МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР ГЛАВНОЕ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЕ УПРАВЛЕНИЕ
ВЫДЕЛЕНИЕ МЕНИНГОКОККА ОТ БОЛЬНЫХ И БАКТЕРИОНОСИТЕЛЕЙ(Методические рекомендации)
Оренбург—1984
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР ГЛАВНОЕ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЕ УПРАВЛЕНИЕ
«УТВЕРЖДАЮ»
Начальник Главного санитарно-эпидемиологического управления Министерства здравоохранения СССР
В. Ё. Ковшило
№ 3083-84 15.08 1984 г.
ВЫДЕЛЕНИЕ МЕНИНГОКОККА ОТ БОЛЬНЫХ И БАКТЕРИОНОСИТЕЛЕЙ(Методические рекомендации)
Оренбург— 1984
П р И Л О Ж С II и с
ПРИГОТОВЛЕНИЕ НОВОЙ ЭЛЕКТИВНОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ С ЛИЗОЦИМОМ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ МЕНИНГОКОККА
На 80 мл расплавленного и охлажденного до 60°С 1,5% питательного агара на бульоне из перевара Хоттингера (pH — 7,4—7,6), или 1,5% питательного агара Дагестанского института питательных сред добавляют 20 мл нормальной лошадиной сыворотки и 1,0 мл раствора лизоцима в концентрации 1.10 6—1.10 4 г/мл (лизоцим разводят в стерильном физиологическом растворе).
Используют официальный препарат лизоцима из яичного куриного белка производства завода «Мосмедпрспараты» или Олайнского завода хнмрсактнвов (ГОСТ — ТУ 6-09-10-1306-78). Лизоцим в растворе можно хранить в холодильнике при +4—6° С в течение 7 дней. Полученную элективную питательную среду разливают по 10 мл в стерильные чашки Петри.
Лошадиная сыворотка выпускается институтом нм. Мечникова (г. Уфа). Перед употреблением сыворотка инактивируется на водяной бане при 56°С в течение 30 минут,
ФВ02789. 6.11 1984 г. Тираж 500. Заказ 2201 Типография изд-ва «Южный Урал»
Методические рекомендации рассмотрены и ре комендованы к утверждению Лабораторным Советом при Главном санитарно-эпидемиологическом управлении Министерства здравоохранения СССР
Рекомендации разработаны сотрудниками Оренбургского медицинского института (Б, Я. Усвяцов, Л. А* Зарифуллина, С. Д. Борисов, О. В. Бухарин)
ВВЕДЕНИЕ
Бактериологический метод является основным в диагностике менингококковой инфекции. Однако чувствительность Метода недостаточно высока в связи с трудностью выделения возбудителя за счет его внутриклеточного паразитирования*.
В настоящее время у менингококка обнаружено новое свойство; антилизоцимная активность — способность микроорганизмов инактивировать клеточный лизоцим. Установлена прямая коррелятивная связь между степенью антилизоцим-ной активности менингококков и их способностью к паразитированию и персистированию внутри клетки. На основе этого свойства был разработан новый метод выделения менингококка йри разных формах менингококковой инфекции с учетом внутриклеточного паразитирования возбудителя. Сущность метода заключается в том, что накопление менингококка происходит непосредственно в клетках исследуемого материала. Это достигается путем инкубации исследуемого материала в специальных средах для культур ткани (среда Игла или среда* 199) и последующего высева материала на соответствующие элективные питательные среды.
Учитывая, что нами ранее была обнаружена способность лизоцима в определенных концентрациях стимулировать рост И размножение менингококка, была сконструирована новая элективная питательная среда С лизоцимом. Экспериментальная проверка разработанной питательной среды в сравнении с Существующими элективными питательными средами показала ее определенные преимущества. В связи с этим в разработанном методе по выделению менингококка на эту среду осуществляется высев исследуемого материала после предварительной его инкубации в среде накопления (среда Игла или среда-199). Последующее изучение выделенной чистой
* Б. Я. Усвяцов, Л. А. Зарифуллина «Антилизоцимная активность патогенных нейссерий». В кн.: «Факторы естественного иммунитета», Куйбышевский медицинский институт, 1983 г., 77—81.
3
культуры менингококка проводят по общепринятым методикам.
Предлагаемый метод обеспечивает более полное выделение менингококков и может быть рекомендован в практику бактериологических лабораторий республиканских, краевых, областных, городских и районных санэпидстанций, а также клинических лабораторий стационаров.
Методические рекомендации предназначены для врачей-бактериологов.
ВЫДЕЛЕНИЕ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ МЕНИНГОКОККА ОТ БОЛЬНЫХ С ПОДОЗРЕНИЕМ НА МЕНИНГИТ
1. Реактивы, приборы, стекло
1.1. Среда Игла или среда-199 — официнальные среды для культур ткани, выпускаются Свердловским НИИ вирусных инфекций, Московским НИИ вирусных препаратов, Институтом полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР.
1.2. Пробирки, ГОСТ 10515, диаметр 15 мм, высота 145—150 мм.
1.3. Центрифуга ЦЛС-3.
1.4. Термостат.
1.5. Пастеровские пипетки.
1.6. Чашки Петри, ГОСТ 7900-56.
1.7. Элективная питательная среда с лизоцимом — см, приложение.
2. Схема выделения возбудителя
Описание этапа исследования
Длительность этапа в часах
Взятие исследуемого материала— осадок спинномозговой жидкости
В клетках исследуемого 0,5
материала (лейкоцитах) находится менингококк
Посев исследуемого материала Среда Игла или сре- 0,02
в среду Игла или среду-199 да-199 поддерживает жиз
неспособность клеток и тем самым способствует накоплению в клетках менингококка
Инкубация посева при 37° С. Размножение менинго- 2,5—3
кокка внутри клеток
Описание этапа исследования
Длительность этапа в часах
Центрифугирование материала Разрушение клеток, вы- 0,25
ход менингококков в среду и их концентрация
Посев материала на элективную питательную среду для менингококка. с добавлением в ее состав водного раствора коммерческого лизоцима в концентрации 1.10—6—1.10—4 г/мл
Предварительно накопив- 0,02
шийся в клетках менингококк засевают на среду с лизоцимом, который оказывает биостимулирующий эффект
3. Методика выделения возбудителя
3.1. Взятие исследуемого материала проводят в соответствии с общепринятыми инструкциями *.
3.2. Культивирование материала на синтетической среде Игла или среде-199.
Пробирки тщательно моют, прополаскивают дистиллированной водой, просушивают, закрывают ватно-марлевыми пробками и автоклавируют. Среду разливают стерильно по 0,5—1,0 мл в пробирки. Хранят при +4—6° С в течение 2—3 суток. Перед посевом материала пробирки со средой нагревают при 37° С в течение 20—30 минут. Стерильной пастеровской пипеткой 0,3—0,5 мл осадка спинномозговой жидкости засевают в пробирку со средой и культивируют при 37°С в течение 2,5—3 часов.
3.3. Посев исследуемого материала на плотную электир-ную питательную среду.
Пробирки с засеянным материалом после культивирования при 37° С в течение 2,5—3 часов центрифугируют при 1000—1500 об/мин в течение 10—15 минут. Стерильной пастеровской пипеткой со дна пробирки берут 0,3—0,5 мл материала и по 2—3 капли засевают в чашки Петри на элективную плотную питательную среду для менингококков с лизоцимом (см. приложение).
Идентификацию выделенной чистой культуры проводят Б соответствии с общепринятыми инструкциями *.
* «Методические указания по бактериологической диагностике менинго* кокковой инфекции и бактериальных менингитов». Приложение № 2 к приказу Минздрава СССР № 98 от 29 января 1981 г,
ВЫДЕЛЕНИЕ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ МЕНИНГОКОККА ОТ БОЛЬНЫХ НАЗОФАРИНГИТОМ И БАКТЕРИОНОСИТЕЛЕЙ
1. Реактивы, приборы, стекло
1.1. Ватный тампон, укрепленный на проволоке, изогнутой под углом 135°.1
1.2. Среда Игла или среда-199 — официнальные среды для культур ткани, выпускаются Свердловским НИИ вирусных инфекций, Московским НИИ вирусных препаратов, Институтом полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР.
1.3. Пробирки, ГОСТ 10515-75, диаметр 15 мм, высота 145—150 мм.
1.4. Термостат.
1.5. Чашки Петри, ГОСТ 7900-56.
1.6. Элективная питательная среда с лизоцимом — см, приложение.
Длительность этапа в часах
Описание этапа исследования
Взятие тампоном исследуемого материала — слизь, гной
В клетках исследуемого 0,02
материала (эпителий,лейкоциты) находится менингококк
Среда Игла или сре- 0,02
да-199 поддерживает жизнеспособность клеток и тем самым способствует накоплению в клетках менингококка
Посеп исследуемого материала на тампоне в сроду Игла или среду-199
2. Схема выделения чистой культуры менингококка
Длительность этапа в часах
Описание этапа исследования
Инкубация посева при 37°С
Размножение менинго- 2,5—3
кокка внутри клеток
Посев с тампона материала на элективную питательную среду для менингококка с добавлением в ее состав водного раствора коммерческого лизоцима в концентрации 1.10—6—1,10—4 г/мл
Предварительно накопив- 0,02
шпйсн в клетках менингококк засевается на питательную среду с лизоцимом, который сказывает б и ости м у л и р у юти й эф -
фект
3. Методика выделения чистой культуры менингококка
3.1. Взятие исследуемого материала про-водят в соответствии с общепринятыми инструкциями 2.
3.2. Культивирование материала на синтетической среде Игла или среде-199.
Пробирки тщательно моют, прополаскивают дистиллированной водой, просушивают, закрывают ватно-марлевыми пробками и автоклавируют. Среду разливают стерильно по 1,5—2,0 мл в пробирки. Хранят при -J-4—6°С в течение 2—3 суток. Перед посевом материала пробирки со средой нагревают при 37° С в течение 20—30 минут.
Тампон с исследуемым материалом помещают в пробирку со средой и культивируют при 37° С в течение 2,5—3 часов. В случае необходимости тампон с исследуемым материалом в среде Игла или среде-199 может транспортироваться в течение 3 часов при температуре не ниже 25° С с последующей инкубацией при 37° С 2,5—3 часа.
3.3. Посев исследуемого материала на плотную элективную питательную среду.
После выдерживания исследуемого материала в термостате в течение 2,5—3 часов тампон отжимают о стенки пробирки изнутри, извлекают из пробирки /и штрихами с отрывом засевают на 0,5 чашки с линкомицнновым (ристоммии2
новым) агаром и 0,5 чашки с сывороточным агаром, содержащим лизоцим *.
Просмотр посевов осуществляется через 24 и 36 часов. На элективной питательной среде с лизоцимом наблюдают типичный рост колоний менингококков.
Отбор подозрительных колоний, выделение чистой культуры и ее идентификацию проводят в соответствии с общепринятыми инструкциями **.
3 А К Л Ю Ч Е 11 И Е
Предложенный метод выделения чистой культуры менингококка показал его очевидные преимущества по сравнению с классическим методом диагностики: в 1,8—2 раза по
высилась частота бактериологического подтверждения диагноза болезни и выявления бактерионосителей.
* Линкомпцниопый (рпстомициновый) агар готовят по общепринятой инструкции «Методические указания по бактериологической диагностике менннгококковон инфекции и бактериальных менингитов», приложение Л'о 2 к приказу Министерства здравоохранения СССР № 98 от 29 января 1981 года. Приготовление сывороточного агара с лизоцимом — см. в приложен мм.
** Приложение № 2 к приказу Минздрава СССР N° 98 от 29 января 1981 года,
9
1
«Применение 0,1% полужидкого сывороточного агара с ристомпцн-ном при обследованиях на менингококковое носительство», Методические рекомендации, Казань, 1977, стр. 5.
2
«Методические указания по бактериологической диагностике ме2 инигококковой инфекции и бактериальных менингитов». Приложение № 2 к приказу Минздрава СССР № 98 от 29 января 1981 года.
