МР 01.015-07
Экспресс-определение сакситоксина в моллюсках с помощью тест системы "RIDASCREEN FAST PSP (Saxitoxin)", производства фирмы R-Biopharm AG, Германия

ЭКСПРЕСС-ОПРЕДЕЛЕНИЕ САКСИТОКСИНА В МОЛЛЮСКАХ С ПОМОЩЬЮ ТЕСТ-СИСТЕМЫ «RJDASCREEN FAST PSP (Saxitoxiu)», производства фирмы R-Biopharro AG, Гермаыия

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ № 01.015 -07

2

Экспресс-определение сакситоксина в моллюсках с помощью тест-системы «Ridascreen Fast PSP (Saxiloxin)», производства фирмы R-Biophann AG, Германия. Методические рекомендации -    М.:    ФГУЗ    «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии»

Роспотребнадзора, 2007. -15 с.

1.    Методические рекомендации разработаны:

ГУ НИИ питания РАМН (академик РАМН, профессор В.А. Тутельян, д.м.н., профессор С.А. Хотимчеико, Ю.А. Коханова), Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора ( И.В. Брагина, Е.С.Шальнова , Л.С. Осипова), ООО «Стайлаб» (А.В. Галкин).

2.    Рекомендованы к утверждению Лабораторным советом Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека ( протокол от 28 мая 2007 г.)

3.    Утверждены и введены в действие Председателем Лабораторного совета Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека , Главным врачом ФГУЗ « Федеральный центр гигиены и эпидемиологии » Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека А.И. Верещагиным 15 июня 2007 г.

4.    Введены впервые. ¹

-    в процессе выполнения анализа не допускайте полного высыхания лунок планшета. Избегайте перерывов между отдельными рабочими стадиями;

-    воспроизводимость результатов кммунофермевтиого анализа существенно зависит от тщательности отмывки планшета в процессе анализа. Внимательно следуйте описанпой далее процедуре отмывкл планшета;

-    на всех стадиях инкубации избегайте воздействия прямого солнечного света. При инкубации рекомендуется прикрыть планшет непрозрачным экраном.

9.2    Приготовление раствора коньюгата

Конъюгат сакситоксина с ферментом (флакон с красной крышкой) поставляется в концентрированном виде. Поскольку разбавленный раствор конъюгата имеет ограниченную стабильность, следует готовить раствор по потребности. Перед разбавлением концентрированного раствора коньюгата осторожно встряхивают содержимое флакона. Для приготовления готового к использованию раствора конъюгата разбавляют концентрат конъюгата буферным раствором, имеющимся в комплекте набора, в отношения 1:11 (например, смешивают 200 мкл концентрата конъюгата с 2 см¹ буфера - данного разведения достаточно для 4-х стрипов)

9.3    Приготовление раствора антител

Антитела к сакситоксину (флакон с черной крышкой) поставляются в концентрированном виде. Поскольку разбавленный раствор антител имеет ограниченную стабильность, следует готовить раствор по потребности. Перед разбавлением конце!прата шгтител осторожно встряхивают содержимое флакона. Для приготовления готового раствора антител разбавляют концентрат буферным раствором, имекицимся в комплекте набора, в отношении 1:11 (например, смешивают 200 мкл концентрата антител с 2 см¹ буфера -данного разведения достаточно для 4-х стрипов).

9.4. Проведение измерений

9.4.1.    Извлекают из фондированного пакета необходимое количество лунок - по одной лунке на каждую пробу. Помещают лунки в рамку.

9.4.2.    Оставшиеся лунки немедленно упаковывают в фольгированный пакет вместе с осушителем и помещают на хранение при 4°С.

9.4.3.    Наносят координаты лупок, предназначенных для стандартных растворов и подготовленных исследуемых растворов на разграфленную бумагу как это показано на рисунке (Ст. - стандарты, Пр. - пробы):

Стрип 1	Стрип 2	Стрип 3	Стрип 4	Стрип 5	Стрип 6
Ст. 1	Г1р.З	Пр. 11	Пр. 19	Пр. 27	Пр. 35

Ст.2	Пр. 4	Пр. 12	Пр. 20	Пр. 28	Пр.36
Ст.З	Пр. 5	Пр.13	Пр. 21	Пр. 29	Пр. 37
Ст.4	Пр.6	Пр. 14	Пр. 22	Пр. 30	Пр. 38
Ст.5	Пр. 7	Пр. 15	Пр. 23	Пр.31	Пр. 39
Ст.6	Пр. 8	Пр. 16	Пр. 24	Пр. 32	Пр. 40
Пр. 1	Пр. 9	Пр. 17	Пр. 25	Пр. 33	Пр. 41
Пр. 2	Пр. 10	Пр. 18	Пр. 26	Пр. 34	Пр. 42

9.4.4.    Помечают луню*, чтобы идентифицировать их после промывки.

9.4.5.    Осторожно, не допуская вспенивания, перемешивают реагенты во флаконах.

9.4.6.    Перед липегированнем смачивают каждый свежий наконечник пипетки дозируемым раствором (набирают и выпускают раствор).

9.4.7.    Добавляют по 50 мкл стандартных и исследуемых растворов в соответствующие лунки. При каждом дозировании используют новый нахонечник дозатора.

9.4.8.    Осторожно, не касаясь лунок, добавляют по 50 мкл готового разбавленного раствора конъюгата в каждую лунку, согласно рисунку на разграфленной бумаге (см.п.

9.4.3.)-

9.4.9.    Таким же образом добавляют в каждую лунку по 50 мкл готового разбавленного раствора антител.

9.4.10.    Перемешивают вручную, соблюдая осторожность, и оставляют на инкубацию в течение 15-ти минут при комнатной температуре (20 - 25°С)

9.4.11.    Выливают жидкость из лунок в раковину, переворачивают рамку планшета и выбивают капельки жидкости, оставшиеся в лунках, путем энергичного троекратного постукивания рамки с лунками по столу, накрытому чистой фильтровальной бумагой.

9.4.12.    С помощью промывалки или многоканальной пипетки наполняют лункя по 250 мкл дистиллированной (или деионизованной) воды и снова выливают воду. Выбивают капельки воды как описано выше. Повторяют процедуру промывки лунок водой еще дза раза.

9.4.13.    Добавляют по 2 капли (по 100 мкл) субстрата/хромогена (флакон с белой крышкой) в каждую лунку.

9.4.14.    Перемешивают вручную, соблюдая осторожность, и инкубируют при комнатной температуре (20 - 25 °С) в течение 15 минут в темноте.

9.4.15.    Добавляют в каждую лунку по 2 капли (по 100 мкл) стоп-реагснта (желтая крышка) и осторожно перемешивают вручную.

13

9.4.16. В течение 10-ти минут после добавления стоп-реагепта измеряют оптическую плотность в каждой лунке при 450 нм ("бланк" или нулевое считывание по воздуху).

10. Обработка результатов измерении

Средние значения оптической плотности, измеренной в лунках со стандартными и исследуемыми растворами делятся на среднее значение оптической плотности, измеренной в лунках с первым (нулевым) стандартом, результат умножается на 100. Таким образом, результат измерения оптической плотности выражается в процентах от оптической плотности лунки с нулевым стандартом, то есть:

Оптическая плотность лунки со стандартом (провой)

-------------------- X    100    =    %    поглощения

Оптическая лютностъ лунки с нулевым стандартом

По величинам относительного поглощения, вычисленным для стандартных растворов, и соответствующим значениям концентрации сакситоксина в мкг/кг строится калибровочная кривая в полулогарифмической системе координат. Калибровочная кривая должна быть почт линейна в диапазоне 5-20 мкг/кг

Рисунок 1. Калибровочная кривая, полученная для набора реагентов «RIDASCREEN FAST PSP (Saxitoxin)»

гл    s    to    к    40    (panel Концентрация, мкг/кг

Концентрация сакситоксина в исследуемых растворах в мкг/кг считывается по калибровочной кривой соответственно относительному поглощению, измеренному и вычисленному для этих растворов.

Внимание:

14

Для того чтобы вычислить концентрацию сакситоксина в исследуемой исходной пробе, величину концентрации, полученную по калибровочной кривой, следует умножить на соответствующий фактор разбавления. При выполнении пробоподготовки и анализа в полном соответствии с приведенной методикой фактор разбавления принимает следующие значения:

Моллюски - 20 (или 200 при повторном разбавлении по п. 8.3.6)

Для компьютерной обработки результатов измерений рекомендуется использовать специализированное программное обеспечение, например, RIDA® SOFT. При компьютерной обработке результатов следует руководствоваться инструкцией по использованию программного обеспечения и рекомендациями разработчика.

15

СОДЕРЖАНИЕ

1.    Назначение и область ирименспкя

2.    Общие положения

3.    Принцип метода

4.    Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

5.    Требования безопасности

6.    Требования к квалификации персонала

7.    Условия измерений

8.    Подготовка к проведению анализа

9.    Выполнение измерений

10.    Обработка результатов измерения

УТВЕРЖДАЮ Главный врач ФГУЗ «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Председатель Лабораторного совета Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

А.И. Верещагин

ЭКСПРЕСС-ОПРЕДЕЛЕНИЕ САКСИТОКСИНА В МОЛЛЮСКАХ С ПОМОЩЬЮ ТЕСТ-СИСТЕМЫ «RIDASCREEN FAST PSP (Saxitoxin)», производства фирмы R-Binpharm AG, Германия

МР Л* 01.015-07

1. Назначение а область применения

Настоящие методические рекомендации устанавливают методику экспресс-определения содержания сакситохеина в моллюсках методом иммупоферментного анализа. Диапазон определяемых концентраций составляет 50 - 800 мкг/кг.

2. Общие положения

Фикотоксины представляют собой группу веществ, продуцируемых некоторыми видами водорослей, микро водорослей и цианобактерий. Эти вещества способны аккумулироваться в организме морских и пресноводных животных и, при попадания в организм человека, вызывать отравления различной степени тяжести.

Токсины, входящие в группу PSP (paralytic shellfish poison) (паралитический яд моллюсков), являются одними из сильнейших нервно-паралитических ядов, известных человечеству. Свое название они получили по синдрому вызываемого ими отравления. ²

Существует более 24 форм PSP, обладающих способностью к взаимопревращению в метаболических реакциях. Сакситоксин является наиболее токсичным представителем данной группы веществ.

Отравления людей токсинами группы PSP происходят ежегодно. Основными продуктами, употребление которых приводит к интоксикации, являются двустворчатые моллюски. Установлено, что тепловая обработка или замораживание не позволяют полностью освободить продукты от PSP. Около 15% всех зарегистрированных случаев отравления приводят к летальному исходу.

Механизм действия сакситоксина и его производных заключается в блокировании токсином тока ионов натрия через иотенциал-зависимые натриевые каналы в мембранах нервных и мышечных клеток, что ведет к нарушению клеточной деполяризации и, как следствие, нарушению проводимости.

Проявления отравления PSP варьируются от чувства онемения и легкого покалывания в области губ до летального исхода. В среднетяжелых п тяжелых случаях к этим ощущениям присоединяется онемение кончиков пальцев кистей рук и стоп, которое в течение 4-6 часов распространяется на руки, ноги и шею. Резко затруднены движения. Нарушаются функции черепно-мозговых нервов. Реже встречаются гастроинтестинальные симптомы, которые проявляются в виде тошноты, рвоты, диареи и болей в животе. Сознание пострадавших остается ясным.

В случае летального исхода смерть наступает в результате развития дыхательной недостаточности в течение 2-12 часов с момента отравления.

Антидота для токсинов PSP на данный момент нс существует.

Безопасный уровень содержания PSP в тканях моллюсков был установлен FDA (Food and Drug Administration) и составляет SO микрограмм/ЮОграмм продукта.

В последнее время в целях скрининга за рубежом в рутинной лабораторной практике широко применяется метод иммуноферментного анализа (ИФА).

Наборы «RIDASCREEN FAST PSP (Saxitoxin)» представляют собой тест-системы для иммуноферментного анализа в комплекте с необходимыми реагентами, выпускаются серийно и предназначены для экспресс-определения сакситоксина и некоторьос его производных в моллюсках.

3. Принцип метода

Принцип работы тест-системы «RJDASCREEN FAST PSP (Saxitoxin)» основан на методе конкурентного иммуноферментного анализа (ИФА). В основе процедуры анализа ³

лежит взаимодействие антигенов с антителами. Поставляемый в комплекте набора планшет сенсибилизирован антителами «захвата», специфичными к антителам .к сакситоксину.

Анализ выполняется следующим образом. Исследуемые и стандартные образцы, препарат, содержащий антитела к сакситоксину и препарат, содержащий конъюгат сакситоксина с ферментом, дозируются в лунки активированного планшета. При инкубации планшета в течение определенного времени молекулы сакситоксина и молекулы конъюгата сакситоксина с ферментом, конкурируя между собой, связываются антителами к сакситоксину. В то же самое время, при инкубации, происходит иммуносорбция этих антител на поверхнос1ъ лунок планшета за счет их взаимодействия с антителами «захвата» на поверхности

Далее, путем промывки планшета, из лунок удаляются свободные молекулы конъюгата.

После промывки планшета в его лунки дозируется раствор, содержащий субстрат и хромоген. В процессе инкубации, при химическом взаимодействии субстрата с хромогеном, в котором ферментный фрагмент молекулы конъюгата, связанной на поверхности лункя, выступает в качестве катализатора, образуются охрашеяные продукты реакции. После определенного времени развития данной реакции, в результате которой хромоген окрашивается в голубой цвет, в лунки добавляется стоп-реагент, при этом голубой цвет раствора меняется иа желтый.

Оптическая плотность в лунках, измеренная на планшетном фотометре при 450нм, обратно пропорциональна концентрации сакситоксина в исследуемых образцах.

4. Средства измерении, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

При выполнении измерений концентрации сакситоксина применяются следующие средства измерения, реактивы, вспомогательные устройства и материалы.

4.1 Средства измерений

Спектрофотометр для ИФА (рндер) с фильтром 450 нм;

Весы лабораторные общего назначения 2-го класса

точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г ;    ГОСТ    24104

Одиоканальные автоматические пипетки, объем дозирования 50мкл;

Одноканальные автоматические пипетки переменного объема 100- 1000 мкл;

8-каналыгые автоматические пипетки на 250 мкл;

Колбы мерные вместимостью 50 и 250 см³ ;    ГОСТ1770

Пипетка градуированная 2-го класса точности вместимостью 5 см³ ГОСТ 29227 ⁴

4.2    Реактивы

Тест-система «RJDASCREEN FAST PSP (Saxiloxin)» для иммуноферментного анализа в стандартной комплектации, включая:

Микротитровальный планшет на 48 лунок (6 стрипов по 8 лунок), сенсибилизированный антителами «захвата»;

Комплект стандартных растворов сакситоксигна. объемом 1,3 см³, со следующими концентрациями: 0 мкг/ дм³, 2^ мкг/ дм³, 5 мкг/ дм³, 10 мкг/ дм³, 20 мкг/ дм³,40 мкг/ дм³;

Конъюгат сакситоксина с пероксидазой (красная крышка), концентрированный раствор объемом 0,4 см³;

Антитела к сакситоксшгу (черпая крышка), концентрированным раствор объемом 0,4 см³;

Субстрат/хромоген (белая крышка), подкрашенный раствор объемом 6,0 см³; Стоп-реагент (желтая крышка), содержащий 1 N раствор серной кислоты, объемом 6,0 см³;

Буфер для разбавления конъюгата, антител и растворов образцов, объемом 50см³; Инструкцию по использованию тест-системы на русском и английском языках. Соляная кислота концентрированная    ГОСТ 3118-77

Дистиллированная или деионизированная вода    ГОСТ 6709

4.3    Вспомогательные устройства и материалы Блендер или гомогенизатор для измельчения моллюсков; pH-метр;

Центрифуга напольная;

Водяная баня;

Магнитная мешалка с подогревом;

Тефлоновые метатели;

Магнитная удочка;

Воронка стеклянная    ГОСТ 25336

Стаканы термостойкие    ГОСТ 25336

Впалы темного стекла объемом 2 см³

Пробирки центрифужные объемом 10 см³    ГОСТ25336

Наконечники для автоматических пипеток

Листовая фильтровальная бумага

Разовые резиновые перчатки

Тара для лабораторных отходов

4.4 Замечания по использованию и хранению тест-систем

Не используйте тсст-систему с истекшим сроком годности. Срок годности тест-системы указан на этикетке.

Не заменяйте реагенты в составе одного набора реагентами из другого набора с другим номером партии. Нс используйте реагенты других производителей. Разбавление или замена реагентов может привести к потере чувствительности определения.

Храните набор при температуре 2-8 °С. НЕ ЗАМОРАЖИВАЙТЕ НАБОР.

Для хранения неиспользованных стриаов (лунок) упакуйте их в фольгированный пакет вместе с силикагелем (осушителем) и плотно закройте пакет.

Поскольку раствор хромогена светочувствителен, избаайте попадания прямых солнечных лучей на флакон с раствором.

В случае голубоватого окрашивания раствора субстрата/xpOMOi сна не рекомендуется использовать раствор, так как это является признаком порча.

В случае если величина оптической плотности, измеренной в лунке с нулевым стандартом, нс превышает 0,6, это может быть признаком порчи реагентов.

5. Требования безопасности

5.1.    При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности по ГОСТ12.1.004 и электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, указанные в технической документации на весы, спектрофотометр и вспомогательные устройства.

5.2.    Помещение, в котором производится выполнение измерений, должно быть снабжено приточно-вытяжной вентиляцией.

5.3.    Внимание! Стандартные растворы содержат сакснтоксин. При работе используйте разовые резиновые перчатки, избегайте контакта реагентов с кожей.

5.4. После каждого анализа следует тщательно промывать оборудование и лабораторную посуду для предотвращения перекрестного загрязнения от пробы к пробе. Все использованные материалы, жидкие отходы, расходные материалы и лабораторная посуда должны быть деконтаминированы путем замачивания в течение 30 минут в 5% растворе гипохлорита натрия с последующим добавлением в раствор ацетона 5% по объему и выдерживанием еще 30 мииуг. Затем лабораторную посуду следует отмыть обычными лабораторными моющими средствами и промыть дистиллированной водой.

5.5. Стоп-реагент содержит в своем составе серную кислоту. Избегайте контакта, стоп-реагента с кожей.

6. Требования к квалификации персонала

К выполнеиию измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие высшее или среднее специальное образование, прошедшие соответствующий инструюгаж, освоившие метод в процессе стажировки.

7. Условия измерений

При выполнении измерений в лаборатории должны быть соблюдены следующие условия:

20-25 °С

84.0 - 106.7 кПа (630 - 800 мм. рт. ст.); не более 80% при температуре 25 °С;

220 ±10 В;

Частота переменного тока 50 ± 1 Гц

8. Подготовка к проведению анализа

8.1. Отбор проб

Отбор проб осуществляют в соответствии с действующей нормативной документацвей по отбору проб. Пробы доставляют в лабораторию немедленно после их отбора. Пробы, предназначенные для анализа, должны храниться в холодном темном месте.

8.2 Подготовка реактивов и материалов

Перед использованием доведите температуру всех реагевтов (включая дистиллированную воду) до комнатной (20-25 °С). Это займет около I часа.

Стандартные растворы. Стандартные растворы сакситоксина поставляются готовыми для использования. Величина концентрации сакситоксина, нанесенная на флаконы с растворами дана без учета фактора разбавления исследуемых образцов при пробоподготовке, поэтому для расчета результата определения требуется учитывать фактор разбавления.

Приготовление 0,1 Н раствора соляной кислоты. В мерной колбе объемом 250 см³ 2,1 см³ концентрированной соляной кислоты разводят до 250 см³. Раствор тщательно перемешивают. Срок хранения раствора при комнатной температуре не ограничен.

Ю

Приготовление 5 Н раствора соляной кислоты. В мерной колбе объемом 50 см³ 20,6 см³ концентрированной соляной кислоты разводят до 50 см³. Раствор тщательно перемешивают. Срок хранения раствора при комнатной температуре не ограничен.

Микротитровалъный планшет. Перед выполнением анализа из планшета следует извлечь необходимое количество стрипов (лунок) вместе с рамкой. Остальные стрипы (лунки) следует тщательно упаковать в фольгированиый пакет вместе с осушителем, закрыть застежку пакета и поместить на хранение при температуре 2 - 8 °С.

8.3. Пробонодготовка

8.3.1.    Раскрывают раковину, промывают мясо моллюска водой, обсушивают и гомогенизируют образец.

8.3.2.    Взвешивают 10 г гомогената, смешивают навеску в стаканчике с 30 см³ соляной кислоты (0,! И ).

8.3.3.    Кипятят в течение 5-тн минут при перемешивании на магнитной мешалке с подогревом (допускается использование водяной бани).

8.3.4.    Центрифугируют в течение 10 мин при эффективности 3500 g (иногда супернатант получается мутным, однако это не влияет на результаты последующего анализа)

8.3.5.    После центрифугирования проверяют pH супернатанта, если величина pH более 4,0, закисляют раствор с помощью 5Н соляной кислоты.

8.3.6.    Отбирают 100 мкл супернатанта, переносят в чистую пробирку (или виалку), с помощью разбавляющего буфера доводят объем раствора до 1 см³ (разбавление в 10 раз)* для анализа используют 50 мкл раствора на лунку планшета

* для проб с высоким уровнем содержания сакситоксина, результат определения, возможно, не будет попадать в линейный диапазон калибровочной кривой или будет находиться вообще вне диапазона калибровки. В этом случае рекомендуется разбавить раствор еще в десять раз разбавляющим буфером и при расчетах принимать во внимание фактор разбавления - 200.

9. Выполнение измерений

9.1. Предварительные замечания к проведению измерений с помощью тест-системы «RJD A SCREEN FAST PSP (Saxitoxin)»:

-    немедленно после использования охлаждают все оставшиеся реагенты до температуры 2 - 8 °С, избегайте длительного хранения реагентов при комнатной температуре;

-    иммуноферментная реакция начинается после добавления в лункн планшета препарата антител. При дозировании рекомендуется использовать многоканальную пипетку;

п

1

2

3

4