Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

3.1.2. ИНФЕКЦИИ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ

Диагностика коклюша и паракок ноша

Методические рекомендации МР 3.1.2.0072—13

ББК51.9

Д44

Д44 Диагностика коклюша и паракоклюша: Методические рекомендации—М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2013.—56 с.

1.    Разработаны: Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Е. Б. Ежлова. Л. Л. Мельникова.

Н. А. Кошкина): Федеральным бюджетным учреждением науки «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера» (Г. Я. Ценена. Н. Н. Курова): Федеральным бюджетным учреждением науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (С. Б. Яцышина. Т. С. Селезнева.

М. Н. Прадед): Федеральным государственным бюджетным учреждением «Научно-исследовательский институт детских инфекций Федерального медико-биологического агентства» (Ю. В. Лобзин, И. В. Бабаченко).

2.    Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г. Г. Онищенко 24 мая 2013 г.

3.    Введены в действие с момента утверждения.

ББК'51.9

Редакторы Н. В. Кожока. Н. Е. Акопова Технический редактор Е. В. Ломанова

Подписано в печать 25.06.13 Формат 60x88/16    Печ.    л. 3.5

Тираж 200 экз.    Заказ    27

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 127994. Москва. Валковский пер., д. 18. стр. 5. 7

Оригинал-макет подготовлен к печати и тиражирован отделом издательского обеспечения Федерального центра гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора 117105. Москва, Варшавское ш.. 19а

Отделение реализации, тел./факс 8(495)952-50-89

© РосноI ребнад юр, 2013 © Федеральный центр гигиены и

эпидемиологии Роспотребнадзора, 2013

MP 3.1.2.0072—13

тителами к агглютиногенам, в реакции агглютинации (РА) на стекле, а в зарубежной практике - на агглютинации бактериальных клеток моноклональными антителами к фимбриальным антигенам в реакции агглютинации в микропланшете. Для диагностики коклюша в России до настоящего времени используется РА с цельноклеточным днагностику-мом, в которой определяются агглютинирующие антитела, в первую очередь, к агглютиногенам:

•    липополисахарид: в его состав входят два липида: А и X. С Х-фракцией связана биологическая активность липонолнсахарида. Он обладает множественными функциями, в том числе выраженной иммуноген ностью; с ним связывают реактогенность клеточной вакцины;

•    трахеальный цитотоксин - фрагмент пептидогликана клеточной стенки. Обладает разнообразными биологическими свойствами: пирогенность, адъювантность, артритогенность. стимуляция продукции IL-I /п vitro токсин поражает трахеальные эпителиальные клетки и вызывает цилиостаз. При этом нарушается мукоцилиарный клиренс - первая линия защиты, и создаются условия для персистирования инфекции;

•    дермонекротизирующий токсин обладает вазоконстрикторной активностью, у экспериментальных животных вызывает снижение прироста массы тела, атрофию селезенки, ишемические повреждения или некроз кожи. Его роль в заболевании не ясна.

Все вышеперечисленные факторы присутствуют у свежевыделенных штаммов коклюшного микроба. Однако при хранении на искусственных питательных средах проявляется изменчивость возбудителя. Установлено, что в процессе сапрофитнзацни коклюшный микроб проходит четыре фазы: свежевыделенный микроб (гладкий штамм), обладающий высокими вирулентными и иммуногенными свойствами, относится к первой фазе. По мере перехода к четвертой фазе постепенно утрачивается иммуногенность, вирулентность, меняются культурально-биологические свойства.

4. Показании к обследованию

Коклюш - заболевание, продолжающееся минимум две недели, без явлений интоксикации и повышения температуры тела, протекающее с приступообразным кашлем, усиливающимся ночью и по утрам, сопровождающимся покраснением лица, шумными вдохами (репризами), заканчивающимся отхождением вязкой слизи или рвотой в конце приступа кашля.

Лабораторно подтвержденный случай (см. п. 5.1).

11

MP 3.1.2.0072—13

Эпидемиологически связанный случай: случай, при котором пациент имел (имеет) контакт с одним и более больными коклюшем при условии, что хотя бы один случай в цепи передач был подтвержден лабораторно.

Вероятный случай: отвечает клиническому определению случая, лабораторно не подтвержден и не имеет эпидемиологической связи с лабораторно подтвержденным случаем.

Подтвержденный случай: отвечает клиническому определению случая, лабораторно подтвержден и/или имеет эпидемиологическую связь с лабораторно подтвержденным случаем.

Заболевание протекает циклично со сменой ряда периодов.

Инкубационный период продолжается от 3 до 14 дней (в среднем 7—8 дней).

Предсудорожный период - от 3 до 14 дней, проявляется сухим навязчивым кашлем на фоне нормальной температуры тела.

Период судорожного качая (ПСК) - от 2—3 до 6—8 недель и более, характеризуется типичными приступами судорожного кашля, часто сопровождаемого репризами и отхождением мокроты или рвотой после кашля.

Период обратного развития (ранней реконвалесценции) - от 2 до 8 недель, на фоне улучшения самочувствия ребенка кашель становится реже и постепенно теряет типичный характер.

Период реконвалесценции (поздней) - от 2 до 6 месяцев, характеризуется состоянием гиперреактивности с возможным развитием приступообразного кашля при ннтеркуррентных заболеваниях или эмоциональных нагрузках.

4.1. Показания к обследованию на кокшпи в предсудорожном периоде

В предсудорожном периоде обязательно лабораторное подтверждение диагноза методами выявления возбудителя (бактериологическим. ПЦР).

Опорно-диагностические признаки кокшпи а в предсудорожном периоде:

•    контакт с больным коклюшем или длительно кашляющим ребенком (взрослым) в семье или детском учреждении;

•    постепенное начало при удовлетворительном состоянии и хорошем самочувствии больного;

•    нормальная температура тела;

•    сухой навязчивый постепенно усиливающийся кашель;

MP 3.1.2.0072—13

•    отсутствие или слабая выраженность других катаральных явлении, кроме кашля;

•    отсутствие патологических аускультативных н перкуторных изменений в легких;

•    отсутствие эффекта от проводимой симптоматической терапии;

•    появление типичных гематологических изменений - лейкоцитоза с лимфоцнтозом (или изолированного лимфоцнтоза) при нормальной СОЭ.

4.2. Пока sun и я к обследованию на коклюш в периоде судорожного кашля

Диагноз ставится на основании клинико-эпидемиологических и гематологических данных, подтверждается лабораторными методами выявления возбудителя и/или специфических антител.

Основным симптомом этого периода является приступообразный судорожный (спазматический) кашель. Приступ кашля представляет следующие друг за другом дыхательные толчки на выдохе, прерываемые свистящим судорожным вдохом - репризом, возникающим при прохождении воздуха через суженную (вследствие ларингоспазма) голосовую щель. Заканчивается приступ отхождением вязкой, стекловидной мокроты или рвотой. Приступу может предшествовать аура (чувство страха, беспокойство, чихание, першение в горле и др.). Приступы кашля могут быть кратковременными или продолжаться 2—4 мин. Возможны пароксизмы - концентрация присту пов кашля на коротком отрезке времени. При типичном приступе кашля характерен вид больного: лицо краснеет, затем синеет, становится напряженным, набухают кожные вены шеи. лица, головы; отмечается слезотечение. Язык высовывается из ротовой полости до предела, кончик его поднимается кверху. В результате трения уздечки языка о зубы и ее механического перерастяже-ния происходит надрыв или образование язвочки. Надрыв или язвочка уздечки языка - патогномоннчный симптом коклюша. При гладком течении заболевания температура тела остается нормальной.

Характерно постепенное развитие симптомов заболевания с максимальным учащением и утяжелением присту пов судорожного кашля на 2 неделе ПСК; присоединением специфических осложнений на 3 неделе, неспецифических осложнений на фоне развития вторичного иммуноде-фицитного состояния - на 4 неделе ПСК.

Опорно-диагностические притоки коклюша в периоде судорожного кашля:

• характерный эпидемиологический анамнез;

13

MP 3.1.2.0072—13

•    приступообразный судорожный кашель - патогномоничный симптом;

•    характерная динамика кашля от сухого навязчивого до приступообразного судорожного;

•    характерный внешний вид больного (пастозность век, одутловатость липа);

•    нормальная температура тела при гладком течении заболевания;

•    обилие крупно- и среднепузырчатых влажных хрипов в легких, уменьшающихся или исчезающих после присту па кашля;

•    возможны надрыв или язвочка уздечки языка - патогномоничный симптом.

Критерии тяжести коклюша:

•    выраженность симптомов кислородной недостаточности (гипоксии);

•    частота и характер приступов судорожного кашля;

•    наличие рвоты после судорожного кашля;

•    состояние ребенка в межпрнступном периоде;

•    выраженность отечного синдрома;

•    наличие и сроки развития специфических осложнений;

•    выраженность гематологических изменений.

Таблица 4 Характеристика коклюша но формам тяжести

Признаки Форма тяжести легкая среднетяжелая тяжелая гипоксия нет цианоз носогубного треугольника цианоз лица длительность прсдсудорожиого периода 7—14 дней 7—10 дней 3—5 дней частота приступов до 10 в сутки; репризы редко 10—20 в сутки; репризы часто более 20 в сутки; пароксизмы рвота после кашля нет характерна возможна состояние активный, аппетит сохранен активный, аппетит снижен вялый, аппетит отсутствует осложнения нет на 3—4-й неделях с 1 недели лейкоцитоз 10—15 х 109 кл/л до 20—30 х 109 кл/л более 40 х 109 кл/л лимфоцитоз до 70 % 70—80 % более 80 %

Осложнения кок.йота

MP 3.1.2.0072—13

Специфические: эмфизема легких, эмфизема средостения и подкожной клетчатки, ателектазы, коклюшная пневмония, нарушения ритма дыхания (задержки дыхания - до 30 с; остановки - апноэ - более 30 с), нарушение мозгового кровообращения, кровотечения (из носа, заднег-лоточиого пространства, бронхов, наружного слухового прохода), кровоизлияния (в кожу и слизистые оболочки, склеру и сетчатку глаз, головной и спинной мозг), грыжи (пупочная, паховая), выпадение слизистой оболочки прямой кишки, разрывы барабанной перепонки и диафрагмы.

Неспецифические осложнения обусловлены наслоением вторичной бактериальной флоры (пневмония, бронхит, ангина, лимфаденит, отит и др.).

Резидуальные явления: хронические бронхолегочные заболевания (хронический бронхит, бронхоэктатическая болезнь); задержка психомоторного развития, неврозы, судорожный синдром, различные речевые расстройства; энурез; редко - слепота, глухота, парезы, параличи.

4.3. Особенности диагностики кош мши у пациентов разного возраста, с разным вакцинальным статусом

Атипичные формы кошюша

•    Абортивная - период судорожного кашля начинается типично, но заканчивается в течение недели.

•    Стертая - сухой, навязчивый кашель сохраняется весь период заболевания.

•    Бессимптомная (субклиническая) - клинических симптомов нет. но есть высев и/или нарастание титров специфических антител.

Особенности кошюша у детей раннего возраста

•    Преобладают тяжелые и среднетяжелые формы, возможны летальные исходы.

•    Инкубационный и катаральный периоды укорочены.

•    Период судорожного кашля увеличивается до 6—8 недель.

•    У новорождённых детей бывают эквиваленты приступов кашля.

•    Кашель может быть малозвучным, с цианозом лица.

•    Мокроты выделяется меньше, она может выделяться из носа.

•    Геморрагический синдром чаще проявляется кровоизлияниями в

мозг.

•    Состояние в межприступном периоде нарушается чаще.

•    Чаще развиваются специфические и неспецифические осложнения, а также резидуальные явления.

15

MP 3.1.2.0072—13

•    Вторичное ИДС развивается раньше и держится дольше, позже появляется серологический ответ.

Особенности коклюша у привитых детей

•    Преобладают легкие и среднетяжелые формы.

•    Часто встречаются атипичные формы.

•    Инкубационный и катаральный периоды удлиняются до 14 дней.

•    Период судорожного кашля укорачивается до 2 недель.

•    Репризы и рвота после кашля отмечаются реже.

•    Геморрагический и отечный синдромы не характерны.

•    Состояние в межпрнступном периоде нарушается реже.

•    Специфические осложнения редки и не носят угрожающего жизни характера.

•    Резидуальные явления и летальные исходы не регистрируют.

•    Гематологические изменения менее выражены.

•    При бактериологическом обследовании чаще выделяют В. pertussis серотипа 1.0.3.

•    Часто выявляют высокий поствакцинальный титр, что требует обследования в динамике: рост титров антител более интенсивный и проявляется в течение 7—10 дней.

Особенности коклюша у подростков и взрослых

•    Чаше болеют женщины.

•    Преимущественно отмечаются атипичные или легкие формы.

•    Специфические осложнения редки, угрожающие жизни осложнения и летальные исходы не встречаются.

5. Лабораторная диагностика

Лабораторные исследования проводят с диагностической целью и по эпидемическим показаниям:

1)    с диагностической целью:

•    детям, кашляющим в течение 7 дней и более, независимо от указаний на контакт с больным коклюшем;

•    детям с подозрением на коклюш и коклюшеподобные заболевания по клиническим данным:

•    взрослым с подозрением на коклюш и коклюшеподобные заболевания, работающим в родильных домах, детских больницах, санаториях, детских образовательных учреждениях и школах, в т. ч. закрытого типа.

2)    по эпидемическим показаниям (лицам, бывшим в контакте с больным):

MP 3.1.2.0072—13

Содержание

Термины и сокращения.............................................................................................4

1.    Область применения...............................................................................................5

2.    Введение..................................................................................................................6

3.    Характеристика рода Horde tel 1а, биологические свойства возбудителен

коклюша и паракоклюша......................................................................................7

4.    Показания к обследованию..................................................................................11

4.1.    Показания к обследованию на коклюш    в    предел дорожном периоде........12

4.2.1 (оказания к обследованию на коклюш    в    периоде    судорожною кашля... 13

4.3. Особенности диагностики коклюша у пациентов разного возраста, с

разным вакцинальным статусом..................................................................15

5.    Лабораторная диагностика...................................................................................16

5.1.    Критерии лабораторного подтверждения    диагноза....................................17

5.2.    Сроки обследования......................................................................................17

5.3.    Оформление направления материала на исследование..............................18

6.    Бактериологическое исследование......................................................................19

6.1.    Взятие материала...........................................................................................19

6.2.    Доставка материала.......................................................................................21

6.3.    Ход исследования..........................................................................................21

6.4.    Материалы и оборудование..........................................................................27

7.    Полимеразная цепная реакция.............................................................................28

7.1.    Взятие материала...........................................................................................29

7.2.    Доставка и храпение магериала...................................................................31

7.3.11ровсдснис исследования.............................................................................31

7.4.    Материалы и оборудование..........................................................................33

8.    Серологические методы исследования...............................................................37

8.1.    Взятие материала...........................................................................................38

8.2.    Доставка и хранение материала...................................................................39

8.3.    Реакция агглютинации..................................................................................39

8.4.    Иммунофсрмснтный анализ.........................................................................40

8.5.    Иммуноблот...................................................................................................41

9.    Нормативно-методические ссылки.....................................................................42

Приложение I. Алгоритм выбора метода лабораторной диагностики................44

Приложение 2. Приготовление и стерилизация тампонов....................................45

Приложение 3. Приготовление питательных сред с добавками...........................46

Приложение 4. Определение содержания аминного азота...................................48

Приложение 5. Проверка качества казеиново-угольного агара............................50

Приложение б. 11риготовление сред и реактивов для биохимической

идентификации бордетелл.............................................................52

Приложение 7. Хранение культур бордетелл.........................................................53

Приложение 8. Журнал по бактериологической диагностике коклюша.............55

Приложение 9. Методика проведения смывов с целью контроля

контаминации лаборатории продуктами    ПЦР.............................56

3

МР 3.1.2.0072—13

Термины и сокращения

АКДС - адсорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения

ГОСТ - Государственный стандарт

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИФА - иммуноферментный анализ

КУА- казеиново-угольный агар

ME - международные единицы

МУ - методические указания

ОРВИ - острая респираторная вирусная инфекция

ПСК - период судорожного кашля

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РА - реакция агглютинации

РИФ - реакция иммунофлуоресценции

РНК - рибонуклеиновая кислота

СанПиН - санитарно-эпидемиологические правила и нормы

СОЭ - скорость оседания эритроцитов

СП - санитарно-эпидемиологические правила

ТЕ - буфер Трис-ЭДТА

ТУ - технические условия

ФС - фармакопейная статья

цАМФ - циклический аденозин монофосфат

ELIS А - enzyme-linked immunosorbent assay (разновидность ИФА)

Ig - иммуноглобулин 1L - интерлейкин

FHA - filamentous haemagglutinin (филаментозный гемагглютинин) NASBA - nucleic acid sequence-based amplification (метод амплификации РНК)

РТ - pertussis toxin (коклюшный токсин)

RS-инфекция - инфекция, вызванная респираторно-синцитиальным вирусом

4

MP 3.1.2.0072—13

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г. Г. Онищенко

24 мая 2013 г.

Дата введения: с момента утверждения

3.1.2. ИНФЕКЦИИ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ

Диагностика коклюша и наракоклюша

Методические рекомендации МР 3.1.2.0072—13

1. Область применения

В методических рекомендациях представлена современная микробиологическая характеристика коклюша в условиях массовой вакцино-профилактики. В них содержится краткое описание рода Bordetella, включая новые виды, открытые в последнее десятилетие, более детальная характеристика биологических свойств В. pertussis, В. parapertussis и В. bronchiseptica, описание бактериологического метода исследования с использованием приемов, повышающих его информативность, современных методов лабораторной диагностики: ПЦР и ИФА. Представлены алгоритмы диагностики коклюша в зависимости от вакцинального статуса. возраста и сроков заболевания пациентов. Цель настоящих методических рекомендаций - унифицировать подходы к лабораторной диагностике коклюшной инфекции.

Методические рекомендации предназначены для специатистов органов и организаций Роспотребнадзора (микробиологов, эпидемиологов). специалистов по клинической лабораторной диагностике, инфекционистов. педиатров, семейных врачей и врачей общей практики.

5

MP 3.1.2.0072—13

2. Введение

В довакцинальную эру коклюш занимал второе место среди детских капельных инфекций по уровню заболеваемости и первое по уровню смертности. В настоящее время в мире ежегодно заболевает несколько миллионов человек, умирает около 200 тыс. (в 2008 г. - 16 млн заболевших, 195 тыс. смертей).

Специфическая профилактика коклюша, проводимая в нашей стране с 1959 года, отчетливо повлияла на эпидемический процесс, биологические свойства возбудителя и клинику. Этапы массовой иммунизации характеризовались различным уровнем охвата детей прививками против коклюша н, в соответствии с этим, менялась эпидемиологическая обстановка. Низкий уровень иммунизации в 90-е годы привел к росту заболеваемости коклюшем. Достижение охвата прививками детей первою года жизни (более 95 %) в последующие годы и поддержание его на этом уровне обеспечило не только снижение заболеваемости коклюшем, но и с 2001 г. стабилизацию показателей на минимальном уровне (3,2—5,7 на 100 тыс. населения). Особенностью эпидемического процесса коклюша на фоне высокого охвата прививками детей раннего возраста является возникновение периодических подъемов. Это объясняется недостаточной напряженностью и длительностью поствакцинального иммунитета, создаваемого в условиях нередкого нарушения календаря прививок, в частности, несоблюдения сроков вакцинации и интервалов между введениями доз вакцины и проведением ревакцинации, что способствует накоплению значительного числа неиммунных лиц. Увеличение охвата прививками привело в настоящее время к изменению возрастной структуры лиц, заболевших коклюшем. Большинство заболевших составляют школьники 7—14 лет - до 50,0 %. дети 3—6 лет - до 25.0 %. наименьшую долю - дети в возрасте 1—2 лет - 11.0 % и дети до 1 года - 14,0 %. 13 периоды подъема заболеваемости коклюшем интенсивность эпидемического процесса определяется заболеваемостью детей школьного возраста. Темпы роста в этой группе увеличиваются в 2—3 раза. Из числа лиц. заболевших коклюшем, 65.0 % составляют привитые.

Поствакцинальный иммунитет не предохраняет от заболевания. Коклюш в этих случаях протекает в виде легких и стертых форм инфекции, которые диагностируются, в основном, ретроспективно (серологически). После перенесенного заболевания остается более длительный иммунитет.

Истинная заболеваемость коклюшем значительно выше за счет не-днагностированной коклюшной инфекции (легких и стертых клиничес-

MP 3.1.2.0072—13

ких форм). Трудности клинической диагностики коклюша на ранних стадиях заболевания, отсутствие обследования всех длительно (свыше 7 дней) кашляющих или его проведение на поздних сроках заболевания, а также после продолжительного лечения антибактериальными препаратами приводит к низкому проценту выявляемости возбудителя инфекции. Уровень бактериологического подтверждения диагноза составляет 10—20%. Современные методы исследования позволяют проводить раннюю диагностику заболевания (ПЦР) и существенно облегчают постановку диагноза (ПЦР, ИФА).

Таким образом, коклюш в нашей стране требует пристального внимания со стороны врачей различных специальностей. Своевременная и качественная лабораторная диагностика коклюшной инфекции позволит избежать ошибок в постановке диагноза и будет способствовать эффективной терапии.

3. Характеристика рода Bordetella, биологические свойства возбудителей коклюша и пара коклюша

Род Bordetella относится к семейству Alcaligenaceae и включает 9 видов: В. ansorpii, В. avium. В. bronchiseptica, В. hinzii, В. holmesii, В. parapertussis, В. pertussis, В. pelrii, В. trematит. Первой (в 1908 г.) была описана В. pertussis, бактерия патогенна для человека и является возбудителем коклюша. В. parapertussis была описана в 1938 г., вызывает у людей паракоклюш (коклюшеподобное заболевание), она также была выделена от овец. В. bronchiseptica была описана в 1911 г., является возбудителем заболеваний дыхательных путей у многих млекопитающих (кашля у собак, атрофического ринита у свиней и др.), но встречается также бессимптомное носительство. У человека редко вызывает заболевание, однако описаны случаи, когда у пожилых людей, заразившихся от домашних животных (кроликов), В. bronchiseptica вызывала длительный кашель. В. avium описана в 1984 г., является возбудителем ринотра-хеита у птиц. Описано несколько случаев выделения В. avium от пожилых пациентов с отягощенным анамнезом, с клинической картиной пневмонии. 13 1995 г. были описаны сразу два новых вида: В. hinzii и В. holmesii. В. hinzii колонизирует дыхательные пути домашней птицы, была выделена от нммуноскомпрометированных пациентов, описан случай летальной септицемии. В. holmesii выделялась только от людей, обнаруживалась в мокроте, несколько раз в крови, этиологическая роль в развитии инфекций не доказана. В 1996 г. выделена В. trematum, возбудитель вызывает раневые и ушные инфекции. В 2001 г. была описана В. petrii, единственный представитель рода, выделенный из окружаю-

7

щей среды и способный жить в анаэробных условиях. В 2005 г. была выделена В. ansorpii, описано несколько случаев выделения от пациентов с онкологическими заболеваниями (из гнойного содержимого эпидермальной кисты, из крови).

Морфологические и культуральные свойства

Бактерии рода Bordetellae - мелкие (0,2—0,5 мк.м х 0,5—2,0 мкм) грамотрицательные коккобациллы. В мазках - часто биполярно окрашенные, одиночные или в парах, реже в цепочках, имеют нежную капсулу. Все, за исключением В. petrii, - строгие аэробы. Температура выращивания бордетелл 35—37 °С (оптимально 35 °С). Бордетеллы требовательны к условиям роста: 130—150 мг % аминного азота, кровь, дрожжевой экстракт, никотиновая кислота, аминокислоты (цистин, про-лин, метионин, серин, глютамин и др.): наиболее требователен возбудитель коклюша, он растет только на специальных средах, в то время как остальные представители рода растут на кровяном агаре. Классической средой для первичного выделения В. pertussis является среда Борде-Жангу (картофельно-глицериновый агар), позднее были предложены синтетические и полусинтетические среды, в частности, казеиновоугольный агар (КУА). На указанных средах бордетеллы вырастают в виде характерных колоний: на среде Борде-Жангу - выпуклые, гладкие, блестящие, серебряного цвета, напоминающие капли ртути, окруженные зоной гемолиза; на КУА - выпуклые, гладкие, серого цвета с жемчужным, желтоватым или беловатым оттенком. Колонии маслянистые, легко снимаются петлей. В. parapertussis и В. holmesii за счет образования пигмента вызывают потемнение сред с кровью, образуют бурую подложку.

Таблица 1

Ростовые характеристики основных видов бордетелл

В. pertussis В. parapertussis В. bronchisepti-са Время, необходимое для появления колоний (сут.): -    на КУА (бордетелагар) -    на среде Борде-Жангу 2— 3 3— 6 1—2 2—3 18—24ч 1—2 Размер колоний на КУА 1—2 мм 2—3 мм 4 мм Рост на простом агаре + +

Устойчивость: возбудители коклюша и паракоклюша - облигатные паразиты, нестойкие. Погибают при прогревании до 50 °С за

MP 3.1.2.0072—13

30 мин, при обработке дезинфицирующими растворами. Во внешней среде не сохраняются. Устойчивы ко многим антибиотикам.

Биохимические свойства

Основные биохимические свойства бордетелл, которые используются в практической работе при изучении выделенных культур, представлены в табл. 2.

Таблица 2

Дифференцирующие ирншикн видов рода Bordetella

Рост на кровяном агаре Окси- даза Уреаза Тирози- наза Восста новление нитратов Утили зация цит ратов 11одвнж двнж- ность И. pertussis + Н. parapertussis + + + Н. bronchiseptica + + +* + + + Н. avium + + + + И. hinsii + + ± + + Н. Iwlmesii + + И. tremannn + ± + И. />elrii + + + И. ansorpii + + + * - через 4 часа

И. pertussis наименее активна ферментативно (положительный тест на оксидазу). В. parapertussis вырабатывает ферменты тирозиназу и уре-азу и не образует оксидазы. Тирозиназа катализирует продукцию пигментов из тирозина, содержащегося в питательных средах, что вызывает их потемнение. Наиболее активна В. bronchiseptica: вырабатывает уреа-зу. оксидазу, утилизирует цитраты, восстанавливает нитраты до нитритов.

Антигенное строение и серологическая характеристика К факторам патогенности И. pertussis в первую очередь относят коклюшный токсин. Это экзотоксин, белок с молекулярной массой 117 ООО Да, состоящий из двух функциональных частей (А и В) и пяти структурных субъединиц (S1—S5): фрагмент А (соответствует субъединице S1) - обладает ферментативной активностью, ингибирует клеточную аденилатциклазу. Участок В (состоит из субъединиц S2—S5) отвечает за присоединение токсина к рецепторам клеток-мишеней. Токсин обладает высокой иммуногенностью, в инактивированной форме вкпю-

9

чен в состав всех бесклеточных коклюшных вакцин. Определение антител к коклюшному токсину методом ИФА применяется для диагностики коклюша и контроля эффективности вакцинации.

Филаментотыи гемагглютинин - поверхностный белок, участвующий в адгезии, обладает протективными свойствами. Включен в состав бесклеточных коклюшных вакцин. В ряде коммерческих ИФА-тсст-систем для диагностики коклюша предлагается определять уровень антител различных классов к антигенному комплексу, в состав которого входят гемагглютинин и коклюшный токсин. В отличие от токсина, ге-магглютинин нс является строго специфичным для В. pertussis, присутствует также у В. parapertussis, может давать перекрестные реакции с Н. influenzae, С. pneumoniae и рядом других бактерий.

Пертактин - белок наружной мембраны, относится к системе ад-гезинов, продуцируемых бактериями при попадании в человеческий организм. Обладает протективными свойствами, входит в состав ряда бесклеточных коклюшных вакцин.

Лдетиапщиклаза-гемолизин - это комплекс экзофермента аде-ннлатциклазы, которая при попадании в клетки катализирует образование цАМФ. с токсином - гемолизином. Токсин - основной фактор патогенности, действующий на начальном этапе инфекции, кроме того, с ним связывают протективные свойства комплекса.

Агглютиногены - поверхностные белки, ответственные за выработку агглютинирующих антител. У бордетелл выделено 16 агглютиногенов (табл. 3).

Таблица 3

Агглютиногены бордетелл

	Общеродовой	Видовые	Внутривидовые (штаммовыс)
В. pertussis	7	1	1,2, 3.4. 5. 6. 13. 15. 16
В. fxirapertussis		14	8.9, 10
В. branch iseptica		12	8.9, 10, 11

В зависимости от наличия в бактериальной клетке агглютиногенов 2 и 3 выделяют четыре серотипа В. pertussis: 1.2.0; 1.0.3; 1.2.3; 1.0.0. Понятие об агглютиногенах тесно связано с фимбриями (Fim). В геноме всех В. pertussis присутствуют гены ft m2 и /ниЗ, то есть теоретически любой штамм может продуцировать агглютиногены 2 и/нли 3. Фимбрии включены в состав некоторых бесклеточных коклюшных вакцин. Серо-типирование В. pertussis в отечественной практике основано на агглютинации бактериальных клеток монофакторными сыворотками, т. е. ан-