МР 4.2.0078/1-13
Использование питательных сред для диагностики гнойных бактериальных менингитов

Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование _Российской    Федерации_

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФЛКГГОРЫ

Использование питательных сред для диагностики гнойных бактериальных менингитов

Методические рекомендации МР 4.2.0078/1—13

Издание официальное

Москва • 2014

Федеральная служба по надзору в сфере зашиты прав потребителей н благополучия человека

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Использование питательных сред для диагностики гнойных бактериальных менингитов

Методические рекомендации МР 4.2.0078/1—13

ББК51.9

И88

И88 Использование питательных сред для диагностики гнойных бактериальных менингитов: Методические рекомендации.—М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2014.—11 с.

ISBN 978—5—7508—1265—3

1.    Разработаны ФБУН ГНЦПМБ Роспотребнадзора (И. А. Дятлов,

Я. В. Подкопаев, Л. В. Домотенко, Т. П. Морозова, М. В. Храмов); Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Е. Б. Ежлова, А. А. Мельникова, Н. А. Кошкина).

2.    Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главным государственным санитарным врвчом Российской Федерации Г. Г. Онищенко 21 октября 2013 г.

3.    Введены в действие с момента утверждения.

ББК 51.9

ISBN 978—5—7508—1265—3

€» Роспотребнадзор, 2014 €> Федеральный центр гигиены и

эпидемиологии Роспотребнадзора, 2014

MP 4.2.0078/1—13

Содержание

1.    Область применения................... 4

2.    Общие положения...................................................................................................4

2.1.    Характеристика возбудителей........................................................................4

2.2.    Питательные среды, используемые для лабораторной диагностики

бактериальных менингитов............................................................................б

2.3.    Гемофилус-агар...............................................................................................7

2.4.    Шоколадный агар............................................................................................7

2.5.    ГБМ-агар..........................................................................................................7

3.    Аналитические и диагностические характеристики питательных сред.............8

3.1.    Гемофилус-агар...............................................................................................®

3.2.    Шоколадный агар и ГБМ-агар............................... ......................•

4.    Проведение анализа................................................................................................9

4.1.    Приготовление питательных сред.................... ®

4.2. Посев н инкубация.........................................................................................^

4.3.    Учвт результатов.......................................................................................—    1°

5.    Условия хранения и эксплуатации питательных сред.......................................I®

6.    Меры предосторожности..............................................................................——-1®

7. Заключение..........................................................................................................* 1

Список литературы.................................................................—■• I»

3

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г. Г. Онищенко

21 октября 2013 г.

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Использование питательных сред для диагностики гнойных бактериальных менингитов

Методические рекомендации МР 4.2.0078/1—13

1. Область применения

1.1.    Методические рекомендации предназначены для врачей-бакте-риологов, эпидемиологов, лаборантов и других специалистов, занимающихся проблемами гнойных бактериальных менингитов и других инфекций, вызываемых Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae.

1.2.    В методических рекомендациях приведены общие сведения о трёх основных возбудителях гнойных бактериальных менингитов: N. meningitidiSy Н. influenzae, S. pneumoniae. Подробно обсуждаются вопросы, касающиеся свойств и использования питательных сред для выделения и культивирования основных возбудителей гнойных бактериальных менингитов.

2. Общие положения

2.1. Характеристика возбудителей Гнойные бактериальные менингиты (ГБМ) - заболевания, при которых локализация инфекционного процесса происходит в мягких мозговых оболочках основания головного мозга и верхней части спинного мозга. Этиологическими агентами ГБМ могут быть различные микроорганизмы: N. meningitidiSy Н. influenzae_y S. pneumoniae, Candida albicanSy

4

MP 4.2.0078/1—13

Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae; Escherichia coli_y Listeria monocytogenes, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa и другие. Из них более 90 % расшифрованных случаев бактериальных менингитов приходится на 7/. meningitidis, S', pneumoniae и Н. influenzae типа Ь, из-за чего основные усилия в лабораторной диагностике при подозрении на ГБМ направлены на выделение этих возбудителей.

N. meningitidis - грамотрицательные неподвижные, неспорообразующие кокки. Экзотоксина не образуют, при гибели микробной клетки высвобождается эндотоксин липонолисахаридной природы. В соответствии с особенностями строения полисахаридной капсулы менингококки подразделяют на 12 серогрупл: А, В, С, X, Y, Z, W-135, 29-Е, К, Н, L, L Менингококки чрезвычайно чувствительны к воздействию внешней среды. Температурный оптимум жизнедеятельности 37 °С в атмосфере с повышенным содержанием С0₂ (5—10%) и влажности. Нуждаются в высокопитательных средах, содержащих нативные белки или кровь животного происхождения.

Н. influenzae - небольшие (0,3—0,4 к 1—1,5 мкм) грамотрицательные, сферические, овальные и палочковидные клетки. Неподвижные, неспоробразующие, медленно окрашиваются анилиновыми красителями. Основной фактор вирулентности - капсула. Капсульные штаммы Н. influenzae содержат капсульный полисахарид одного из 6 типов (а, Ь, с, d, е, f), которые отличаются по составу входящих в него углеводов и антигенным свойствам. Большинство инвазивных инфекций вызывается штаммами Н. influenzae типа Ь. Капсула типа b состоит из полирибозил-рибитолфосфата, то есть содержит в качестве мономера пентозу (рибо-зу) в отличие от других типов, содержащих гексозу. Бес капсульные штаммы обозначаются как нетипируемые. Для роста гемофильных палочек необходимо наличие в среде факторов роста X (гемин или гема-тин) и V (кофермент никотинамидадениндинуклеогид - НАД). Оптимальная температура культивирования 37 °С в атмосфере с повышенным содержанием С0₂ (5—10 %).

S. pneumoniae - грамположительиые овальные, иногда вытянутые вдоль оси ланцетовидные кокки диаметром 0,5—1,0 мкм, располагаются парами и окружены общей капсулой, неподвижны, спор не образуют, являются факультативными анаэробами, хемоорганотрофы. По капсульному антигену проводят типоспецифическую дифференцировку пневмококков, которых насчитывают не менее 90 серотипов. Пневмококки нуждаются в богатых питательных средах с высоким содержанием аминного азота и нативного белка животного происхождения. Темпера-

MP 4.2.0078/1-13

турный оптимум жизнедеятельности 37 °С в атмосфере с повышенным содержанием С0₂ (5—10 %).

2.2. Питательные среды, используемые для лабораторной диагностики бактериальных менингитом

Одним из основных этапов лабораторной диагностики ГБМ являет-ся бактериологический посев на питательные среды с целью выделения возбудителя заболевания.

Для выделения N. meningitidis используют полужидкий сывороточный агар, сывороточный, кровяной и шоколадный агары. При культивировании S. pneumoniae предпочтение отдаётся кровяному агару. Кроме того, S. pneumoniae культивируют на шоколадном, сывороточных агарах и на полужидком сывороточном агаре.

Н. influenzae не растёт на простых и сывороточных питательных средах. Кровяные агары не подходят для культивирования Н. influenzae из-за содержащихся в нагивнон крови никотннамидадениндинуклеоти-даз (НАДаз), инактивирующих фактор V. Основной средой для культивирования и выделения Н. influenzae является шоколадный агар. Термическая обработка, которой подвергается кровь в процессе приготовления шоколадного агара, позволяет частично лизировать эритроциты, высвобождая тем самым факторы роста и разрушая НАДазы. Оптимальной средой, поддерживающей рост всех трёх основных возбудителей ГБМ, является шоколадный агар. В настоящее время в отечественной практике сывороточный, кровяной и шоколадный агары готовят в лабораторных условиях, в качестве основы используя агар Хоттингера, колумбийский агар, агар для бруцелл, питательную среду для определения чувствительности микробов к антибиотикам (АГВ), эритрит-агар. Руководством по лабораторным методам диагностики бактериальных менингитов, разработанных ВОЗ, для этих целей рекомендованы тршггнкаэо-соевый агар (trypticase soy agar), сердечно-мозговой агар (brain heart infusion agar) и гонококковый агар (GC agar).

Биологические и физико-химические показатели качества шоколадного и кровяного агаров зависят от качества и типа используемой крови. Для приготовления данных сред используют дефибринирован-ную баранью, лошадиную кровь и кровь крупного рогатого скота. Человеческая кровь содержит антитела, которые могут ингибировать рост микроорганизмов, поэтому она пригодна только для приготовления шоколадного агара. Кровь, используемая для приготовления питательных сред, не должна содержать консерванты, что ограничивает срок её годности и температурный режим хранения. Все перечисленные факторы

6

MP 4.2.0078/1—13

создают проблемы при лабораторном изготовлении кровяных и шоколадных питательных сред. Дополнительные трудности возникают при приготовлении шоколадного агара, поскольку его качество и стандартность зависят не только от качества используемой крови, но и от навыков и умения лаборанта в процессе прогревания питательной среды.

Решение проблемы стандартности питательных сред возможно при использовании коммерческих питательных сред. Ряд иностранных фирм-пронзводителей питательных сред выпускают питательные среды, в которых нативная кровь заменена сухим гемоглобином и ростовыми добавками. Эти среды, как сухие, так и готовые к применению, используются для выделения и культивирования всех трбх основных возбудителей ГБМ.

В нашей стране для выделения и культивирования основных возбудителей ГБМ разработаны три питательных среды: питательная среда для выделения возбудителей гнойных бактериальных менингитов, готовая к применению (шоколадный агар); питательная среда для культивирования и выделения гемофильной палочки, готовая к применению (ге-мофилус-агар) и питательная среда для выделения и культивирования возбудителей гнойных бактериальных менингитов, сухая (ГБМ-агар).

2.3. Гсмофилус-агар

Предназначен для бактериологических исследований в клинической микробиологии при анализе клинического материала от больных с подозрением на бактериальный менингит и другими заболеваниями инфекционной природы, вызываемыми бактериями рода Haemophilus, а также при работе с чистыми культурами Haemophilus.

2.4. Шоколадный агар

Предназначен для бактериологических исследований в клинической микробиологии при анализе клинического материала от больных с подозрением на бактериальный менингит и другими заболеваниями инфекционной природы, вызываемыми бактериями Я influenzae, S. pneumoniae, N. meningitidis, а также при работе с чистыми культурами Я. influenzae, S. pneumoniae, N. meningitidis.

2.5. ГБМ-агар

Предназначен для бактериологических исследований с целью выделения и культивирования бактерий Я. influenzae, S. pneumoniae, N. meningitidis.

7

3. Аналитические и диагностические характеристики питательных сред

3.1. Гемофилус-агар Обеспечивает рост тесг-штаммов N. influenzae 423 и Н. influenzae АТСС 9006 при посеве по 0,1 мл взвеси каждого тест-штамма из разведения 10“* через 18—24 ч инкубации при температуре (37 i 1) °С в атмосфере 5—10 % СО2 в виде слизистых, круглых, сероватого цвета, полупрозрачных колоний диаметром до 2 мм. Питательная среда подавляет рост тест-штаммов микробов-ассоциантов Streptococcus pyogenes Dick-1 и N. meningitidis А 208 при посеве 0,1 мл взвеси из разведения 10“ , приготовленной по отраслевому стандартному образцу мутности ОСО 42-28-85-09П.

3.2. Шоколадный агар и ГБМ-агар

На шоколадном агаре и ГБМ-агаре без введения селективных добавок тест-штаммы растут следующим образом:

-    N. influenzae 423, Н. influenzae АТСС 49247 - в виде слизистых, круглых, полупрозрачных, сероватого цвета колоний диаметром 1,0— 2,0 мм при посеве 0,1 мл взвеси из разведения 10^-6 через 18—24 ч инкубации при температуре (37 ± 1) °С в атмосфере 5—10 % С0₂;

-N. meningitidis А 208, N. meningitidis АТСС 13102 - в виде полупрозрачных, выпуклых с ровными краями колоний диаметром до 2 мм при посеве 0,1 мл взвеси из разведения 10"⁶ через 18—24 ч инкубации при температуре (37 ± 1) °С в атмосфере 5—10 % С0₂;

—    5. pneumoniae АТСС 6305 ~ в виде нежных полупрозрачных чётко очерченных, не склонных к слиянию колоний диаметром 0,4—0,6 мм при посеве 0,J мл взвеси из разведения 10'⁵ через 18—24 ч инкубации при температуре (37 ± 1) °С в атмосфере 5—10 % С0₂. Допускается наличие плоских с центральным углублением колоний. В зоне роста культуры на чашках с шоколадным агаром наблюдается позеленение питательной среды, на чашках с ГБМ-агаром - обесцвечивание питательной среды.

При использовании соответствующих селективных добавок шоколадный гиар и ГБМ-агар обеспечивают избирательный рост тест-штаммов.

С селективной добавкой СД-Г обе питательные среды обеспечивают рост штаммов Н. influenzae 423 и Н. influenzae АТСС 49247 при посеве 0,1 мл взвеси каждого тест-штамма из разведения 10Г⁶ и подавляют рост тест-штаммов: S. pneumoniae АТСС 6305, N. meningitidis А 208,

8

MP 4.2.0078/1—13

N. meningitidis АТСС 13102 и С. albicans АТСС 60193 при посеве ОД мл взвеси каждого тест-штамма из разведения I0”⁴ через 48 ч инкубации при температуре (37 ± 1) °С.

С селективной добавкой СД-П обе питательные среды обеспечивают рост S. pneumoniae АТСС 6305 при посеве ОД мл взвеси тест-штамма из разведения 10"⁵ и подавляют рост тест-штаммов: N. meningitidis А 208, N. meningitidis АТСС 13102, И. influenzae 423, Я influenzae АТСС 49247 и С. albicans АТСС 60193 при посеве ОД мл взвеси каждого тест-штамма из разведения 10"⁴ через 48 ч инкубации при температуре (37 ± 1) °С.

С селективной добавкой СД-М обе питательные среды обеспечивают рост N. meningitidis А 208 и N. meningitidis АТСС 13102 при посеве ОД мл взвеси каждого тест-штамма из разведения 10 * и подавляют рост тест-штаммов: S. pneumoniae АТСС 6305, Я. influenzae 423, Я. influenzae АТСС 49247 и С. albicans АТСС 60193 при посеве ОД мл взвеси каждого тест-штамма из разведения 10”⁴ через 48 ч инкубации при температуре (37 ± 1) °С.

4. Проведение анализа

4.1. Приготовление питательных сред Питательные среды готовят в соответствии с инструкциями по применению данных препаратов. Для приготовления гемофилус-агара и шоколадного агара бутылки с основами выдерживают в кипящей водяной бане до полного расплавления агара. Возможно расплавление основ питательных сред в автоклаве в режиме «стерилизации текучим паром». Содержимое флаконов с ростовыми добавками и, при необходимости, с селективными добавками растворяют в стерильной дистиллированной воде и добавляют в остывшую до (45—50) °С основу. Перемешивают и разливают в чашки Петри.

Для приготовления I БМ-агара навеску основы в количестве, указанном на этикетке для приготовления конкретной серии питательной среды, растворяют в дистиллированной воде, стерилизуют автоклавированием. Содержимое флаконов с ростовыми добавками и, при необходимости, с селективными добавками растворяют в стерильной дистиллированной воде и добавляют в остывшую до 45—50 °С основу. Перемешивают и разливают в чашки Петри. Растворы ростовых и селективных добавок не хранить, использовать немедленно после приготовления!

9