Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование _Российской    Федерации_

3.1. ЭПИДЕМИОЛОГИЯ. ПРОФИЛАКТИКА ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ

Лабораторная диагностика гриппа и других ОРВИ методом полимеразной цепной реакции

Методические рекомендации МР 3.1.0117—17

Издание официальное

Москва *2018

Федеральная служба но надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека

3.1. ЭПИДЕМИОЛОГИЯ. ПРОФИЛАКТИКА ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ

Лабораторная диагностика гриппа и других ОРВИ методом полимеразной цепной реакции

Методические рекомендации МР 3.1.0117—17

3.1.3.    Некоторые виды биологического материала требуют предварительной обработки, заключающейся в гомогенизации (например, секционный материал), снижении вязкости (например, густая и неоднородная по консистенции мокрота) и фракционировании путем центрифугирования.

3.1.4.    Непосредственно ПЦР-исследование состоит из нескольких этапов:

-    экстракция нуклеиновых кислот (РНК/ДНК) из исследуемых образцов исследуемого биологического материала;

-    в случае если геном возбудителя состоит из РНК, требуется получение кДНК в реакции ОТ;

-    амплификация ДНК (или кДНК) при помощи специфичных к гену-мишени праймеров и фермента Taq-полимеразы;

-    детекция, анализ и интерпретация результатов.

3.1.5.    На этапе экстракции исследуемый образец обрабатывается лизирующим раствором, в результате чего происходит деструкция клеточных мембран, вирусных оболочек и других биополимерных комплексов и высвобождение НК. С целью очистки (устранения ингибиторов ПЦР) используются различные методы экстракции НК, включая автоматизированные. Один из методов основан на принципе неселективного или селективного прикрепления НК к сорбентам с последующей их отмывкой и элюцией НК с сорбентов в буферный раствор. Существуют варианты с использованием сорбентов, содержащих частицы железа; в таком случае фракционирование возможно с применением магнитных штативов или автоматических станций. Сорбция также может проводиться на мембраны специальных колонок при центрифугировании раствора, содержащего НК, или при помощи вакуумного насоса. В основе другого метода выделения лежит принцип высаливания (выпадения в осадок) НК из растворов при добавлении спиртов в присутствии солей в высокой концентрации. Экстракция РНК из исследуемого материала проводится в присутствии ВКО, что позволяет контролировать выполнение процедуры исследования для каждого образца на всех этапах. Внутренний контроль может быть экзогенным (в этом случае препарат ВКО добавляется в исследуемый образец на этапе экстракции) и эндогенным (в реакции ПЦР используются праймеры для амплификации геномной ДНК/кДНК человека). Для ПЦР-исследования образцов на наличие возбудителей, геном которых состоит из РНК, используется препарат ВКО, представляющий собой молекулу РНК, защищенную оболочкой белка. На этапе экстракции получают РНК ВКО, затем проводится получение, амплификация кДНК ВКО и его детекция.

3.1.6.    Реакция обратной транскрипции может проводиться в двух вариантах: как отдельный этап или совмещенная с амплификацией. Если ОТ проводится отдельным этапом, для инициации синтеза кДНК на молекулах РНК используются гексамеры случайной последовательности (рэндом-праймеры), фермент обратная транскриптаза и другие специальные реагенты. В результате такой реакции образуется кДНК на основе матриц всех РНК, присутствующих в растворе, полученном на этапе экстракции нуклеиновых кислот из исследуемого образца. В случае если ОТ совмещена в одной реакции (программе) с ПЦР, реагенты для ОТ входят в состав подготовленной смеси для амплификации, к которой добавляют РНК; в результате образуется только кДНК, синтез которой инициируется участвующим в ПЦР праймером. Первый вариант более удобен при необходимости постановки большого количества ПЦР (более трех): в диагностических целях для обнаружения широкого спектра возбудителей для каждого пациента, при проведении эпидемиологического мониторинга, при расследовании случаев группового заболевания или выяснения этиологии тяжелого (атипичного) или летального случая, а также при необходимости последующего субтипирования положительных образцов (например, при гриппе).

По сравнению с РНК кДНК более стабильна, она может более длительно храниться без замораживания при температуре от 2 до 8 °С - в течение недели (при условии проведения ОТ в пробирках, имеющих специальную маркировку «RNase-free», «DNase-free», что означает «свободные от РНКаз и ДНКаз-ферментов, разрушающих РНК и ДНК», или подвергшихся автоклавированию), а также при температуре от минус 24 до минус 16 °С - в течение 6 месяцев или при температуре не выше минус 68 °С - в течение года. Допустимо однократное повторное замораживание кДНК. РНК следует использовать сразу после ее получения. При необходимости хранения РНК не позднее 30 мин после экстракции ее следует перенести в стерильные пробирки и хранить при температуре не выше минус 16 °С в течение месяца и более длительно при температуре не выше минус 68 °С, причем повторное замораживание РНК не допускается. Отдельный этап ОТ также удобен в случае подозрения на инфекцию, вызванную возбудителем второй группы опасности (ТОРС, высоко патогенный грипп птиц), когда манипуляции с биологическим материалом (предварительная обработка, экстракция НК) и ОТ проводятся в помещениях, оборудованных для работы с возбудителем второй группы опасности, а далее кДНК, при необходимости, может быть передана для проведения ПЦР в помещения, оборудованные для работы с возбудителями III—IV групп опасности.

3.1.7.    Для диагностики ОРВИ применяются варианты ПЦР, различающиеся способом детекции фрагментов амплификации: ПЦР с детек-

цией методом электрофореза, с флуоресцентной детекцией с использованием интеркалирующих красителей, с гибридизационно-флуоресцент-ной детекцией с использованием конъюгированных с флуоресцентной меткой зондов в режиме реального времени (ПЦР-РВ или FRT) и по окончании ПЦР (ПЦР-КТ или FEP). Из всех вариантов наибольшую специфичность и возможность мультиплексирования (обнаружения в одной реакции нескольких генов-мишеней различных микроорганизмов) обеспечивает гибридизационно-флуоресцентная детекция с использованием конъюгированного с флуоресцентной меткой зонда, который присутствует в составе реакционной смеси и гибридизуется с комплементарным участком амплифицируемой кДНК-мишени, в результате чего происходит нарастание интенсивности флуоресценции. Это позволяет регистрировать накопление специфического продукта амплификации путем измерения интенсивности флуоресцентного сигнала. Детекция флуоресцентного сигнала при использовании формата ПЦР-КТ осуществляется после окончания ПЦР с помощью флуоресцентного ПЦР-детектора, а при использовании формата ПЦР-РВ - непосредственно в ходе ПЦР с помощью амплификатора с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени» с двумя-шестью оптическими каналами. Специфичность амплификации также обеспечивается «горячим стартом», когда реакция начинается не ранее этапа денатурации НК при разделении ее компонентов восковой перегородкой, которая плавится при 95 °С, либо использованием химически модифицированных Taq-полимераз, активирущихся при прогреве реакционной смеси при 95 °С.

3.1.8.    С целью контроля качества проведения ПЦР необходимо использовать контрольные реакции, в которых участвуют положительные и отрицательные контрольные образцы для различных этапов ПЦР-анализа.

3.1.9.    Анализ результатов различается в зависимости от варианта ПЦР. Для некоторых вариантов ПЦР требуется дополнительное оборудование (например, для разделения ДНК методом электрофореза, визуализации ДНК в агарозном геле и детекции флуоресценции при Г1ЦР-КТ). В формате электрофоретической детекции ПЦР требует особых мер предотвращения контаминации (ложноположительных результатов), достигаемых проведением специальных мероприятий и соблюдением особых правил организации лаборатории согласно МУ 1.3.2569—09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I—IV групп патогенности». Для правильной интерпретации результатов обязательно использование положительных и отрицатель-

ных контрольных реакций для всех этапов анализа. С целью упрощения и ускорения этого этапа можно использовать специальное программное обеспечение, рекомендованное производителем конкретного диагностического набора реагентов.

3.1.10.    По результатам анализа выдают ответ о наличии в пробе специфических фрагментов ДНК или РНК генома возбудителя инфекционного заболевания. Результаты ПЦР-исследования должны учитываться в совокупности с результатами других методов в комплексной диагностике заболевания.

3.1.11.    При диагностике вирусных инфекций дыхательных путей информация о количестве возбудителя не имеет большого значения: с одной стороны, концентрация возбудителя в респираторных мазках весьма условно свидетельствует о тяжести заболевания и, с другой стороны, больше зависит от способа и правильности получения биологического материала. В связи с этим количественные тесты не имеют большого смысла, они более затратны и поэтому не востребованы. Преимуществом могут пользоваться тесты, обеспечивающие большую мультиплексность анализа, то есть возможность обнаруживать большое количество значимых возбудителей в одной ПЦР при приемлемой чувствительности.

3.1.12.    Залогом достоверности ПЦР-анализа при идентификации и субтипировании конкретного возбудителя ОРВИ является правильный выбор гена-мишени, олигонуклеотидов, комплементарных мишеней и параметров ПЦР, а также экспериментальная оценка аналитических и диагностических характеристик. Поскольку вирусы подвержены большой изменчивости, гены-мишени должны быть консервативными в пределах одного вида вируса. Как правило, это гены, кодирующие матрикс-ный протеин, нуклеопротеин, неструктурные белки, или нетранслируе-мые области генома.

3.1.13.    Аналитические и диагностические характеристики (специфичность и чувствительность) анализа должны обязательно оцениваться при разработке и подтверждаться при регистрации наборов реагентов, после чего они разрешаются к использованию в целях диагностики. Важно учитывать, что характеристики диагностических наборов, установленные разработчиком, будут воспроизводиться только при условии соблюдения всех требований и рекомендаций, включая использование оборудования, комплектов реагентов, соблюдение всех этапов и процедур исследования от момента сбора биологического материала до интерпретации результатов.

3.1.14.    ПЦР-исследования (работы с использованием методов амплификации НК при исследовании материала, содержащего (лодозри-

тельного на содержание) микроорганизмы I—IV групп патогенности (опасности) проводят в организациях, имеющих лицензии на данный вид деятельности и аккредитованных в соответствии с законодательством Российской Федерации.

3.2. Показания к применению метода

3.2.1.    Диагностика гриппа и других ОРВИ методом полимеразной цепной реакции может эффективно применяться для решения различных эпидемиологических задач:

-Определение этиологии острой инфекции верхних дыхательных путей при проведении мониторинга.

-Определение этиологии острой инфекции нижних дыхательных путей при проведении мониторинга.

-    Изучение этиологии группового заболевания ОРЗ в целях проведения соответствующих профилактических и лечебных мероприятий.

-Проведение исследований при подозрении на инфекцию, вызванную вирусами, относящимися к I и II группам опасности (коронави-русы SARS, MERS, вирус гриппа птиц, высоко патогенный вирус гриппа), связанную с завозом из неблагополучных регионов мира.

-    Лабораторное исследование с целью подтверждения случая гриппа (или другой ОРВИ) с летальным исходом.

-    Проведение ПЦР-анализа как ускоренного предварительного теста с целью последующего выделения культуры вируса с использованием культурального метода исследования.

-    С целью идентификации и типирования культур вирусов.

3.2.2.    ПЦР может эффективно использоваться в инфекционных стационарах для выяснения природы похожих но клиническим проявлениям, но отличных по этиологии острых респираторных вирусных заболеваний в целях:

-    раннего назначения специфических средств этиотропной терапии;

-    прогнозирования тяжести развития заболеваний;

-рационального размещения больных по этиологическому принципу (во избежание перекрестного внутрибольничного инфицирования).

3.2.3.    Общими показаниями для лабораторного обследования с целью проведения этиологической диагностики ОРВИ является наличие у пациента остро возникшего заболевания с локальными симптомами поражения дыхательных путей при наличии синдрома общей интоксикации.

IV. Биологический материал для исследования

4.1. Перечень биологического материала для исследования

4.1.1.    С целью выяснения этиологического агента (агентов) инфекции верхних дыхательных путей исследуются мазки со слизистой оболочки носоглотки и задней стенки ротоглотки. Максимальная концентрация вирусов в этих отделах достигается на 2-й—3-й день от момента появления симптомов заболевания. В связи с этим брать материал для исследования предпочтительно именно в эти указанные сроки. В то же время метод ГПДР позволяет обнаружить НК возбудителя и гораздо позднее - в среднем до 7 дней, и максимум - до 2 недель от начала заболевания (при условии сохранении признаков поражения верхних дыхательных путей). Тем не менее у госпитализированных пациентов материал для исследования следует собирать как можно раньше при поступлении (не позднее вторых суток), поскольку в более поздние сроки не исключена возможность суперинфекции при контакте с другими пациентами.

4.1.2.    Материал берут после полоскания полости рта кипяченой водой комнатной температуры. Если полость носа заполнена слизью, перед процедурой рекомендуется провести высмаркивание. В течение <3 часов перед процедурой нельзя использовать медикаменты, орошающие носоглотку' или ротоглотку, и препараты для рассасывания во рту. Мазки у пациента берут двумя разными зондами: сначала со слизистой нижнего носового хода, а затем из ротоглотки, при этом концы зондов с тампонами после взятия мазков последовательно помещаются в одну пробирку объемом 1,5—-2,0 мл с 0,5 мл транспортной среды.

4.1.3.    С целью выяснения этиологического агента (агентов) инфекции нижних дыхательных путей исследуется: мокрота (при глубоком откашливании), плевральная жидкость, аспираты из трахеи, получаемые с помощью хирургического (вакуумного или электрического) отсоса, бронхо-альвеолярный лаваж (БАЛ) или промывные воды бронхов, получаемые с помощью фибробронхоскопии, мокрота (откашливаемая свободно или откашливаемая после индукции ингаляцией стерильного 5%-го раствора натрия хлорида через небулайзер, или полученная аспирацией из трахеи).

4.1.4.    В случае невозможности получения материала из нижних дыхательных путей при исследовании на респираторные вирусы допустимо использование мазков из верхних дыхательных путей (мазки со слизистой носоглотки из нижнего носового хода и мазки со слизистой задней стенки ротоглотки).

4.2. Методика получения биологического материала и условия хранения

4.2.1.    У детей мазки со слизистой носоглотки берут сухим стерильным назофарингеальным велюр-тампоном на пластиковом аппликаторе. Зонд вводят легким движением по наружной стенке носа на глубину 2—3 см до нижней раковины, слегка опускают книзу, вводят в нижний носовой ход под нижнюю носовую раковину, делают вращательное движение и удаляют вдоль наружной стенки носа. Общая глубина введения зонда должна составлять примерно половину расстояния от ноздри до ушного отверстия (3—4 см для детей). После сбора материала конец зонда с тампоном опускают в стерильную одноразовую пробирку с транспортной средой до места слома, при этом гибкая часть зонда складывается в три раза, далее, прикрывая сверху пробирку' крышкой, рукоятку зонда опускают вниз, добиваясь полного отламывания верхней части зонда. Пробирку герметично закрывают.

4.2.2.    У взрослых мазки со слизистой носоглотки берут сухим стерильным назофарингеальным велюр-тампоном на пластиковом аппликаторе (допустимо использовать сухой стерильный зонд из полистирола с вискозным тампоном). Зонд вводят легким движением по наружной стенке носа на глубину 2—3 см до нижней раковины, слегка опускают книзу, вводят в нижний носовой ход под нижнюю носовую раковину, делают вращательное движение и удаляют вдоль наружной стенки носа. Общая глубина введения зонда должна составлять примерно половину' расстояния от ноздри до ушного отверстия (5—6 см для взрослых). После забора материала конец зонда с тампоном опускают на глубину 1 см в стерильную одноразовую пробирку с транспортной средой, конец зонда отламывают движениями вниз/вверх/вниз, придерживая крышкой пробирки. Пробирку герметично закрывают.

4.2.3.    Мазки из ротоглотки берут сухим стерильным зондом из полистирола с вискозным тампоном вращательными движениями с поверхности миндалин, небных дужек и задней стенки ротоглотки, аккуратно прижимая язык пациента шпателем. После забора материала рабочую часть зонда с тампоном (1 см) помещают в пробирку с транспортной средой и зондом с мазком из носоглотки. Конец зонда отламывают движениями вниз/вверх/вниз, придерживая крышкой пробирки с расчетом, чтобы он позволил плотно закрыть пробирку. Допускается хранение в течение трех суток при температуре 2—8 °С, более длительно - при температуре не выше минус 16 °С.

4.2.4.    Мокроту при глубоком откашливании собирают в стерильные одноразовые герметично закрывающиеся контейнеры натощак по-

еле чистки зубов и полоскания полости рта водой. Пациента просят сделать несколько глубоких вдохов с задержкой дыхания на несколько секунд, затем с силой выдохнуть, что способствует появлению продуктивного кашля и очищению верхних дыхательных путей от мокроты. Мокроту' помещают в стерильные одноразовые пластиковые контейнеры. Допускается хранение в течение 1 суток при температуре от 2 до 8 °С, более длительно - при температуре не выше минус 16 °С.

4.2.5.    Получение трахеального аспирата проводят натощак после чистки зубов и полоскания полости рта водой. Пациента просят сделать несколько глубоких вдохов с задержкой дыхания на несколько секунд, затем с силой выдохнуть. Это способствует появлению продуктивного кашля и очищению верхних дыхательных путей от мокроты. После присоединения мукус-экстрактора через трубку-переходник к отсосу катетер для забора трахеального аспирата вводится в глотку через полость рта. Вследствие раздражения слизистой в области голосовой щели провоцируется кашлевой рефлекс и проводится извлечение трахеального содержимого через стерильный катетер (6 или 7 размера) с помощью вакуумного отсоса. Объем трахеального аспирата должен составлять не менее 3—5 мл; аспират помещают в стерильные одноразовые пластиковые контейнеры.

Допускается хранение в течение 1 суток при температуре от 2 до 8 °С, более длительно - при температуре не выше минус 16 °С.

4.2.6.    Получение индуцированной мокроты. С целью облегчения отхождения мокроты используют упражнения дыхательной гимнастики и вибрационный массаж грудной клетки. Наибольшего эффекта достигают с помощью ингаляций с использованием гипертонического раствора хлорида натрия. Перед процедурой целесообразно ввести 200 мкг сальбутамола через дозирующий ингалятор для предотвращения бронхоспазма. Затем в течение 15 минут через струйный небулайзер (аэрозольный аппарат) подается кислород со скоростью 5 л/мин с 5 мл 5%-го стерильного раствора натрия хлорида. После этого проводится постукивание по передней и задней стенкам грудной клетки с целью стимуляции отхождения мокроты. Затем пациента просят хорошо откашляться и собрать мокроту из нижних дыхательных путей (не слюну!) в стерильный контейнер. Объем образца мокроты должен быть не менее 3 мл (для взрослых и около 1 мл для детей).

У пациентов с бронхиальной астмой ингаляции должны проводиться с осторожностью, для предупреждения бронхоспазма, целесообразно предварительно провести ингаляцию 200—400 мкг сальбутамола.

В случае если мокрота не откашливается, процедуру рекомендуется комбинировать с последующим получением аспиратов из трахеи с це-

лью извлечения содержимого из трахеи с помощью стандартного отсоса с использованием стерильного катетера 6-го или 7-го размера.

Допускается хранение в течение 1 суток при температуре от 2 до 8 °С, более длительно - при температуре не выше минус 16 °С.

4.2.7. В случае летального исхода исследуется посмертный (аутоп-сийный) материал.

Аутопсийный материал забирают стерильным индивидуальным инструментом из зоны поврежденной ткани объемом 1—3 см^? стерильными инструментами (индивидуально для каждого органа), помещают в одноразовые стерильные пластиковые контейнеры с герметично завинчивающейся крышкой, замораживают и хранят при температуре не выше минус 16 °С.

Исследуется аутопсийный материал следующих органов: фрагменты пораженной части трахеи, пораженной части бронхов, пораженной части легких, выпот плевральной полости (при его наличии), фрагменты селезенки, пораженной части миокарда (при наличии поражения), мягких мозговых оболочек, коры больших полушарий (при наличии менингеальной симптоматики в анамнезе), а при наличии очаговых изменений - аутоптаты с границ данных участков.

Материал для исследования должен быть нативным (без фиксации формалином).

4.3. Сбор биологического материала для ПЦР как предварительного теста с целью последующего выделения культуры вируса с использованием культурального метода

4.3.1. Мазки из носоглотки для вирусологической диагностики гриппа собирают стерильными зондами с вискозными тампонами со слизистой оболочки из нижнего носового хода. Зонд с тампоном вводят легким движением по наружной стенке носа на глубину 2—3 см до нижней раковины, слегка опускают книзу, вводят в нижний носовой ход глубоко, делают вращательное движение и удаляют вдоль наружной стенки носа. Общая глубина введения зонда должна составлять примерно половину расстояния от ноздри до ушного отверстия (3—4 см для детей и 5—6 см для взрослых). После взятия материала тампон, не нарушая стерильности, помещают в пробирку с 2,0—5,0 мл вирусологической транспортной среды, рекомендованной в МР «Выделение вирусов гриппа в клеточных культурах и куриных эмбрионах и их идентификация». После приготовления вирусологическую транспортную среду аликвотируют в одноразовые стерильные пробирки из полипропилена стерильным наконечником в стерильных условиях (в ламинарном боксе) по 1,0 мл (при использовании пробирок объемом 1,5 мл), по

1,5 мл (при использовании пробирок объемом 2 мл) или по 2,0 мл (при использовании пробирок объемом 5—15 мл), маркируют и хранят до использования при температуре от 2 до 8 °С.

Взятие биологического материала с целью изоляции вирусов следует проводить не позднее трех дней от начала заболевания или в первый день госпитализации, предпочтительно до начала противовирусной терапии.

Мазки хранят в течение 24 ч при температуре 2—8 °С, более длительно - при температуре не выше минус 20 °С (желательно при температуре минус 70 °С).

4.3.2.Аутопсииныи материал забирают стерильным индивидуальным инструментом из зоны поврежденной ткани объемом 1—3 см³ стерильными инструментами (индивидуально для каждого органа), помещают в одноразовые стерильные крио пробирки с герметично завинчивающейся крышкой, замораживают и хранят при температуре не выше минус 70 °С.

Следует избегать оттаивания и повторного замораживания материала во время хранения и транспортирования, поскольку это приводит к утрате вирусами жизнеспособности.

Транспортирование при температуре от 2 до 8 °С допу скается не более 24 часов. При необходимости более длительного транспортирования следует обеспечить температуру не выше минус 70 °С (с использованием сухого льда, при этом биологический материал должен быть помещен в криопробирки и упакован согласно руководству ВОЗ «Перевозка инфекционных материалов с сухим льдом»: http://www.who.int/ihr-

/7vfodule_6_Shipping_\vith_dry_ice_RU.pdO-

В контейнер с целью поддержания холодовой цепи помещают одноразовый индикатор, контролирующий соблюдение требуемой температуры.

4.4. Маркировка материала для лабораторного исследования

4.4.1.    На этикетке пробирок (контейнеров) с материалом указывается порядковый номер образца, соответствующий номеру в сопроводительном документе, и, по-возможности, фамилия и инициалы, тип биоматериала.

4.4.2.    В сопроводительном документе (направлении) к материалу, собранному для исследования в лаборатории, указываются:

-    наименование учреждения, которое направляет материал на исследования, телефон, адрес электронной почты;

-    фамилия и имя обследуемого больного;

ББК51.9

Л12

Л12    Лабораторная диагностика гриппа и других ОРВИ мето

дом полимеразной цепной реакции: Методические рекомендации.—М.: Федеральная служба но надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2018.—48 с.

ISBN 978-5-7508-1607-1

1.    Разработаны Федеральной службой но надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Е. Б. Ежлова, Ю. В. Демина, А. Л. Мельникова), Федеральным бюджетным учреждением науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии»

(В. В. Малеев, Г. А. Шипулин, С. Б. Яцышина, И. Н. Манзенюк, Е. Н. Родионова).

2.    Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главным 1Х>сударственным санитарным врачом Российской Федерации А. Ю. Поповой 6 сентября 2017 г.

3.    Введены впервые.

ББК51.9

Редактор Л. С. Кучурова Компьютерная верстка Е. В. Ломановой Подписано в печать 08.02.18 Формат 60x84/16    Псч.    л.    3.0

Тираж 100 экз.    Заказ    7

Федеральная служба по надзору в сфере зашить» прав потребителей и благополучия человека 127994, Москва, Банковский пер., д. 18. стр. 5, 7

Оригинал-макет подготовлен к печати и тиражирован Федеральным центром гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора 117105, Москва, Варшавское ш., 19а

Реализация печатных изданий, тсл./факс: 8 (495) 952-50-89

С Роспотребнадзор, 2018

-    пол обследуемого больного;

-    возраст или дата рождения;

-    дата взятия материала для лабораторного исследования;

-    тип материала;

-    дата заболевания или контакта с больным;

-    предварительный клинический диагноз или повод к обследованию;

-    степень тяжести заболевания;

-данные о вакцинации против гриппа в текущем эпидемическом сезоне (вакцинирован/'не вакцинирован/нет данных);

-    ФИО сотрудника, отправившего биоматериал, дата отправки материала и контактный телефон, по которому можно связаться с данным сотрудником.

4.5. Транспортирование материала для проведения ПЦР-исследования

4.5.1.    При необходимости транспортирования внутри одного здания, пробирки/контейнеры с биологическим материалом помещают в штативы и специальные герметичные контейнеры-переноски. Транспортирование производится при комнатной температуре или при температуре от 2 до 8 °С.

4.5.2.    При необходимости транспортирования биологического материала в другие организации образцы от каждого пациента помещают в индивидуальный герметичный пакет с адсорбирующим материалом и дополнительно упаковывают в общий герметичный пакет, помещаемый в термоконтейнер. Транспортирование производится в термоконтейнерах при температуре от 2 до 8 °С. В контейнер желательно поместить одноразовый индикатор, контролирующий соблюдение требуемой температуры.

4.5.3.    Сопроводительные документы помещаются в индивидуальную упаковку отдельно от биологического материала и прочно прикрепляются снаружи контейнера.

V. Материально-техническое обеспечение

5. /. Расходные материалы и оборудование для сбора биологического материала

5.1.1. Расходные материалы и оборудование для сбора биологического материала включают в себя:

1. Гибкий назофарингеальный велюр-тампон на пластиковом аппликаторе. Используется для получения материала из носоглотки у детей и, желательно, у взрослых.

Содержание

I. Общие положения и область применения........................................................4

И. Введение..............................................................................................................4

III.    Описание метода.................................................................................................9

3.1.    Принцип метода...........................................................................................9

3.2.    Показания к применению метода.............................................................14

IV.    Биологический материал для исследования...................................................15

4.1. Перечень биологического материала для исследования........................15

4.2.    Методика получения биологического материала и условия

хранения.....................................................................................................16

4.3.    Сбор биологического материала для ПЦР как предварительного теста с целью последующего выделения культуры вируса

с использованием культурального метода..............................................18

4.4.    Маркировка материала для лабораторного исследования.....................19

4.5.    Транспортирование материала для проведения ПЦР-исследования.....20

V.    Материально-техническое обеспечение.........................................................20

5.1.    Расходные материалы и оборудование для сбора биологического

материала...................................................................................................20

5.2.    Расходные материалы и оборудование для проведения

ПЦР-анализа..............................................................................................21

VI.    Порядок работы................................................................................................25

6.1.    Предварительная обработка и подготовка биологического

материала........................ 26

6.2.    Экстракция нуклеиновых кислот.............................................................28

6.3.    Проведение реакции обратной транскрипции.........................................32

6.4.    Проведение ПЦР-амплификации с детекцией в режиме

«реального времени».................................................................................33

6.5.    Интерпретация и выдача результатов исследования при использовании амплификации с детекцией в режиме

«реального времени».................................................................................35

6.6.    Проведение ПЦР-амплификации с детекцией флуоресценции

в формате «по конечной точке»...............................................................36

6.7.    Проведение ПЦР-амплификации с детекцией фрагментов

амплификации ДНК методом электрофореза.........................................38

VII. Организация внутрилабораторного контроля качества исследований........42

Нормативные ссылки...............................................................................................44

Термины и сокращения............................................................................................45

Использованная литература....................................................................................46

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

А. Ю. Попова

6 сентября 2017 г.

3.1. ЭПИДЕМИОЛОГИЯ. ПРОФИЛАКТИКА ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ

Лабораторная диагностика гриппа и других ОРВИ методом полимеразной цепной реакции

Методические рекомендации _МР    3.1.0117—17_

I. Общие положения и область применения

1.1.    В методических рекомендациях представлены сведения о возбудителях ОРВИ, включая эпидемиологические данные о новых видах вирусов, описанных в последнее десятилетие. Представлен общий методический подход и подробный порядок проведения лабораторного исследования методом полимеразной цепной реакции с целью обнаружения нуклеиновых кислот гриппа и других значимых возбудителей ОРВИ. Особое внимание уделено описанию перечня биологического материала и правил его получения, упаковки, транспортирования и хранения биологического материала от больных (умерших).

1.2.    Методические рекомендации предназначены для специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, медицинских организаций, научно-исследовательских организаций, осуществляющих диагностику и исследования возбудителей ОРВИ.

II. Введение

2.1. Заболеваемость острыми инфекциями верхних дыхательных путей множественной или неуточненной локализации и гриппом в Российской Федерации, по данным официальной статистики, в совокупности составляет 19—20 тыс. на 100 тыс. населения ежегодно. Дети дошкольного возраста подвержены ОРЗ в среднем 4—8 раз в год, школь-

ники - от 2 до 6 раз в год, взрослые - 2—3 раза в год. В контингентах часто болеющих детей эпизоды ОРЗ регистрируются от 10 до 12 раз в году. В 90 % случаев ОРЗ составляют ОРВИ, основные возбудители которых относятся к шести семействам вирусов. Геном большинства из них представлен молекулой РНК (ортомиксовирусы, парамиксовирусы, коронавирусы и пикорнавирусы), геном других состоит из молекулы ДНК (аденовирусы, парвовирусы).

2.2. Ведущее место среди острых инфекций дыхательных путей занимает грипп, возбудитель которого периодически вызывает пандемии, последняя из которых наблюдалась в 2009—2010 гг. Эпидемии гриппа охватывают от 5 до 20 % населения, приводят к госпитализации порядка 3 млн человек и вызывают до 250—500 тыс. летальных исходов в мире ежегодно. У взрослых больных гриппом в 10—15% случаев развиваются осложнения, причем, 80 % из них приходится на пневмонию. При развитии пневмонии у детей вирусы гриппа обнаруживают в 7—22 % случаев. Возбудители гриппа относятся к семейству Orthomyxoviridae, в котором выделяют три рода - Influenzavirus А, Influenzavirus В и Influenzavirus С, каждый из которых имеет по одному виду - Influenza A virus, Influenza В virus и Influenza С virus.

2.2.1. Вирусы гриппа А широко распространены в природе, их выделяют от большинства зверей и птиц, в связи с чем они имеют высокий пандемический потенциал, так как способны преодолевать межвидовые барьеры. Способность вирусов гриппа А к быстрому накоплению мутаций, изменяющих их антигенные свойства, лежит в основе их высокого эпидемического потенциала. Вирусы гриппа А в настоящее время дифференцируют (типируют) с помощью генетических методов на подтипы (паи субтипы) в соответствии с генетической структурой: генов гемаг-глютинина - на 16 субтипов и нейраминидазы - на 9 субтипов. В 2013 г. при скрининге у летучих мышей в Центральной Америке и Перу были обнаружены новые субтипы вирусов гриппа, обозначенные как H17N10 и H18N11. Значительную обеспокоенность вызывает циркуляция в природе патогенных для человека вирусов гриппа птиц. Регистрируются крупные эпизоотии с заболеванием людей, вызванные вирусами гриппа субтипов Н7 и Н9 (Гонконг - H9N2, 1998—1999 гг., Нидерланды -H7N7, 2003 г.), в ряде случаев со смертельным исходом. С 2005 г. эпизоотии гриппа H5N1 повлекли за собой заболевания людей в десятке с гран мира с летальностью 60 %. С 2013 года в Китае регистрируются случаи тяжелой пневмонии с летальным исходом у людей, инфицированных вирусом гриппа птиц субтипа A/H7N9. На 21 января 2014 г. ВОЗ сообщила о 209 лабораторно подтвержденных случаях инфицирования людей этим вирусом. Таким образом, на настоящее время актуален мо-

ниторинг вирусов гриппа, имеющих в геноме сегмент, кодирующий ге-магглютинин субтипов Н5, Н7 и Н9.

2.2.2.    Вирусы гриппа В до сих пор выделяли только от людей. Наряду с гриппом А они занимают значительную долю в структуре летальности при гриппе у детей. Так, в США в сезоне 2010—2011 гг. вирус гриппа В стал причиной 38 % случаев смерти детей, заняв в структуре циркулирующих вирусов гриппа 26 %.

2.2.3.    У людей вирусы гриппа С вызывают спорадические ОРЗ. Среди животных вирусы гриппа С выделяют от свиней, при экспериментальном заражении заболеванию подвержены собаки. Вирусы гриппа А, В и С дифференцируют друг от друга с помощью иммунологических и генетических методов.

2.3.    Помимо вирусов гриппа, причиной ОРВИ являются парамик-совирусы: респираторно-синцитиальный вирус, метапневмовирус человека, 4 вида вирусов парагриппа (1—4), коропавирусы 229Е, ОС43, NL63, HKUI, риновирусы (виды А, В, С), относящиеся к пикорнавиру-сам, аденовирусы (виды В, С, Е), бокавирус человека, относящийся к парвовирусам. Все вышеперечисленные вирусы, за исключением бока-вируса человека, вызывают ОРЗ среди всех возрастных групп. У лиц со сниженной активностью иммунной системы причиной ОРЗ могут быть также энтеровирусы, вирусы герпеса, цитомегаловирус. Дифференциальная диагностика гриппа и других ОРВИ возможна только с помощью лабораторных методов исследования.

2.3.1.    Респираторно-синцитиальный вирус (hRSv, PC-вирус) является основным возбудителем бронхиолитов и пневмоний у младенцев и детей младшего возраста во всем мире. В группу риска тяжелого течения PC-инфекции входят недоношенные младенцы, дети до 2 лет, дети и взрослые с ослабленной вследствие заболеваний или лечения иммунной системой, пожилые люди (старше 65 лет). В годы эпидемической активности hRSv вызывает 30—40 % всех ОРВИ; при пневмонии у детей до 2 лет доля hRSv доходит до 40 %. С hRSv связывают формирование хронических бронхитов и бронхиальной астмы у 30 % детей, перенесших бронхиолит в течение первых 6 месяцев жизни.

2.3.2.    Клинико-эпидемиологические исследования инфекции, вызванной метапневмовирусом (hMPv), впервые описанной в 2001 г., демонстрируют сходство клинической картины с RSv-инфекнией. Сероэпидемиологические исследования свидетельствуют о широкой распространенности hMPv, практически все дети серопозитивны к 5 годам жизни. От 5 до 25 % случаев госпитализаций с острой инфекцией нижних дыхательных путей детей младшего возраста составляет hMPv-ин-фекция. Основными диагнозами hMPv-инфекции у детей являются

бронхиолиты, пневмония и бронхиальная астма. У детей при пневмонии метапневмовирус обнаруживают, по данным исследователей различных стран, от 0,3 до 14,5 % случаев заболевания. В домах малютки и домах пресзарелых hMPv, как и hRSv, служат причиной фупповых заболеваний, вызывая заболевания нижних дыхательных путей более чем у половины инфицированных и летальный исход у 11 % заболевших.

2.3.3.    Вирусы парагриппа (hPiv) разделяют на 4 вида, относящиеся к двум родам: респировирусы (парагрипп 1 и 3) и рубулавирусы (пара-грипп 2 и 4). Вирусы парагриппа часто обнаруживаются у детей младшего возраста. Ко второму году жизни каждый ребенок хотя бы один раз переболевает ОРЗ, вызванным вирусами парагриппа. hPiv 2 и 4 чаще обнаруживают у детей первого года жизни по сравнению с другими возрастными группами, где превалируют вирусы парагриппа 1 и 3. Доля hPiv в этиологической структуре ОРЗ составляет от 9 до 30 %. При этом, в этиологической структуре крупов у детей первых лет жизни вирусы парагриппа 1—4 занимают до 20 %. Среди детей с заболеваниями нижних дыхательных путей, госпитализированных в стационары, инфицированных hPiv в среднем около 22 %. Все это ставит вирусы парагриппа на второе место по частоте госпитализации и тяжести заболевания детей младшего возраста после РС-вируса.

2.3.4.    Среди аденовирусов (hAdv) выделяют 7 видов: А, В, С, D, Е, F, G. В зависимости от вида аденовирусы вызывают различные инфекционные заболевания: конъюнктивиты и кератоконъюнктивиты (A, D), острые диарейные заболевания (F), гастроэнтериты (G), крупы, гриппоподобные заболевания, бронхиты и пневмонии - В, С, Е. Известны случаи бессимптомного носительства на протяжение нескольких месяцев hAdv в лимфоидной ткани верхних дыхательных путей. Будучи относительно устойчивыми к химическим и физическим воздействиям, hAdv могут длительное время сохранять стабильность в окружающей среде, в связи с чем часто вызывают вспышки в детских дошкольных учреждения, домах ребенка, домах преезарелых и, прежде всего, в воинских частях. При этом заболевание может протекать со случаями пневмонии тяжелого течения и даже заканчиваться летальным исходом.

2.3.5.    Коронавирусы (hCov) представляют собой большую разнообразную группу вирусов, которая классифицируется как альфа-, бета- и гамма-коронавирусы. Различные виды коронавирусов широко распространены в природе, вызывая различную инфекционную патологию у животных: гастроэнтериты и респираторные инфекции у свиней, инфекционный бронхит кур, энтериты у собак, инфекционный перитонит у кошек. Как показали исследования последних двух лет, летучие мыши инфицированы разнообразными альфа- и бета-коронавирусами.

2.3.5.1.    У человека острую респираюрную инфекцию вызывают 4 вида коронавирусов: 229Е, ОС43, NL63, HKUI, она чаще регистрируется у детей первого года жизни и протекает преимущественно в форме крупа. У детей старшего возраста и у взрослых коронавирусная инфекция может протекать в виде гриппоподобного заболевания. При развитии пневмонии у детей коронавирусы обнаруживаются в 1,5—6,5 % случаев.

2.3.5.2.    В настоящее время семейство коронавирусов включает 2 вида вирусов, вызывающих тяжелую респираторную инфекцию у людей: SARS-Cov (Severe acute respiratory syndrome coronavirus или TOPC-коронавирус, вызывающий тяжелый острый респираторный синдром) и MERS-Cov {Middle East respiratory syndrome coronavirus или БВРС-коронавирус, вызывающий Ближневосточный респираторный синдром). Коронавирус ТОРС вызвал эпидемию в 2003 году в 33 странах мира (наибольшее количество заболевших было зарегистрировано в Китае, Сингапуре и Канаде) с общим числом заболевших 7 761 человек, у 623 из них заболевание закончилось летальным исходом. Вирус SARS-Cov легко передается от человека к человеку. С сентября 2012 г. на Ближнем Востоке регистрируются случаи новой инфекции, вызванные коронави-русом MERS-Cov; к маю 2016 года инфицировано 1 728 человек, 624 из них умерли. Предполагают, что инфицирование людей происходит при контакте с верблюдами или с контаминированными вирусом объектами окружающей среды. Подтверждена способность MERS-Cov передаваться от человека к человеку, зарегистрированы вспышки внутрибольничной инфекции вызванной этим возбудителем в Южной Корее в 2015 году. Природным резервуаром обоих коронавирусов зоонозной природы являются летучие мыши.

2.3.6.    Чаще других вирусов у больных ОРЗ всех возрастных групп выявляются риновирусы (hRv). HRv преимущественно вызывают воспаление слизистой оболочки верхних дыхательных путей, сопровождающееся ринореей и кашлем, заболевание нередко осложняется трахеитом.

2.3.7.    Бокавирус (hBov), впервые описанный в 2005 г., обнаруживается со среднегодовой частотой 1,5—19 % (чаще у больных ОРЗ детей в возрасте до 5 лет и в 75 % случаев - до 2 лет), вызывая лихорадку, кашель, риниты и диарею. Помимо моноинфекции бокавирус часто обнаруживается в сочетании с другими вобудитслями ОРЗ. При пневмонии у детей бокавирусы обнаруживаются в А—15% случаев. У взрослых бокавирус в редких случаях обнаруживается при пневмонии на фоне иммунодефицита.

2.3.8.    Наиболее тяжело протекают острые инфекции дыхательных путей, вызванные респираторно-синцитиальным вирусом, метапневмо-

вирусом, вирусами парагриппа и коронавирусами, у детей в возрасте до 5 лет, пожилых и у лиц с иммунодефицитом.

III. Описание метода

3.1. Принцип метода

3.1.1.    Полимеразная цепная реакция является прямым методом быстрой диагностики инфекционных болезней, позволяющим обнаруживать в качестве аналита специфичные для возбудителя инфекции участки его генома. Метод направлен на обнаружение нуклеиновых кислот вирусов и бактерий в различных типах биологического материала, характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью, позволяет проводить стандартизацию процедуры исследования, контролировать процесс обработки материала на всех этапах. Высокая аналитическая чувствительность ПЦР обеспечивается за счет лежащей в основе метода амплификации - многократного увеличения количества фрагмента нуклеиновой кислоты возбудителя. Цикличность реакции достигается путем многократного (от 40 до 45 раз) последовательного повторения шагов инкубации реакционной смеси при температурах: 90—95 °С (денатурация ДНК/кДНК), 50—65 °С (отжиг праймеров). 60—72 °С (элонгация или синтез цепи ДНК).

3.1.2.    Важным моментом исследования является правильный выбор, отбор, хранение и использование биологического материала. Биологический материал должен соответствовать конкретной нозологии заболевания, содержать максимальное количество возбудителя (генома возбудителя) и быть доступным для получения неинвазивными методами. Для диагностики ОРВИ преимущественно используется биологический материал из дыхательных путей, соответствующий локализации поражения: при заболеваниях верхних дыхательных путей используются мазки из носоглотки и ротоглотки; в случае заболевания нижних дыхательных путей - материал из трахеи, бронхов и легких. При наличии выпота в плевральной полости также исследуется плевральная жидкость; при наличии менингеальной симптоматики - спинно-мозговая жидкость. Для диагностики отдельных инфекций могут использоваться дополнительные виды биологического материала, что указывается в инструкции к диагностическому набору. Например, для диагностики тяжелого острого респираторного синдрома вызванного коронавирусом ТОРС, помимо материала из респираторного тракта используются фекалии и плазма крови. При проведении исследования с целью определения этиологии ОРЗ с летальным исходом исследуется секционный материал пораженных органов.