Методика предназначена для одновременного определения концентраций сорбиновой и бензойной кислот н пищевых продуктах, пищевых и биологически активных добавках.

Бензойная и сорбиновая кислоты и их соли широко используются в качестве пищевых добавок, обладающих консервирующими свойствами.

Бензойная кислота.

По внешнему виду белый кристаллический порошок. Брутто формула СдНзСОаН. молекулярная масса - 122,12v Температура плавления - 122,05 °С, температура кипения - 249,2 °С. Растворимость в воде - 0,3 г/100 см³ (20 °С), растворима в спирте, эфире, ацетоне, метаноле, бензоле, хлороформе.

По внешнему виду белый кристаллический порошок. Брутто формула CeHgOs. Молекулярная масса -112, температура плавления 134 °С. Растворима в воде, спирте, ацетоне, метаноле.

Метод определения химических консервантов сорбиновой и бензойной кислот основан на извлечении определяемых веществ водой, обезжиривании экстрактов гексаном с последующим анализом аликвотной части водного раствора методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в режиме изокразичсского разделения на колонке с обращенной фазой Hypcrsil ODS (Cig) с использованием ультрафиолетового или диодно-матричного детектора.

Нижний предел измерения составляет для бензойной кислоты - 0,01 мкг, для сорбиновой кислоты - 0,0025 мкг.

Диапазон определяемых концентраций:

-    бензойная кислота: 20 4000 мг/кг (мг/л);

-    сорбиновая кислота: 50 - 2000 мг/кг (мг/л).

Присутствующие в экстракте коэкстрактивные вещества определению не мешают. Время определения составляет 15-40 мин, включая подготовку образца.

1 Нормы погрешности измерений

Относительные значения показателей точности, правильности, повторяемости и воспроизводимости МВИ при доверительной вероятности Р = 0,95 в диапазоне определяемых концентраций для бензойной кислоты 20 - 4000 мг/кг (мг/л), для сорбиновой кислоты 50 -2000 мг/кг (мг/л) указаны в таблице 1. Огносительные значения предела повторяемости и предела воспроизводимости МВИ при доверительной вероятности Р = 0,95 указаны в таблице 2.

1 замена

ПРИЛОЖЕНИЕ А (рекомендуемое)

Пример порядка приготовления и подготовки к анализу водного раствора сорбиновой и бензойной кислот (аттестованной смеси) для проведения контроля погрешности МВИ

1)    Приготовление водного раствора бензойной кислоты концентрации 8000 мкг/см³ и сорбиновой кислоты концентрации 4000 мкг/см³

Взвешивают 0,8 ± 0,001 г бензойной кислоты и 0,4 ± 0,001 г сорбиновой кис.юты, растворяют дистиллированной водой в мерной колбе на 100 см³; и доводят объем до метки.

2)    Приготовление водного раствора сорбиновой и бензойной кислот концентрации 2000 мкг/см³ и 1000 мкг/см³ соответственно

Отбирают 10 см³ полученного раствора и добавляют 30 см³ дистиллированной воды.

3)    Подготовка к анализу аттестованной смеси

Отбирают 5 см³ водного раствора сорбиновой и бензойной кислот, помещают в стеклянный стакан, смешивают с небольшим количеством дистиллированной воды (50-80 см³), количественно переносят в мерную колбу вместимостью 200 см³, добавляют 15 см³ раствора Карреза I и 15 см³ раствора Карреза II. Содержимое колбы доводят дистиллированной водой до метки, тщательно перемешивают и фильтруют через бумажный фильтр. Фильтрат помещают- в делительную воронку, добавляют 20-30 см³ гексана и встряхивают в течение 1-2 мин. После разделения фаз водный экстракт фильтруют через бумажный фильтр.

Полученный экстракт анализируют согласно МВИ.

I новый

Таблица 1 Относительные значения показателей точности, правильности, повторяемости и воспроизводимости МВ И при доверительной вероятности Р~0,95

— Наименование консерванта — Диапазон измерений, мг/кг (мг/л) — Показатель повторяемости (СКО повторяемости), % Показатель воспроизводимости (СКО воспроизводимости). s*,% Показатель правильности (границы, в которых находится нсисключенная систематическая погрешность), ±Дс% Показатель точности (границы, в которых находится погрешность методики), ±Д,% Бензойная кислота 20-4000 1,4 1,1 9 10 Сорбиноная кислота 50-2000 1,7 1,1 10 11

Таблица 2 - Относительные значения предела повторяемости и предела воспроизводимости МВИ при доверительной вероятности Р-0,95

Наименование консерванта Диапазон измерений, мг/кг (мг/л) Предел повторяемости (для двух результатов параллельных определений), г,% Предел воспроизводимости (для двух результатов анализа), R, % Предел воспроизводимости результатов, выполненных в 2-х лабораториях, 1,4 х R, % Бензойная кислота 20-4000 3,9 3,0 4,2 Сорбиновая кислота 50-2000 4,7 3,0 4Д

2 Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

2.1 Средства измерений:

Жидкостной хроматограф со снектрофотометричсским или диодно-матричным детектором, обеспечивающим проведение измерений в диапазоне 200 - 450 нм

Микрошприцы для жидкостной хроматографии на 0,05 См фирмы Hamilton

Кран-дозатор с петлей на 0,02 см³ для ручною ввода пробы

Весы аналитические ВЛР-200

Колбы мерные Стаканы химические Пипетки вместимостью 0,1 см3, 0,2 2,0 см3, 5,0 см3,10,0 см3

2-50-2 ГОСТ 1770-74 2-100-2 ГОСГ 1770-74 2-200-2 ГОСГ 1770-74 2-1000-2 ГОСТ 1770-74 ГОСТ 1770-74 , 1,0 см3. ГОСТ 20292-74 500,0 см3    ГОСТ    25336-82

---

Воронки делительные

3

Цилиндры мерные    1000,0    см³

2.2 Вспомогательные устройства.

Колонка хроматографическая размером 125x4 мм, зернение частиц 5 мкм	Hypersil ODS (С,8)
Фильгр «синяя лента» Мономер И-135 Электрод стеклянный 2.3 Материалы и реактивы Бензойная кислота	ГОСТ 12026-76 ГОСТ 22261-94 ТУ 25-07-567-69 Фирмы Merk,99,5% чистоты
Сорбиновая кислот	Фирмы Merk,99,5% чистоты
Ацетат натрия ClhCOONa 2П2О, о.с.ч.	ТУ 6-09-1567-72
Уксусная кислота, х.ч.	ГОСТ 61-75
Вода бидисгиллированная Ацетонитрил, ч.	ТУ 6-09-3534-74
Калий марганцовокислый, ч	ГОСТ 20490-75
Гексан, ч.	ТУ 6,09-3375-78
Калий железосинеродистый, ч.д.а	ГОСТ 4207-75
Цинк уксуснокислый, ч.д.а	ГОСТ 5823-78

Могут быть использованы другие средства измерения и вспомогательные устройства а также реактивы, по точности, не уступающие рекомендуемым в методике.

3    Метод измерения

Для определения концентраций сорбиновой и бензойной кислот используется метод высокоэффективной жидкостной хроматографии, основанный на измерении оптической плотности водных экстрат^тов пищевых продуктов с использованием диодно-матричного детектора мри длине волны 260 нм и ширине оптической полосы 80 нм после изократическою элюирования на колонке Hypersil ODS (C|g).

4    Требования безопасности

Анализ по данной методике должен выполняться согласно инструкции «Основные правила безопасности работы в химических лабораториях». - М.: Химия, 1979 г., инструкции по эксплуатации жидкостного хроматографа, а также «Общие правила пожарной безопасности Республики Беларусь для общественных зданий и сооружений. 11ПБ 1.04 - 2002»

5    Требования к квалификации оператора

К выполнению измерений могут быть допущены лица, имеющие

-----

специальное образование, изучившие требования безопасности и насттжито''¹ мзтвдииул

технической К|

прошедшие подготовку для работы в качесгвс оператора жидкостного хромагей^ф»!^^^^! J£h

6    Условия выполнении измерений

При выполнении измерений в лаборатории согласно ГОСТ 15150-69 должны быть соблюдены следующие условия:

-    температура воздуха при приготовлении растворов, в том числе градуировочных (20 ± 2) °С;

-    температура воздуха при выполнении измерений (20 ± 5) °С;

-    атмосферное давление 84,0-106,7 к! 1а (630-800 мм рт. ст.);

-    влажность воздуха не более 80 % при температуре 25 °С; напряжение питающей сети (230 ± 23) В;

-    частота переменного тока (50 ± 1) Гц

7    Подготовка к выполнению измерений

Перед выполнением измерений должны быть проведены следующие работы: подготовка измерительной аппаратуры, приготовление растворов, установление градуировочной характеристики и контроль погрешности, отбор проб к анализу.

7.1    Подготовка измерительной аппаратуры

Включают хроматограф согласно инструкции по эксплуатации. Устанавливают рабочие режимы для блока насосов и детектора (см. п.7.3 МВИ). Проводят- стабилизацию работы хроматографа на рабочих режимах в течение 20-30 мин. Условием стабильности является дрейф нулевого сигнала нс превышающий 1-2 % от шкалы рептстрации сигнала (0,1-0,05 единиц оптической плотности) при чувствительности, соответствующий минимально определяемой концентрации.

7.2    Приготовление растворов

7.2.1 Приготовление подвижной фазы (э.иоентов)

Взвешивают 2,36 г уксуснокислого натрия, растворяют в 970-980 см³ воды в мерной колбе на 1000 см³, устанавливают pH 4,3 - 4,4, используя уксусную кислоту, и доводят раст вор до метки водой. Полученный раствор используют для приготовления подвижной фазы (системы элюентов), состоящей из 0,02 М уксуснокислого натрия (pH 4,3 - 4,4) и ацетонитрила в соотношении 85:15 по объему.

Ацетонитрил пригодный для использования в качестве элюента для жидкостной хроматтлрафии получают из ацетонитрила марки “ч”. Для этого в перегонную колбу вместимостью 2 дм³ помещают 1,5 дм³ ацетонитрила марки “ч^г и 30 г КМпО*, кипятят с обратным холодильником 1 час и перегоняют с дефлешатором, отбирая фракции по 200 с.ч³. Первую фракцию отбрасывают, остальные фракции собирают. Перегонку прекращают, когдав колбе останется 200 см³ раствора.

7.2.2 Приготовление реактивов Карреза    i

tl*j ьи^орыашш

аиюрйно! 1}

VM'MTJIIUm /„■»//

5

200-300 см³ дистиллированной воды, помещают в мерную колбу вместимостью 1000 см‘ и доводят объем до мел ки дистиллированной водой. Раствор хранят в склянке из земного стекла не более месяца;

Реактив Карреза П: взвешивают 220 г ± 0,001 г цинка уксуснокислого, растворяют в 200-300 см³ дистиллированной воды, добавляют 30 см³ ледяной уксусной кислоты, помешают в мерную колбу вместимостью 1000 см³ и доводят объем до метки дистиллированной водой. Раствор хранят в склянке из темного стекла не более месяца.

7.2.3 Приготовление градуировочных растворов Приготовление основных стандартных растворов сорбиновой и бензойной кислот:

Готовят основной стандартный раствор бензойной кислоты концентрацией 100 мкг/см³, взвешивая 0,1 г ± 0,001 г бензойной кислоты и растворяя в мерной колбе на 1000 см³ водой. Раствор устойчив при хранении в холодильнике в течение 1 месяца.

Готовят основной стандартный раствор сорбиновой кислоты концентрацией 50 мкг/см³, взвешивая 0,05 г ± 0,001 г сорбиновой кислоты и растворяя в мерной колбе на 1000 см³ водой. Раствор устойчив при хранении в холодильнике в течение 1 месяца.

Приготовление смеси градуировочных растворов сорбиновой и бензойной кислот:

Для получения смеси градуировочных растворов сорбиновой и бензойной кислот соответствующих концентраций отбирают аликвотные части основных стандартных растворов сорбиновой и бензойной кислот в соответствии с таблицей 3, сливают попарно в мерные колбы па 100 см³ и доводят водой до метки.

Таблица 3 - Притотовленис градуировочных растворов

№ градуирово много раствора Концентрации сорбиновой кислоты в1радуировочном растворе, мкг/см1 Аликвотная часть основного стандартного раствора сорбиновой кислоты, см1 Кошдотрания бензойной кислоты в градуировочном растворе, мкг/см1 Аликвотная часть основного стандартного раствора бензойной кислоты, см1 1 0,25 0,5 1,0 1,0 2 1,0 2,0 2,0 2,0 3 2,0 4,0 4,0 4,0 4 50 10, 8,0 8,0 5 10,0 20,0 10,0 10,0 6 15,0 30,0 15,0 15,0 7 20,0 40,0 20,0 20,0

7.3 Установление градуировочной харакгерис!ики

Каждый градуировочный раствор хроматографируют по два раза, начи концен грации, принимая за результат измерения среднее арифметичес

измерений. Каждый градуировочный раствор готовится и хроматографируйся н

Vi с \ ". ^н

интервалом в 1 день.

6

125x4 мм, зернение частиц 5 мкм Длина волны поглощения

Ширина оптической полосы Время удерживания:

-    бензойной кислоты

-    сорбиновой кислоты

Для построения градуировочного «рафика измеряют площади пиков, соответствующие концентрациям сорбиновой и бензойной кислот в градуировочных растворах. По полученным данным рассчитывают коэффициаггы ре!рессии а и b прямо# Y - аХ -г Ь методом наименьших квадратов.

Градуировочный график строится с учетом вычисленных значений уравнения Y = aX + b,    (1)

где

-    Y- площадь пика сорбиновой/бензойной кислоты;

-    X- конценграция сорбиновой/бензойной кислоты в градуировочном растворе;

-    а и Ь- коэффициенты регрессии.

7.4    Контроль градуировочного графика

Контроль градуировочного графика осуществляется каждый раз перед началом измерений нс менее чем по двум точкам в рабочем диапазоне измерений. Для контроля применяются градуировочные растворы сорбиновой и бензойной кислот. Полученные при хромато!рафировании значения Y нс должны отклоняться от градуировочной прямой более чем на 7 % для бензойной кислоты; 8 % для сорбиновой кислоты. В противном случае необходимо построение hoboit) градуировочного графика нс менее чем по 5 точкам.

7.5    Подготовка анализируемых образцов

7.5.1 Соки, безалкогольные, слабоалкогольные, алкогольные напитки, вина, пиво, др. напитки

Проводят дегазирование пробы (для газированных напитков): 50 см³ пробы наливают в стакан вместимостью 100 см³, перемешивают стеклянной палочкой или шпателем 1-2 минуты и оставляют стоять 5-10 минут до прекращения выделения пузырьков yrneKHcnoTbi^^z^Sv

Огбирают 5 см³ образца, переносят в мерную колбу на 200 см³ и Раствор перемешиваю! и фильтруют через бумажный фильтр.

1 замена

7.5.2    Концентраты безалкогольных напитков, концентраты чая жидкие, жидкие фруктовые концентраты, настои из зрав, жидкие добавки к пище

Концентрат разбавляют согласно рецептуре приготовления, отбирают 5 см³ полученного раствора и далее как описано в п.7.5.1.

7.5.3    Икра

Отбирают среднюю навеску икры 2 г и тщательно растирают в ступке с небольшим количеством воды (5-7 см³). Гомогенат количественно переносят в мерную колбу на 200 см³ и доводят раствор до метки водой. Раствор перемешивают и фильтруют через бумажный фильтр.

7.5.4    Майонез, соусы

Навеску средней пробы 2 г растворяют в 200 см³ воды. Затем раствор встряхивают в делительной воронке с 30 см³ 1«ксана в течение 1-2 мин. После разделения слоев, гексан отбрасывают, а водный экстракт фильтруют через бумажный фильтр.

7.5.5    Маргарин, спреды, другие жировые продукз ы

Навеску средней пробы 2 г предварительно растворяют в 20-30 см³ гексана и количественно переносят в делительную воронку. Добавляют 200 см³ воды и встряхивают в течение 1-2 мин. После разделения фаз водный экстракт фильтруют через бумажный фильтр.

7.5.6    Кетчупы, йогурты, джемы, конфитюры, желе, мармелады, муссы, другие пастообразные продукты

Навеску средней пробы 2 г предварительно растворяют в 100-150 см³ воды и количественно переносят в мерную колбу на 200 см³ и доводят раствор до метки. Тщательно перемешивают и фильтруют через бумажный фильтр.

7.5.7    Пресервы, салаты, кондитерские, хлебобулочные изделия, готовые блюда

Для проведения анализа используют полностью изделие, включая соусные заправки, заливки, глазури, крема и др. Пробу массой 200-500 г гомогенизируют, пропуская через мясорубку, миксер и т.п. Отбирают среднюю навеску массой 2 г, добавляют- 100-150 см³ дистиллированной воды и количественно переносят в мерную колбу на 200 см³, доводят раствор до метки. Подготовленную, таким образом, пробу оставляют на 2-4 часа и затем фильтруют через бумажный фильтр.

После фильтрации проб для каждого продукта растворы должны быть прозрачными (без опалесценции). В противном случае применяются растворы Каррсза: отбирают среднюю навеску анализируемою образца массой 2 г, помещают в стеклянный стакан, смешивают с небольшим количеством дистиллированной воды (50 - 80 см³), количественно перенося! в мерную колбу

вместимостью 200 см³, добавляют 15 см³ раствора Каррсза I и 15 см³    II.

/%/о»_Лг

Содержимое колбы доводят дистиллированной водой до метки, тщательно пер£5$ии*лОДГ\^и

.    -    _ил    №    .sSSsWI

фильтруют через бумажный филмр.

8    Выполнение измерений

Экстракты, полученные при анализе пищевых продуктов в соответствии п.7.5 анализируют согласно п.7.3 настоящей МВИ. Определяют содержание анализируемых веществ, используя компьютерную систему обработки сишалов, или проводят расчет площадей пиков соответствующих сорбиновцй и бензойной кислотам общепринятыми методами при регистрации сигналов на самописце. Проводят анализ 2 параллельных проб.

9    Обработка результатов измерений

Содержание сорбиновой и бензойной кислот в мг/кг (мг/л) рассчитывают по формуле:

СхУ_

М<у\ ’

где

С - концентрация определяемого компонента, найденная по градуировочному графику, мкг/см³;

V,kctp- - объем воды, используемый для экстракции, см³;

М (V„p) - масса навески (объем) пробы, г (см³).

За результат анализа принимают среднее арифметическое параллельных определений. Вычисления проводят до второго десятичного знака, с последующим округлением до первого.

Допустимое расхождение между параллельными измерениями двух проб не должно превышать 3,9 % для бензойной кислоты и 4,0 % для сорбиновой кислоты.

Гарантированный результат анализа представляют в следующем виде:

С-С±ЛМВИ,    (3)

где

Г ^С'^+С’ 2

где

С| - концентрация бензойной или сорбиновой кислот в первой пробе, мг/кг (мг/л);

С2 - концентрация бензойной или сорбиновой кислот во второй (параллельной) пробе, мг/кг

(мг/л);

10 Контроль погрешности МВИ

Оперативный контроль процедуры анализа осуществляется на основе оценки погрешности результатов анализа при реализации КПКП (контрольной процедуры для контроля погрешности) с применением ОК (образца для контроля) (МИ 2335-2003 п. 5.5).

Образцами контроля могут быть:

- аттестованные образцы контролируемой продукции;

9

аттестованные по процедуре приготовления водные растворы (аттестованные смеси) сорбиновой и бензойной кислот. Погрешность аттестованной смеси не должна превышать 3 % относительных.

Порядок приготовления аттестованной смеси приведен в приложении А.

Образцы для контроля должны быть проведены через все стадии анализа в соответствии с

мви.

За результат контрольного измерения принимают среднее арифметическое из результатов двух параллельных определений.

Результат контрольной процедуры К_г рассчитывают по формуле

К« ~ X ср - С,    (5)

Где: X ср. - результат контрольного измерения образца для контроля;

С - аттестованное значение образна для контроля.

Норматив контроля К рассчитывается по формуле К = Ал,

где ± Ал - характеристика погрешности результатов анализа, соответствующая аттестованному значению ОК.

Ал = 0,01 х А х С,    (6)

где А - погрешность МВИ;

0,01 - пересчет в абсолютное значение.

Проводят сопоставление результата контрольной процедуры с нормативом контроля. Если результат контрольной процедуры удовлетворяет условию

Ik.Uk,    (7)

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (7) контрольную процедуру повторяют. При повторном невыполнении условия (7) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

Методика разработана лабораторией химии пищевых продуктов отдела физико-химических исследований ГУ «РНПЦ гигиены» М3 РБ.

Разработчики:

Зав. лабораторией ХПП, канд. хим. наук Старший научный сотрудник

1 замена

1

чаменз