Федеральная служба по напору в сфере заниггы нрав потребителей н благополучия человека

2.1.7. ПОЧВА. ОЧИСТКА НАСЕЛЕННЫХ МЕСТ. ОТХОДЫ ПРОИЗВОДСТВА И ПОТРЕБЛЕНИЯ. САНИТАРНАЯ ОХРАНА ПОЧВЫ

Экспресс-оценка токсичности отходов производства и потребления на культуре клеток млекопитающих

Методические рекомендации МР 2.1.7.2279—07

ББК

Экспресс--оценка токсичности отходов производства и потребления на культуре клеток млекопитающих:.—М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Рос потреб надзора. 2008.—12 с.

1.    Разработаны 1У НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А. Н. Сысина РАМН (Н. В. Русаков. И. А. Крягов.

11. В. Пиртахия, И. С. Евсеева. С. Б. Чудакова); ЗЛО Фирма «БМК-ИНВЕСТ» (А. П. Пськов. Р. И. Каюмов).

2.    Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защит прав noipcomc.icH и благополучия человека (протокол от 29.03.2007 № 1).

3.    Утверждены Руководителем Федеральной сл\жбы но надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главным государственным санитрным врачом Российской Федерации Г. Г. Онищенко 24 сентября 2007 г.

4.    Введены в действие с 10 декабря 2007 г.

5.    Введены впервые.

ББК 51.21

Редакгоры И. Е. Акопова. Н. В. Кожока Технический редактор Е. В. Ломанова

Подписано в почать 1S.0S.08 Формат 60x88 16    Печ.    л.    0.75

Тираж 300 экз.    Заказ    25

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потреби татей и блаюнитучия человека 127994. Москва. Вадковский пер., д. i 8 20

Оришнал-макет подготовлен к почат и шражирован отделом информационно-издательского обеспечения Федеральною цен ipa пн иены и эпидемиологии Роспотребнадзора 11710S. Москва. Варшавское ш.. 19а Отделение реализации, тел. факс 952-50-89

€ Роспотребнадзор, 2008 С Федеральным iicinp i ш пены н

эпидемиологии Роспотребнадзора, 2(K)8

MP 2.1.7.2279—07

Список литературы

1.    Определение класса опасности токсичных отходов производства и потребления: СП 2.1.7.1386—03.

2.    Clcmcdson С.. McFarlanc-Abdulla £.. Anderson М. et al. ME 1C evaluation of acute systemic toxicity //ATLA. 1996. V. 24. Suppl 1. P. 251— 311.

3.    Clcmcdson C. Barile F.A.. Ekwatt B. et al. MEIC evaluation of acute systemic toxicity //ATLA. 1998. V. 26. Suppl. 1. P. 93—183.

4.    Каюмов P. И.. Еськов А. П.. Ротенберг Ю. С. и др. Токсикологическая оценка индивидуальных химических соединений и смесей сложного состава с использованием подвижного тест-объекта //Бюл. экспер. биол. мед.—1988.—№ 1.—С. 48—50.

5.    Биотсстнрованис продукции из полимерных и других материалов: МУ 1.1.037—95.

6.    Методические рекомендации по применению методов бнотссти-рования для оценки качества воды в системах хозяйственно-питьевого водоснабжения: МР № ЦОС ПВ Р 005—95. М.. 1995.

7.    Пиртахия Н. В.. Еськов А. П.. Каюмов Р. И. Сравнительная оценка токсичности тяжелых металлов в эксперименте in vitro //Тез. докл. 2-го Международного конгресса по управлению отходами ВэйстТэк-2001. 5—8 июня 2001 г., Москва.

8.    Обоснование гигиенических нормативов химических веществ в воде водных объектов хозяйственно-питьевого и культурно-бытового водопользования: МУ 2.1.5.720—98.

9.    Плохи некий Н. А. Биометрия. 1970.

11

Приложение

Пример оценки токсичности золошлака термохимической деструкции фармпрепарата на сперме быка

1.    Готовим экстракт золошлака в соответствии с п. 4.

2.    Готовим несколько разведений экстракта (см. таблицу).

3.    Для каждого разведения экстракта определяем индекс токсичности в соответствии с п. 5 и 6. Результаты заносим в таблицу.

4.    Находим коэффициенты уравнения регрессии в соответствии с п. 7. Дтя этого используем программу W.1997 «Microsoft Excel». В нашем случае уравнение регрессии имеет вид LgR = 0.028/, + 0,59. Из полученного уравнения регрессии находим IR>₀ = 98 и IRg₀ ⁼ 670.

5.    Определяем класс опасности отхода по табл. 1 п. 8.

6. Разведения водного экстракта отхода, превышающие порог токсического действия IR > 670. не будут оказывать негативное воздействие на сперму быка, что обеспечит токсикологическую безопасность отхода.

МР 2.1.7.2279—07

Содержание

1.    Область применения...............................................................................................5

2.    Термины и определения.........................................................................................5

3.    Сущность методики................................................................................................6

4.    Средства измерения, оборудование и реактивы...................................................6

5.    Отбор образцов и приготовление экстрактов.......................................................7

6.    Проведение испытаний..........................................................................................7

7.    Обработка экспериментальных данных................................................................8

8.    Нахождение параметров токсичности..................................................................9

9.    Определение класса опасности и уровня безвредности отходов.....................10

Список литературы...................................................................................................10

Приложение. 11ример оценки токсичности золошлака термохимической

деструкции фармпрепарата на сперме быка...................................12

3

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в с(|юрс защиты прав потребителей и благополучия человека. Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г. Г. Онищенко

24 сентября 2007 г.

Дата введения: 10 декабря 2007 г.

2.1.7. ПОЧВА. ОЧИСТКА НАСЕЛЕННЫХ МЕСТ. ОТХОДЫ ПРОИЗВОДСТВА И ПОТРЕБЛЕНИЯ. САНИТАРНАЯ ОХРАНА ПОЧВЫ

Экспресс-оценка токсичности отходов производства и потребления на культуре клеток млекопитающих

Методические рекомендации _МР    2.1.7.2279—07_

Введение

При использовании экспериментального метода определения класса опасности отходов производства и потребления в соответствии с СП 2.1.7.1386—03 токсичность отходов по влиянию на организм человека устанавливается в санитарно-токсикологических экспериментах (остром, подостром, хроническом) на теплокровных животных (млекопитающих). Высокая трудоемкость и себестоимость токсикологических исследований по оценке влияния отходов на теплокровный организм делает актуальным внедрение более экономичных и оперативных способов оценки их токсичности. Для этих целей могут быть применены биологические экспресс-методы, использующие, в частности, культуры клеток млекопитающих. Основанием хтя этого является достаточно высокий уровень корреляционной зависимости между результатами оценки острой токсичности химических соединений на целостном организме и культурах клеток (коэффициент корреляции £ 0.8).

Рекомендуемый метод предусматривает экспресс-оценку токсичности отходов и определение класса их опасности по результатам исследований in vitro с использованием в качестве тест-объекта кратковременной суспензионной ку льту ры сперматозоидов быка - КСБ. Преимуществом КСБ по сравнению с другими клеточными культурами является

4

MP 2.1.7.2279—07

то. что она нс требует для своего сохранения и использования стерильных условий и специальных технологий поддержания, что резко снижает трудоемкость и стоимость испытании. Метод позволяет оценить суммарный эффект от воздействия на культуру всей совокупности токсикантов, присутствующих в отходе, включая неидентифицированные компоненты. по биологическом) действию его экстракта на тест-объект.

В соответствии с методикой установление класса опасности и уровня безвредности отхода по влиянию на сперму быка осуществляется по параметрам токсичности: средне-эффективному и пороговому разведениям экстракта.

Критерии опасности отходов разработаны на основе корреляционно-регрессионного анализа взаимосвязи между параметрами острой токсичности различных химических веществ, установленных на животных и культуре сперматозоидов, и являются адекватными критериями опасности химических веществ по DL30.

Методические рекомендации предназначены для учреждений государственного санитарно-эпидемиологического надзора, юридических и физических лиц. независимо от их подчинения и формы собственности, осуществляющих обращение с отходами производства и потребления.

1. Область применения

Методика предназначена хтя оценки токсичности отходов производства и потребления по влиянию на кратковременную суспензионную культуру подвижных клеток млекопитающих - сперму быка. Методика должна применяться в рамках алгоритма сокращенной схемы экспериментальной оценки опасности отходов (СП 2.1.7.1386—03 «Определение класса опасности токсичных отходов производства и потребления») с обязательным подтверждением классическим методом.

При проведении исследований по расширенной схеме подтверждение (уточнение) класса опасности отхода, установленного на КСБ. в санитарно-токсикологических экспериментах на теплокровных животных является обязательным (п. 5.6. п/п 5.6.5 СП 2.1.7.1386—03).

2. Термины и определения

Термин Определение 1 2 Экстракт Модельная среда, характеризующая содержание химических компонентов в отходе R Кратность разведения экстракта Тест-объект Суспензионная кулыура сперматозоидов быка (КСБ)

Продолжение

1 2 Тест-функция Средневзвешенное время подвижности КСБ Показатель тест-функции -индекс токсичности -1, Отношение времени подвижности КСБ в исследуемой среде ко времени подвижности в контроле, выраженное в % Биологически эффективные разведения Все значения R, при которых индекс токсичности составляет 80 и менее процентов Средне-эффективное разведение - IRso Разведение экстракта, при ко тором /, = 50 % Мш ш малы ю действующее (пороговое) разведение - IR^ Разведение экстракта, при котором индекс токсичности = 80 %

3. Сущность методики

Сущность методики состоит в исследовании токсичности экстракта из испытуемых отходов с применением в качестве тест-объекта спермы быка. Используется сперма быка, замороженная в парах жидкого азота. Гранулы замороженной бычьей спермы получают на станциях искусственного осеменения и хранят в сосудах Дьюара, наполненных жидким азотом. В основе метода лежит исследование изменения зависимости двигательной активности сперматозоидов от времени под воздействием химических соединений, содержащихся в экстракте из испыту емого отхода.

В качестве измеряемого параметра использована интегральная подвижность сперматозоидов в суспензии ///. которая пропорциональна концентрации подвижных сперматозоидов с_т и среднему модулю скорости движения клеток v:

т = с_т v

Интегральная подвижность сперматозоидов в суспензии /// = m(t) для контрольного и опытного образцов измеряется за период, пока ее величина нс станет близкой к нулю.

Подвижность сперматозоидов в суспензии измеряется анализатором изображений, принцип работы которого основан на автоматическом компьютерном анализе микроскопических видеоизображений суспензии сперматозоидов.

4. Средства измерения, оборудование и реактивы

Анализатор изображений АТ-05 (Анализатор

токсичности АТ-05)    ТУ 15254)01 -2913668—03

Пробирки с притертыми пробками объемом 3—5 мл - 10 шт.

Дозаторы пипеточные на объемы 0.5.0.2 и 0,1 мл

6

MP 2.1.7.2279—07

Мерные колбы с притертыми пробками объемом 50 мл - 2 шт.

Весы аналитические с погрешностью взвешивания нс более 1 мг Пинцет анатомический длиной 250 мм Сосуд Дьюара типа СДС. объемом нс менее 25 л и диаметром горла не менее 50 мм - 2 шт.

Глюкоза, ч

Цитрат натрия трехзамещенный. ч

Сперма быка, замороженная в жидком азоте    ГОСТ 26030-83

5. Отбор образцов и приготовление экстрактов

Отбор образцов отходов и приготовление экстрактов проводится в соответствии с СП 2.1.7.1386—03 «Определение класса опасности токсичных отходов производства и потребления».

Модельной средой (экстрагентом) для экстракции химических веществ из отходов является дистиллированная вода с уровнем pH = 6.1—6.3.

Оптимальное соотношение фаз «отход/экстрагснт» -1:10. Исходя из этого, навеску отхода 10 г помещают в мерную колбу объемом 100 мл и дистиллированной водой доводят до метки.

После интенсивного размешивания колбы с экстрактом отхода отстаиваются при комнатной температуре в течение 1 суток. Затем подвергаются 2-часовому встряхиванию на специальном аппарате («Шу-тель») и фильтрованию через фильтр «синяя лента».

Рабочие растворы готовятся путем последовательного разведения исходного (нативного) экстракта.

Для удобства при последующем статистическом анализе результатов значение R нативного экстракта условно принимается за 1. его раз-ведение в К) раз соответствует R = К) и т. д.

6. Проведение испытаний

Бнотестированис образцов отходов осуществляется в рекогносцировочном и основном опытах.

В рекогносцировочном опыте, целью которого является выяснение диапазона цитотоксического действия образца, испытываются нативный экстракт (R = 1) и его разведения, кратные 10 (R = 10. 100. 1 000 и т. д.).

Конечная цель основного опыта - установление параметров цитотоксичности. В основном опыте тестируются разведения, кратные 2—3 в интервале биологически эффективных разведений, установленном на первом этапе.

Вес растворы в течение эксперимента должны находиться при постоянной температуре (40 ± 1,5) °С. для чего используется термостат.

Для определения индекса токсичности опытного раствора необходимо сравнить его с контрольной (модельной) средой.

В качестве контрольного раствора выбрана глюкозо-нитратная среда (глюкоза - 4 г. цитрат натрия - 1 г. дистиллированная вода - 100 мл). Контрольная среда одновременно является разбавителем для оттаивания замороженной спермы.

Опытным раствором является экстракт из отхода или его разведения. доведенные до изотонии сухими реактивами глюкозы и цитрата натрия (глюкоза - 4 г. цитрат натрия - 1 г. испытуемый раствор -100 мл).

Контрольный и опытный растворы по 0.4 мл помещают в пробирки с притертыми пробками и ставят в термостат при температуре (40 ± 1,5) °С.

Примечание. Если при приготовлении опытного раствора наблюдается выпадение осада, то в качес тве котрольной сре;ц>1 используют 0,9 %-й рас гвор хлористого мафия. Доведение опытного раствора до изотошш осуществляют сухим хлористым натрием (0,09 г хлористого натрия, испытуемый раствор -100 мл). Дтя оттаивания спермы испо.тьзуют глюко ю-цитрати> ю среду.

Оттаивают замороженную сперму. Дтя этого дозируют в пробирки разбавитель согласно паспорту на сперму быка и ставят их в термостат при температуре (40 ± 1.5) °С. Охлажденным до температу ры жидкого азота анатомическим пинцетом извлекают из сосуда Дьюара гранулу спермы и отекают в нагретый раствор. Сразу после размораживания содержимое пробирки тщательно перемешивают.

Приготавливают рабочие образцы. В пробирки с контрольным и опытным растворами помещают по 0.1 мл маточного раствора спермы.

Подготавливают пробы к исследованию. Рабочие образцы переносят в капилляры, которые устанавливают в каретку и помешают в анализатор.

Проводят накопление экспериментальных данных. Нажатием кнопки «СТАРТ» включают процесс накопления данных. При достижении нулевых значений показателя подвижности во всех кюветах нажатием кнопки «СТОП» останавливают процесс накопления данных.

7. Обработка экспериментальных данных

Дзя каждого образца вычисляют средневзвешенное значение времени подвижности t_cp:

MP 2.1.7.2279—07

£("'» ‘О

t = In ///, ---.    где

2/"'

i

т, - /-с значение показателя подвижности;

/ - текущий номер оценки показателя подвижности.

Для контрольной и опытной выборок образцов вычисляют среднее арифметическое значение и среднеквадратичное отклонение, по которым в свою очередь вычисляют для каждой выборки коэффициент вариации С:

С =—■•100%, где х

б- среднеквадратичное отклонение:

х - среднее арифметическое значение.

В случае получения значения коэффициента вариации более 15% хотя бы для одной из выборок, эксперимент повторяют. Если значения коэффициентов вариации для каждой из выборок меньше или равно 15%. то результаты считают статистически значимыми. Затем вычисляют величину индекса токсичности /,:

—о

/,= =7-100%, где

t

¹ср° ^н Кр - средние арифметические значения средневзвешенного

времени подвижности, соответственно, для опытной и контрольной выборок образцов.

Вычисление индексов токсичности выполняется автоматически анализатором изображений АТ-05.

За критерий вредного действия принимается величина 1, ^ 80 % (при норме - 100 %). Это значение индекса является порогом токсического действия отхода на клеточную культуру.

8. Нахождение параметров токсичности

Для определения параметров цитотоксичности проводится регрессионный анализ экспериментальных данных, в результате которого получают уравнение, описывающее взаимосвязь разведения экстракта с величиной индекса токсичности*.

Pci росс ИОННЫЙ aiia.IM! НрОВОДИТСЯ при условии. ЧЮ биологически эффеКТИВНЫМИ являются но менее 3-х значений R.

9

Lgft = т I, ± Ь. где

1, - индекс токсичности;

R - разведение;

/// и b - коэффициенты уравнения регрессии.

Коэффициенты уравнения регрессии рассчитываются для каждого образца индивидуально по методу «Наименьших квадратов», который наиболее доступно реализуется с помощью модуля «регрессия» в пакете анализа «стандартные формулы» программы \V«Microsoft Excel».

Определение значений пороговых (IRgo) и срсднсэффсктнвных (IR*,) разведений осуществляется путем решения полученного уравнения относительно R при заданных величинах индекса токсичности, а именно, при определении порога /, = 80 %. а при определении средне-эффективного разведения - /, = 50 %.

9. Определение класса опасности и уровня безвредности отходов

Уровень безвредности отхода определяется, исходя из величины порога цитотоксического действия. Все разведения водного экстракта отхода, превышающие IR»,. не будут оказывать негативное воздействие отхода на культуру сперматозоидов быка. Следовательно, можно прогнозировать безопасность испытуемого отхода в токсикологическом отношении.

Класс токсикологической опасности отхода определяется по величине IR5© в соответствии с критериями, представленными в табл. 1.

Таблица 1

Классификации опасности отходов производства и потребления но влиянию на кулыуру сперматозоидов быка

Классы опасносш 1 2 3 4 Категории опасности чрезвычайно опасные высоко опасные умеренно опасные мало- опасные IR50 > 2 ООО 2 000—100 100—5 <5

Примечание. Если токсический эффект зафиксирован только при действии нативного экстракта, а его разведения являются индифферентными но отношению к сперме быка, то отходу автоматически присваивается 4 класс опасности.