (за исключением Горноалтайскнх и Закавказских штаммов); не образуют индол, не гидролизуют мочевину, океанические штаммы нс ферментируют глицерин, континентальные - ферментиру-

ют. Характерный R-тип колоний формируется на 2—4 сутки роста при оптимальной для развития температуре (28 ± 1) °С. Лизируются чумным диагностическим фагом Л-413с.

4.2.    Возбудитель чумы имеет три собственные плазмиды-пестициногенности (pPst). кальцийзависимости (pCad) и плазмиду pFra. имеющие молекулярные массы соответственно «6. % 47 и % 60 MD. Плазмида pPst детерминирует продукцию псстицина. иммунность к нему, синтез активатора плазминогена, отвечающего за плазмокоагу-лазную и фибринолитическую активности. Оба продукта плазмиды pPst являются видоспецифическими белками, имеют важное диагностическое значение. Плазмида pCad определяет зависимость роста клеток Y. pest is при температуре (37 ± 1)°С от наличия в питательной среде ионов кальция, а так же детерминирует биосинтез V антигена и Yops {Yersinia outer membrane proteins - белков внешней мембраны). Штаммы лишенные этой плазмиды, авиру лентны. Протсктивным действием для белых мышей обладает V антиген. Плазмида pCad не является видоспецифической. се варианты обнаруживают у всех патогенных представителей рода Yersinia, причем эти плазмиды обладают значительной степенью генетической гомологии. Однако, несмотря на значительное функциональное и структурное подобие, на видовом уровне эти плазмиды различаются по способности обеспечивать продукцию отдельных белков внешних мембран, которые имеют ведущее значение как в выражении вирулентности возбудителя, так и в видовой специфичности. Плазмида pFra детерминирует биосинтез капсу льного антигена Y. pestis (F1) и «мышиного» токсина (Тох). Антиген FI является основным иммуногеном Y. pestis. Оба антигена относятся к видоспецифическим.

Видовая специфичность чумного микроба определяется в основном генами, имеющими плазмидную локализацию.

Испыту емый штамм, предлагаемый в качестве вакцинного, должен соответствовать или превосходить эталонный вакцинный по показателю имму ногснности. соответствовать контрольному штамму по показателям безвредности и реактогенности или быть более безопасным, а по некоторым несущественным характеристикам, которые характеризуют его как представителя вида или разновидности    pestis. могу т отличать

ся от него.

4.3.    Исследуемый штамм - кандидат в вакцинные, должен:

•    лизироваться чу мным бактериофагом Л-413С;

•    быть типичным по культурально-морфологическим свойствам:

•    титр FI испытуемого штамма не должен быть меньше аналогичного показателя, полученного с культурой контрольного штамма Y. pestis EV. выращенного в аналогичных условиях:

•    доля кальцийне зависимых мутантов в популяции культу р чумного микроба, продюсированных чере з органи зм лабораторных животных и нс подвергавшихся длительному хранению или каким-либо физическим во здействиям, нс должна превышать 0,3 %:

•    нс должен уступать контрольному штамму по фибринолизин-плазмокоагулазной активности;

•    испыту емый и контрольные штаммы не должны обладать способностью к пигментсорбции;

•    испытуемые вакцинные штаммы аналогично эталонному штамму EV на элсктрофореграмме должны иметь 3 полосы плазмидной ДНК. соответствующие pFra (60 MD). pCad (47 MD) и pPst (6 MD).

Методики определения видовых признаков испытуемого и контрольного штаммов приведены в прилож. 1.

5. Определение степени остаточной вирулентности

(безвредности) испытуемого штамма чумного микроба по распространяемости и приживаемости в органах морских свинок

Методика определения безвредности нового вакцинного штамма приведена в прилож. 2.

О безвредности культуры испытуемого штамма судят по реакции органи зма морских свинок на се введение, по приживаемости и распространяемости в организме, по выявленным у подопытных морских свинок патоморфологическим изменениям, степени выраженности и обратимости. В качестве контроля в этих экпериментах используют группу морских свинок, привитых ку льту рой вакцинного штамма )'. pestis EV и обследу емых аналогичным обра зом.

5.1.    Испытуемый и эталонный вакцинный штаммы чумного микроба не должны вызывать гибель морских свинок, привитых I • 10"—

1,5 • 10^ю м. к.

5.2.    Вакцинные штаммы чумного микроба должны обладать определенной степенью остаточной вирулентности, т. е. в течение некоторого времени размножаться, распространяться и задерживаться в организме привитых животных, в резу льтате чего развивается доброкачественный вакцинальный процесс. Хорошо размножающиеся и приживающи-

сся в организме лабораторных животных вакцинные штаммы pestis обладают более выраженной имму ногснностью по сравнению с культурами, у которых слабо проявляются эти свойства.

5.3.    Бактерии вакцинных высокоиммуногенных штаммов pestis должны размножаться в организме привитых морских свинок в течение первых 3—15 сут., обусловливая тем самым иммунологическую перестройку организма. Через 30 сут. организм морских свинок, как правило. освобождается от микробов. Бактерии вакцинных штаммов pestis могут приживаться в организме морских свинок и выявляются в высевах из места введения и из регионарных лимфатических узлов в течение 20—30 сут. Поэтому микробы высокоиммуногенного вакцинного штамма обязательно должны обнаруживаться при высевах на питательные среды из места введения культу ры и регионарных лимфатических узлов. При введении 2 • 10⁹ и 1.5 • И)" м. к. возможно также выделение их в течение первых 10—15 сут из селезенки и из печени.

5.4.    Для вакцинного штамма чумного микроба при подкожном методе введения допустимо выделение микробов:

•    из места введения и регионарного лим<|>атнчсского узла до 20—30 сут. (в единичных случаях более 30 сут.) при дозах 2 • 10⁹ и

1.5    • Ю¹⁰ м. к. в ваде сливного (4+) или обильного роста (3+). при дозе 10 м. к. - около 100—200 колоний (2+) и при дозе 10² м. к. - до 10 и иногда более колоний (1+);

•    в посевах печени и селезенки от животных, привитых 2 ■ 10⁹ и

1.5    • Ю^,0м. к. в течение 2 недель может вырасти более 100 колоний, привитых 10 м. к. - около 50—100 колоний, от морских свинок, привитых 10' м. к., из печени и селезенки чумной микроб обычно нс выделяется:

•    в посевах из легких, крови и костного мозга, как правило, нс должно быть роста чумных микробов. У отдельных животных (нс более 1 %) в течение 3—5 сут., после введения массивных доз исследуемой ку льтуры (2 • 10⁹ и 1.5 • 10^|п м. к.), в посевах из легких, крови или костного мозга могу т вырастать единичные колонии Y. pestis.

5.5.    При введении животным ку льту ры штаммов с недостаточно стабилизированным клеточным составом в массивных дозах (2 • 10⁹ и 1.5 • 10¹ м. к.) большая часть клеток, потерявшая виру лентность, ведет себя в организме, подобно живой вакцине, и уже в первые дни индуцирует <|юрмнро-ванис специфического иммунитета. На <|юне приобретенного иммунитета оставшиеся в ку льтуре вирулентные клетки могут не вызывать развития чумной ин(|)скции («(|>сно.мен переживания» микробов), потому что дей-

ствие их нейтрализу ется уже сформировавшимися специфическими защитными механизмами хозяина, и животные, как правило, выживают. В этом случае возможно ошибочное заключение о соответствии исследуемого штамма по признаку безвредности требованиям, предъявляемым к вакцинным.

Только в том случае, когда в популяции исследуемого штамма много вирулентных клеток, или большая часть клеток недостаточно снизила свою вирулентность, или организм подопытных животных ослаблен и не успевает приобрести специфическую резистентность, животное погибает от чумы или псреболсваст ей. При определении безвредности нового вакцинного штамма для выявления в его популяции вирулентных клеток необходимо, как сказано выше, проводить испытания ку льту р на животных нс только путем введения массивных (2 10' и

1.5 Ю¹⁰ м. к.), но средних (10 м. к.) и малых (10^: и 5 ’ 10² м. к.) доз. Малые дозы чумного микроба с недостаточно сниженной виру лентностью могу т вызывать гибель морских свинок или недопустимые изменения в их органах и тканях.

6. Оценка безвредности исследуемого штамма Y. pestis в опытах на белых мышах

Ку льтуры вакцинных штаммов чумного микроба при подкожном введении белым мышам массой 18—20 г в дозах 10², К)\ 10⁵ и 10 м. к. нс должны вызывать их гибели. Каждую дозу вводят 10 животным. Наблюдение за ними проводят в течение 20 сут. В случае гибели белых мышей их исследуют патологоанатомически, морфологически, бактериологически. Методика ислсдовання приведена в п.п. 4 и 5 прилож. 2.

7. Определение стойкости утраты вирулентности бактериями

исследуемого штамма в опытах на морских свинках

Методика проведения пассажей приведена в прилож. 3.

В результате 10-кратного подкожного пассирования исследуемых ку льту р через организм морских свинок не должна повыситься остаточная виру лентность штамма, нс должны изменяться его ку льтуральные, морфологические и биохимические свойства; плазмидный профиль. Степень приживаемости микробов в организме может усилиться, но вакцинный штамм чумного микроба в организме морских свинок и бс-

1

Псевлоабсцессы - это скопление в периол резорбции полиморфноялернмх лейко-цитов в центральной части гранулем, формирующихся в процессе иммуногенеза. Морфо-логически тти учаечки мочуг ччаномиччать микроабсцессы, но отличачочея от последних своим чечетом и исходом.