МР 4.2.0075-13
Перечень маркеров генного полиморфизма, отвечающих за особенности мутагенной активности техногенных химических факторов

Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование _Российской    Федерации_

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Перечень маркеров генного полиморфизма, отвечающих за особенности мутагенной активности техногенных химических факторов

Методические рекомендации МР 4.2.0075—13

Издание официальное

Москва • 2013

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей н благополучия человека

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Перечень маркеров генного полиморфизма, отвечающих за особенности мутагенной активности техногенных химических факторов

Методические рекомендации МР 4.2.0075—13

ББК 51.21 П27

П27 Перечень маркеров генного полиморфизма, отвечающих за особенности мутагенной активности техногенных химических факторов: Методические рекомендации.—М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2013.—24 с.

ISBN 978—5—7508—1246—2

1.    Разработаны Федеральным бюджетным учреждением науки «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения» Федеральной службы но надзору в сфере защиты нрав потребителей и благополучия человека (Н. В. Зайцева, О. В. Долгих, А. В. Кривцов, Д. Г. Дианова, Д. В. Ланин, Т. С. Льгота, А. М. Гугович, Р. А. Харахорина); Федеральным бюджетным учреждением науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» (А. Г. Богун).

2.    Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г. Г. Онищенко 20 августа 2013 г.

3.    Введены впервые.

ББК 51.21

Формат 60x88/16

Редактор Н. В. Кожока Технический редактор Е. В. Ломанова

Подписано в печать 25.10.13

Тираж 200 экз.

Печ. л. 1,5 Заказ 70

Федеральная служба но надюру в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 127994, Москва, Банковский пер., д 18, стр. 5, 7

Оригинал-макет подготовлен к печати и тиражирован отделом издательского обеспечения Федерального центра ппиены и эпидемиологии Роснотрсбнадаора 117105, Москва, Варшавское ш , 19а

Отделение реализации, тел./факс 8(495)952-50-89

© Роспотребнадзор, 2013 О Федеральный центр гигиены и

эпидемиологии Роспотребнадзора, 2013

MP 4.2.0075—13

Содержа пне

Список сокращений....................................................................................................4

I Общие положения....................................................................................................5

2.    Область применения...............................................................................................6

3.    Основная часть........................................................................................................7

3.1.    Введение...........................................................................................................7

3.2.    Методика генетического тестирования однонуклеотидных

полиморфизмов...............................................................................................8

3.3.    Требования к помещениям и технике безопасности..................................11

3.4.    Аппаратура, материалы и реактивы.............................................................12

3.5.    Подготовка материала для исследований....................................................14

3.6.    Порядок проведения исследований.............................................................16

3.7.    Интерпретация результатов..........................................................................18

4.    Библиографические данные.................................................................................22

Приложение 1. Перечень маркеров генетического полиморфизма для

оценки воздействия неблагоприятных техногенных химических факторов....................................................................23

Приложение 2. Перечень ДНК-баз для поиска генетического

полиморфизма................................................................................24

3

MP 4.2.0075—13

Список сокращений

ТХФ - техногенный химический фактор

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПАУ - полициклические ароматические углеводороды

АСЕ - ангиотензин-превращающий фермент

CYP1A1 - цитохром Р1А1

CYP1А2 - цитохром PI А2

CYP17 А1 - цитохром Р17А1

гены PPARA, PPARD, PPARG - гены альфа-рецептора, активируемого пролифераторами пероксисом CYP2C19 - цитохром Р2С19 GSTP1 - глутатион S-трансфераза MTHFR - метилентетрагидрофолатредуктаза SNP (ОНП) - однонуклеотидный полиморфизм NOS3 - NO-синтаза АРО-Е - аполипопротеин ЮТальфа - фактор некроза опухоли-альфа СРОХ - копропорфириногеноксидаза VEGF - эндотелиальный фактор роста IL4 - интерлейкин 4

HLA DR - Human Leukocyte Antygen - человеческий лейкоцитарный антиген 2 класса

р53 - белок, фактор клеточной транскрипции BRCA1, BRCA2 — гены онкопролиферации

4

MP 4.2.0075—13

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г. Г. Онищенко

20 августа 2013 г.

Дата введения: с момента утверждения

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Перечень маркеров генного полиморфизма, отвечающих за особенности мутагенной активности техногенных химических факторов

Методические рекомендации МР 4.2.0075—13

1. Общие положения

1.1.    Методические рекомендации предназначены для ранней диагностики и профилактики формирования генетически опосредованных нарушений здоровья у лиц, проживающих и работающих в условиях воздействия комплекса техногенных химических факторов среды обитания.

1.2.    В настоящих рекомендациях использованы результаты изучения генетического полиморфизма, характеризующего нарушение генетически опосредованных адаптационных процессов у детей и работающих, связанных с неблагоприятным воздействием химических факторов среды обитания.

1.3.    Реализация углубленных диагностических исследований, направленных на выявление особенностей развития генетических и эпигенетических нарушений в условиях воздействия химических факторов проводится лечебно-профилактическими учреждениями, лицензированными в установленном порядке в системе лицензирования Министерства здравоохранения Российской Федерации в области проведения соот-

5

MP 4.2.0075—13

ветствующих химико-аналитических, клинико-лабораторных, лечебнопрофилактических мероприятий.

1.4. Все исследования осуществляются в строгом соответствии с требованиями действующих нормативно-методических документов.

2. Область применения

2.1.    Настоящие методические рекомендации разработаны для проведения гигиенической оценки неблагоприятного воздействия техногенных химических факторов на развитие генетических нарушений у лиц, проживающих и работающих в условиях воздействия комплекса техногенных химических факторов среды обитания. В настоящих методических рекомендациях определен перечень генетических маркеров эффекта, а также методология идентификации генетических нарушений в условиях химической контаминантной нагрузки.

2.2.    Методические рекомендации предназначены для научных учреждений Федеральной и территориальной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека при проведении санитарно-эпидемиологической экспертизы, расследований, исследований, генетической, токсикологической, гигиенической и иных видов оценок по установлению причинно-следственных связей между факторами среды обитания и здоровьем населения субъектов Федерации. Рекомендации также могут быть использованы лечебно-профилактическими и другими организациями, независимо от организационно-правовой формы и направлений исследований (научная или прикладная форма постановки и решения проблемы), занимающимися вопросами гигиенической оценки развития неинфекционных заболеваний, вопросами предотвращения и снижения неблагоприятных последствий воздействия факторов среды обитания на здоровье человека.

2.3.    Методические рекомендации предназначены для проведения гигиенических исследований в условиях воздействия комплекса техногенных химических факторов, обладающих мутагенным и канцерогенным эффектами и влиянием на развитие: полициклические ароматические углеводороды (бенз(а)пирен), алифатические альдегиды (формальдегид), ароматические углеводороды (бензол), хлорорганические соединения (хлороформ), фенолы, тяжелые металлы (свинец, хром, ванадий, марганец). Перечень генетических маркеров эффекта охватывает следующие критические области генетического полиморфизма: гены ферментов системы детоксикации ксенобиотиков; гены, участвующие в патогенезе техногенных нарушений в органах-мишенях; гены белков предрасположенности к онкопролиферативным состояниям; гены ак-

MP 4.2.0075—13

тивности состояния компонентов иммунного ответа. Маркеры приоритетных однонуклеотидных полиморфизмов представлены в прилож. 1.

3. Основная часть 3.1. Введение

Здоровье человека постоянно подвергается негативному воздействию химических мутагенов. В связи с этим актуальной проблемой является разработка методов выявления адаптивности отдельного человека и популяции к действию химических мутагенов, связанной с полиморфизмом генов.

Вследствие генетической гетерогенности популяции человека в ней присутствуют индивиды, генетические особенности которых обусловливают повышенную чувствительность к действию мутагенов.

Восприимчивость организма к воздействию техногенных химических факторов в значительной мере зависит от особенностей генетических ассоциаций, определяющих активность ферментов системы детоксикации ксенобиотиков, активность факторов, участвующих в патогенезе техногенных нарушений в органах-мишенях, состояние белков предрасположенности к онкопролиферативным состояниям, активность состояния компонентов иммунного ответа.

При этом особый интерес вызывают вопросы функциональной организации генома и особенностей генетического полиморфизма.

По данным научной литературы, распространенность минорного аллеля в популяции занимает в среднем 10 % по большинству значимых полиморфизмов.

Развитие исследований и методического базиса в этом направлении необходимо для профилактического обеспечения путей защиты и стабилизации генома человека в условиях возрастающего загрязнения окружающей среды.

Необходимость перехода в оценке генома человека от отдельных индивидов к более детальному анализу популяционных структур настоятельно требует исследований по выявлению мутаций, связанных с проявлением изменчивости внутри небольших локальных популяций. Такая изменчивость известна как полиморфизм. Генетический полиморфизм может быть качественным, когда происходят замены нуклеотидов, либо количественным, когда в ДНК варьирует число нуклеотидных повторов различной протяженности. Тот и другой виды генетического полиморфизма встречаются как в смысловых (белок-кодирующих), так и во внегенных последовательностях молекулы ДНК. Данный методический документ разработан для идентификации однонуклеотидных

7

MP 4.2.0075—13

полиморфизмов (SNP), то есть замены одного нуклеотида другим, характерной для качественного полиморфизма.

Детекция значимых полиморфизмов при воздействии техногенных химических мутагенов: полициклических ароматических углеводородов (бенз(а)пирен), алифатических альдегидов (формальдегид), ароматических углеводородов (бензол), хлорорганических соединений (хлороформ), фенолов, тяжелых металлов (свипец, хром, ванадий, марганец) требует выполнения исследований следующих однонуклеотидных замен:

1.    Гены 1-й фазы детоксикации (биотрансформация всех чужеродных веществ) - цитохромы Р450 (CYP1, CYP2, CYP17).

2.    Гены 2-й фазы детоксикации (нейтрализация или конъюгация чужеродных соединений) - глутатион-8-трансфераза (GST), метилентет-рагидрофолатредуктаза (MTHFR), коиропорфирююгеноксидаз (СРОХ).

3.    Гены иммунорегуляции - HLA-комплекс (HLA-DR), гены цитокинов: ген рецептора интерлейкина-4 (IL4R), ген фактора некроза опухоли (TNF альфа).

4.    Гены онкопролиферативных состояний - ген р53 (транскрипционный фактор, внутриклеточный онкосупрессор), гены BRCA (рак женской репродуктивной сферы).

5.    Соматические, патогенетические гены (участие в развитии нарушений в органах-мишенях) - ген васкулярно-эндотелиального фактора роста (VEGF), ген эндотелиальной NO-синтазы (eNOS), ген ангиотензин-1 превращающего фермента (АСЕ), гены рецепторов активации пролиферации пероксисом (гены семейства PPAR).

3.2. Методика генетического тестирования однонуклеотидных полиморфизмов

Для поиска и идентификации ДНК-полиморфизма в настоящее время разработаны и широко применяются различные методы, число которых приближается к ста.

В зависимости от целей исследования, все молекулярно-генетические методы можно подразделить на две группы: методы, направленные на поиск неизвестных мутаций (первичная идентификация), и анализ известных мутаций.

Методы, применяемые для первичной идентификации мутаций, то есть позволяющие скринировать на наличие ДНК-поломок достаточно протяженные фрагменты генов, включают метод анализа конформаци-онного полиморфизма однонитевой ДНК, денатурирующий градиентный гель-электрофорез, метод гетеродуплексного анализа, метод хими-

MP 4.2.0075—13

ческого расщепления некомплементарных сайтов, метод тестирования «неполноценного» белка, метод масс-спектрометрии и метод биочипов.

Выявление мутаций этими методами должно обязательно подтверждаться результатами прямого секвенирования изучаемого ДНК-фраг-мента гена. Таким образом, большинство перечисленных методов (за исключением масс-спектрометрии и биочипов) позволяет выявить только подозрительные на наличие толковых и других мутаций участки ДНК, и только метод секвенирования дает полную информацию о типе и характере нуклеотидных изменений. Зачастую первичный поиск нарушений в кодирующих областях гена проводят именно таким образом.

Одним из самых часто используемых молекулярных методов, позволяющих идентифицировать многие уже известные мутации, является ПЦР. Кроме того, этот метод лежит в основе других методов изучения генома.

3.2.1. Проведение полимеразной цепной реакции

Полимеразная цепная реакция проводится в несколько последовательных этапов, для реализации которых широко используются специальные программируемые аппараты - термоциклеры, позволяющие задавать и поддерживать определенный температурный режим реакции. Все компоненты реакции - матричную ДНК, олигопраймеры, смесь де-зоксинуклеотидов и термофильную ДНК-полимеразу — добавляют в специальный солевой буфер непосредственно перед помещением пробирки с реакционной смесью в термоциклер.

На первом этапе исследуемая двухнитевая матричная ДНК переводится в однонитевую форму путем её нагревания в течение нескольких минут до температуры 94—98 °С. Дальнейшая схема заключается в чередовании циклов:

•    гибридизация или отжиг ДНК с праймерами;

•    синтез последовательностей, комплементарных матричной ДНК;

•    денатурация образовавшихся двухнитевых структур.

На этапе гибридизации температура реакционной смеси снижается до 50—65 °С. Находящиеся в растворе олигопраймеры гибридизуются с денатурированной (одноцепочечной) геномной ДНК, содержащей комплементарные (соответствующие им) участки.

Повышение температуры до 65—72 °С, оптимальной для работы термофильной Taq ДНК-полимеразы, запускает синтез ДНК в направлении от 5’ к 3’-концу геномной ДНК-матрицы. При дальнейшем повышении температуры до 80—90 °С синтез ДНК прекращается, происходит денатурация с освобождением с геномной матрицы уже синтезирован-