МР 1.1.0120-18
Экспресс-метод токсиколого-гигиенической оценки парфюмерно-косметической продукции с помощью люминесцентного бактериального теста (с применением измерительного прибора-люминометра типа "Биотокс-10")

Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование _Российской    Федерации_

1.1. ОБЩИЕ ВОПРОСЫ. ГИГИЕНА, ТОКСИКОЛОГИЯ, САНИТАРИЯ

Экспресс-метод токсикологогигиенической оценки парфюмернокосметической продукции с помощью люминесцентного бактериального теста (с применением измерительного прибора - люминометра типа «Биотокс-10»)

Методические рекомендации МР 1.1.0120—18

Издание официальное

Москва • 2018

Федеральная служба но надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека

1.1. ОБЩИЕ ВОПРОСЫ. ГИГИЕНА, ТОКСИКОЛОГИЯ, САНИТАРИЯ

Экспресс-метод токсиколого-гигиенической оценки парфюмерно-косметической продукции с помощью люминесцентного бактериального теста (с применением измерительного прибора -люмннометра типа «Биотокс-10»)

Методические рекомендации МР 1.1.0120—18

4.4. Подготовка прибора «Биотоке-10» и тест-объекта «Эколюм»

4.4.1.    Подготовка прибора «Биотоке-10»

Подготовку прибора «Биотоке-10» проводят в соответствии с инструкцией по эксплуатации.

4.4.2.    Регидратация биосенсора «Эколюм»

4.4.2.1.    Вскрыть флакон с лиофилизированным препаратом «Эколюм».

4.4.2.2.    Добавить 10 мл дистиллированной воды комнатной температуры для получения суспензии бактериального препарата. Рекомендуется использовать стерилизованную дистиллированную воду, а также несколько раз встряхнуть флакон с суспензией препарата.

Рекомендуется перемешивание рабочей суспензии препарата перед отбором определенных объемов для проведения анализа.

4.4.2.3.    Выдержать суспензию в течение 30 мин.

4.4.3.    Определение рабочей концентрации биосенсора «Эколюм»

4.4.3.1.    Измерить фоновое значение прибора «Биотоке-10» (по инструкции к прибору, при счете 10 с без кюветы) и записать это значение.

4.5. Проведение измерений

4.5.1.    Добавить 0,1мл суспензии бактерий из флакона в кювету люминометра. Затем туда же добавить 0,9 мл дистиллированной воды (комнатная температура).

4.5.2.    Вставить кювету с биосенсором в люминометр и измерить величину интенсивности биолюминесценции. Свечение рабочей суспензии бактерий должно находиться в интервале, превышающем фоновое значение прибора в 25—250 раз. Если величина больше интервала, то следует разбавить суспензию бактерий дистиллированной водой и повторить измерение.

Если биосенсер стал меньше растворяться в холодной дистиллированной воде, рекомендуется более энергично его встряхивать и отфильтровать суспензию бактерий через бумажный фильтр.

4.5.3.    В стандартном анализе приготовляют контрольный образец путем смешения в кювете от люминометра 0,1 мл рабочей суспензии бактерий и 0,9 мл дистиллированной воды. При приготовлении опытных образцов к 0,1 мл рабочей суспензии бактерий добавляют 0,9 мл пробы ПК-продукции различного разведения в соответствии с табл. 1 методических рекомендаций. Температура дистиллированной воды и образцов должна быть одинаковой. Указать значение температуры.

Измерение токсикологических параметров проводят с помощью прибора «Биотоке-10» в стандартном варианте через 30 мин экспозиции. В экспрессном варианте допустимо проведение анализа через 5 мин.

4.5.4.    Контроль погрешности метода токсикологического анализа.

Контроль качества оценки токсичности объектов окружающей среды проводится по определению чувствительности используемых тест-организмов к модельному «эталонному» токсиканту цинку сернокислому 7-водному (ZnS0₄ х 7Н₂0). Расчет проводится по содержанию ионов цинка. Диапазон концентраций модельного токсиканта, при действии которого в течение 30 мин интенсивность биолюминесценции ингибируется на 50 %, составляет 0,6—1,5 мг/л.

Удовлетворительные результаты, полученные при проверке диапазона реагирования люминесцентных бактерий на модельный токсикант, не обеспечивают гарантии адекватного реагирования организмов на другие токсиканты и тем более их смеси, однако регулярно проводимая проверка позволяет выявить ошибки при приготовлении исследуемых смесей и растворов, нарушения, допускаемые в условиях проведения опытов.

Процедура определения диапазона реагирования тест-системы «Эколюм» на модельный токсикант проводится путем действия раствора, содержащего 4,4 мг/л цинка сернокислого, при времени инкубации 30 мин с биосенсором. Должно происходить не менее чем 50 % ингибирование интенсивности биолюминесценции по сравнению с контролем. В случае если эта величина меньше, то следует проверить точность приготовления исследуемых растворов, условий проведения опытов.

4.6. Математическая обработка результатов измерений

4.6.1. Результат токсикологическог о анализа - индекс токсичности -в документах, предусматривающих его использование, представляется в виде:

х ± s при Р = 0,95, где

х - среднее арифметическое определений, s - среднеквадратичное отклонение, Р - уровень вероятности.

За результат анализа (х) принимают среднее арифметическое результатов трех (или более - до 10) параллельных измерений индекса токсичности. Индекс токсичности «Т» вычисляется по формуле: т= 100 • {l_KOHmp - IопытУIконтра ГДв 1_контр И 1_опыт - ИНТеНСИВНОСТИ бИОЛЮМИ-несценции бактерий в контрольной и опытной пробах соответственно.

Среднее квадратичное отклонение (о) результатов определений количественного выражения тест-реакции - индекса токсичности - вычисляется по формуле:

, где

Xj - /-Й результат определений;

п - число параллельных определений.

Среднее арифметическое х результатов определений количественного выражения тест-реакций вычисляется по формуле:

_ 1 х = — п

Все указанные статистические параметры вычисляются измерительным прибором «Биотоке-10» автоматически по команде оператора.

V. Оценка результатов испытаний

5.1. Оценку токсичности пробы проводят по относительному различию в интенсивности биолюминесценции контрольной и опытной проб и вычислению индекса токсичности «7>>.

В ряде случаев возможен вариант, когда интенсивность биолюминесценции в анализируемой пробе больше, чем в контроле. В таком случае независимо от величины отрицательного значения «Т» делается вывод об отсутствии токсичности образца, и индекс токсичности принимает нулевое значение.

По величине индекса токсичности анализируемые пробы классифицируются на три группы в соответствии с табл. 2.

Таблица 2 Классификация токсичности проб

Группы Индекс токсичности «Т» Вывод о степени токсичности пробы 1 меньше 20 допустимая степень токсичности 2 от 20 до 50 образец токсичен 3 равен или больше 50 образец сильно токсичен

Если при оценке токсичности продукции по величине индекса токсичности получено значение индекса токсичности более 20, то вывод о токсикологической безопасности продукции должен быть сделан после испытаний продукции аналогичными альтернативными методами или методами in vivo.

ББК 52.84 Э41

Э41 Экспресс-мстод токсиколого-гигиенической оценки парфюмерно-косметической продукции с помощью люминесцентного бактериального теста (с применением измерительного прибора - люминомстра типа «Биотоке-10»): Методические рекомендации.—М.: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2018.—12 с.

ISBN 978-5-7508-1635--4

1.    Разработаны Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в городе Москве» Роспотребнадзора.

2.    Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А. Ю. Поповой 13 февраля 2018 г.

3. МР 1.1.0120—18 введены взамен МР 1.1.0119—17 «Экспресс-метод токсиколого-гигиенической оценки парфюмерно-косметической продукции с помощью люминесцентного бактериального теста (с применением измерительного прибора-люминометра типа «Биотоке-10»), утверждщшых Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А. Ю. Поповой 22.12.2017.

Редактор Л. С. Кучурова Компьютерная верстка Е. В. Ломановой

Подписано в печать 22.08.18 Формат 60x84/16    Печ.    л. 0,75

Тираж 100 экз.    Заказ    38

Федеральная служба но надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 127994, Москва, Вадковский пер., д 18, стр. 5,7

Оригинал-макет подготовлен к печати и тиражирован ФБУЗ ФЦГиЭ Роспотребнадзора 117105, Москва, Варшавское ш., 19а

Реализация печатных изданий, тел ./факс: 8 (495) 952-50-89

© Роспотребнадзор, 2018

Содержание

I.    Общие положения...................................................................................................4

II.    Описание метода....................................................................................................5

III.    Оборудование, химическая посуда и реактивы..................................................6

IV.    Проведение испытаний........................................................................................7

V.    Оценка результатов испытаний..........................................................................12

УТВЕРЖДАЮ

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

А. Ю. Попова

13 февраля 2018 г.

1.1. ОБЩИЕ ВОПРОСЫ. ГИГИЕНА, ТОКСИКОЛОГИЯ, САНИТАРИЯ

Экспресс-метод токсиколого-гигиенической оценки парфюмерно-косметической продукции с помощью люминесцентного бактериального теста (с применением измерительного прибора - люминомстра типа «Биотокс-10»)

Методические рекомендации _МР    1.1.0120—18_

I. Общие положения

1.1. Методические рекомендации содержат описание метода токсикологического тестирования парфюмерно-косметической (далее - ПК) продукции с применением в качестве тест-объекта (биосенсора) реактива люминесцентных бактерий «Эколюм» или иных препаратов бактериальной люциферазы и определяют порядок проведения испытаний следующих видов ПК-продукции (далее - методические рекомендации, метод):

-    продукция косметическая гигиеническая моющая;

-    жиросодержащие косметические средства;

-    продукция косметическая жидкая, не содержащая спирт;

-    гели косметические;

-    продукция декоративной косметики на эмульсионной основе;

-    продукция косметическая для окрашивания, осветления, химической завивки и выпрямления волос;

-    продукция косметическая на носителях;

-    пилинга, скрабы, эксфолианты;

-    интимная косметика;

-    парфюмерная и косметическая спиртосодержащая продукция;

-    дезодоранты и депиляторы в аэрозольной упаковке и не в аэрозольной упаковке;

-    продукция декоративной косметики порошкообразная и компакг-ная, тальк, присыпки, зубные порошки;

-    кремы косметические для ухода за кожей лица, тела, волосами, ногтями, губами, кожей вокруг глаз;

-    продукция декоративной косметики на жировосковой основе;

-    средства для маникюра и ухода за ногтями;

-    мыло туалетное твердое;

-    соли для ванн, сухие средства для ванн;

-    зубные пасты;

-    средства гигиены полости рта жидкие;

-    средства для домашнего отбеливания зубов;

-    косметическая продукция индивидуальной защиты кожи от воздействия вредных производственных факторов.

1.2.    Методические рекомендации предназначены для оценки обще-токсического действия вновь разрабатываемой и серийно выпускаемой ПК-продукции.

Метод может быть применен для скрининговой оценки ПК-продук-ции в качестве самостоятельного экспресс-метода или в сочетании с другими токсиколого-гигиеническими методами.

1.3.    Методические рекомендации предназначены для учреждений научно-исследовательского и практического профиля, осуществляющих разработку новых видов ПК-продукции, контроль ее качества и оценки соответствия, а также для органов и организаций, осуществляющих федеральный государственный санитарно-эпидемиологический надзор.

II. Описание метода

2.1. В качестве тест-объекта используются препараты «Эколюм» лиофилизированных люминесцентных бактерий или иные препараты бактериальной люциферазы. Метод основан на определении изменения интенсивности бактериальной биолюминесценции при воздействии химических веществ, присутствующих в анализируемой пробе, по сравнению с контролем. Люминесцентные бактерии оптимальным образом сочетают в себе различные типы чувствительных структур, ответственных за генерацию биоповреждений (клеточная мембрана, цепи метаболического обмена, генетический аппарат), с экспрессностью, объективным и количественным характером отклика целостной системы на интегральное воздействие токсикантов. Это обеспечивается тем, что люминесцентные бактерии содержат фермент люциферазу, осуществляющую эффективную трансформацию энергии химических связей жизненно важных метаболитов в световой сигнал на уровне, доступном для экспрессных и количественных измерений.

2.2.    Критерием токсического действия является измерение с помощью прибора типа «Биотоке-10» интенсивности биолюминесценции тест-объекта под воздействием химических соединений, содержащихся в экстрактах ПК-продукции, по сравнению с раствором, не содержащим токсических веществ, или эталонной пробой. Уменьшение интенсивности биолюминесценции пропорционально токсическому эффекту.

При изучении токсикологических свойств ПК-продукции и ее химических ингредиентов люминесцентный бактериальный тест показывает хорошую корреляцию с их действием на высших животных.

Токсическое действие исследуемой пробы определяется по ингибированию интенсивности ее биолюминесценции за 30-минутный (в экспрессном варианте - 5 мин) период экспозиции. Количественные оценки тест-реакции выражаются в виде безразмерной величины — индекса токсичности «Т».

2.3.    Индекс токсичности «Т» равен отношению Т = 100 х (7₀ - 1)1 1₀, где 1₀ и / - интенсивность биолюминесценции контроля и опыта соответственно при фиксированном времени экспозиции исследуемой пробы с бактериальным препаратом.

Метод допускает три пороговых уровня индекса токсичности:

1- й уровень: допустимая степень токсичности образца - индекс токсичности «Т» меньше 20;

2- й уровень: образец токсичен - индекс токсичности «7>> равен или больше 20 и меньше 50;

3- й уровень: образец сильно токсичен - индекс токсичности «Т» равен или более 50.

Основанием для выбора эталонных разведений различных видов ПК-продукции с учетом допустимого интервала индекса токсичности послужила сравнительная оценка результатов исследования общей токсичности настоящим методом и кожно-раздражающего действия различных видов ПК-продукции в эксперименте на лабораторных животных.

1П. Оборудование, химическая посуда и реактивы

3.1.    Измерительный прибор - люминометр типа «Биотокс-10» с набором кювет на 1,5 мл.

3.2.    Лиофилизированная культура микроорганизмов «Эколюм» или иных препаратов бактериальной люциферазы.

3.3.    Весы лабораторные по ГОСТ OIML R 76-1—2011, высокого класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г.

3.4.    pH-метр любой марки с набором электродов.

3.5.    Сушильный электрический шкаф, ГОСТ 13474.

3.6.    Холодильник бытовой, обеспечивающий температуру от-18 до +4 °С.

3.7.    Пробирки с притертыми пробками объемом 3—5 мл, ГОСТ 1770—74.

3.8.    Дозаторы лабораторные по ГОСТ 28311. Цилиндры вместимостью 25, 50 мл, второго класса точности, ГОСТ 1770.

3.9.    Воронки делительные на 100 мл типа В Д-1-100.

3.10.    Фильтры бумажные «синяя лента» или обеззоленные типа ФОБ, ТУ 6-09-1678.

3.11.    Стаканчики для взвешивания диаметром 30, 40 мм, ГОСТ 7148.

3.12.    Вода дистиллированная, ГОСТ 6709.

3.13.    Кислота соляная, ГОСТ 3118.

3.14.    Натрия гидроокись, ГОСТ 4328.

3.15.    Цинк сернокислый 7-водный, ГОСТ 4174.

3.16.    Спирт этиловый, хч, ТУ 6-091710.

3.17.    Кислота серная, ГОСТ 4204.

3.18.    Термометр, предметное стекло (технические характеристики). Допускается применение аналогичного оборудования и материалов

с техническими и метрологическими характеристиками, а также реактивов по качеству не ниже указанных в п. 3 методических рекомендаций.

При их применении следует руководствоваться рекомендациями изготовителя.

IV. Проведение испытаний

4.1.    Условия выполнения токсикологических испытаний

При проведении испытаний в лаборатории должны быть соблюдены следующие условия:

-    температура воздуха    от 18 до 25 °С;

-    относительная влажность воздуха не более 80 %;

- атмосферное давление    84—106 кПа (630—800 мм рт. сг.);

-    частота переменного тока    (50 ± 1) Гц;

-    напряжение сети    (220 ± 10) В.

4.2.    Отбор проб проводится по ГОСТ 29188.0-2014.

4.3.    Приготовление экстрактов из образцов ПК-продукции

4.3.1. Из поступивших на испытания образцов одного наименования (не менее двух единиц) составляют объединенную пробу. Опытные образцы готовят путем разбавления испытуемых образцов в модельной среде (дистиллированная вода).

В сосуд помещают необходимое количество пробы ПК-продукции, заливают определенным объемом дистиллированной воды и выдерживают (настаивают) в термостате при температуре 37 °С определенное время (продолжительность экстракции).

Соотношение массы (объема) испытуемой продукции и объема модельной среды, а также продолжительность экстракции, приведены в табл. 1.

После окончания экстракции полученные экстракты охлаждают до комнатной температуры и отделяют водную фазу фильтрацией или с помощью делительной воронки.

Испытуемые образцы продукции на носителях предварительно измельчают ножницами.

Испытуемые образцы ПК-продукции, представляющей собой жиросодержащие средства, порошкообразные и компактные, эмульсии и суспензии, продукцию на носителях, требуют периодического перемешивания в течение времени экстракции.

По продукции, применение которой согласно аннотации подразумевает смешивание нескольких компонентов перед применением (для окрашивания, осветления, мелирования волос, для химической завивки или распрямления волос, сухие косметические маски и другая аналогичная продукция), испытуемые образцы готовят в зависимости от полученной консистенции готовой композиции.

Средства для ухода за ногтями требуют предварительной подготовки. На предметное стекло (2x2 см) ровным слоем наносят исследуемую навеску (1 г) образца и оставляют при комнатной температуре до полного высыхания. Высушенную пробу переносят в сосуд с дистиллированной водой и готовят экстракт в соответствии с п. 4.3.1.

Таблица 1

Условия приготовления водных экстрактов в зависимости от вида продукции

№ п/п Вид ПК-продукции Масса или объем образца Объем дистиллированной воды, мл Степень разведения Продолжи тельность экстракции, мин 1 2 3 4 5 6 1 Продукция косметическая гигиеническая моющая 1 мл 20 1 :20 10 2 Жиросодержащие косметические средства 0,1 мл или 0,1 г 100 1 : 1 000 60 3 Продукция косметическая жидкая, не содержащая спирт 0,1 мл или 0,1 г 100 1 : 1 000 60 4 Гели косметические 0,1 мл или 0,1 г 100 1 : 1 000 60 5 Продукция декоративной косметики на эмульсионной основе 0,1 мл или 0,1 г 100 1 : 1 000 60

Продолжение табл. 1

I 2 3 4 5 6 6 Продукция косметическая для окрашивания, осветления, химической завивки и выпрямления волос 0,1 мл или 0,1 г 100 1 : 1 000 60 7 Продукция косметическая на носителях 0,1 мл или 0,1 г 100 1 : 1 000 60 8 Пилинги, скрабы, экс-фолиашы 0,1 мл или 0,1 г 100 1 : 1 000 60 9 Интимная косметика 0,1 мл или 0,1 г 100 1 : 1 000 60 10 Парфюмерная и косметическая спиртосодержащая продукция 1 мл 20 1 :20 10 11 Дезодоранты и депиля-торы в аэрозольной упаковке 0,1 мл 100 1 : 1 000 10 12 Продукция декоративной косметики порошкообразная и компактная, тальк, присыпки, зубные порошки 0,1 г 100 1 : 1 000 10 13 Кремы косметические для ухода за кожей лица, тела, волосами, ногтями, губами, кожей вокруг глаз 1 г 10 1 :10 60 14 Продукция декоративной косметики на жировосковой основе 1 г 10 1 : 10 60 15 Дезодоранты и дениля-торы не в аэрозольной упаковке 1 г 10 1 : 10 60 16 Средства для маникюра и ухода за ногтями 1 г 20 1 :20 60 17 Мыло туалетное твердое, соли для ванн, сухие средства для ванн 0,1 г 100 1 : 1 000 60 18 Зубные пасты 1 г 1 000 1 : 1 000 60 19 Средства гигиены полости рта жидкие 1,0 мл 1 000 1 : 1 000 10 20 Средства для домашнего отбеливания зубов 1 г 1 000 1 : 1 000 60

Не допускается консервирование проб, предназначенных для исследования на токсичность.