СОДЕРЖАНИЕ

Область применения Точность измерений

Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы, материалы

Метод измерения

Требования безопасности

Требования к квалификации оператора

Условия выполнения измерений

Подготовка к выполнению измерений

Выполнение измерений

Обработка результатов измерений

Оформление результатов испытаний

Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях повторяемости

Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях

промежуточной прецизионности

Проверка стабильности результатов измерений

Приложение А. Нормативные ссылки

Приложение Б. Показатели прецизионности методики

Приложение В. 11ример расчета неопределенности измерений

Приложение Г. Примеры хроматограмм

Таблица 4 - Схема приготовления градуировочных растворов пенициллинов для анализа сухого молока, сухих детских молочных смесей, сухой молочной сыворотки и т.д.

Ns Гр.р- F* Концентрация каждого пенициллина, нг/см3 m («чистого образца»), г V (диет, воды), см3 V(оси. стандартного р-ра смеси пенициллинов), см3 V (р*ра внутр. стандарта), см3 V (ацетонитрила), см3 0 0(бланк) 1.00 7,00 0 0,05 (раствор Е) 10,0 1 2,0 1,00 6,80 0,20 (раствор Г) 0,05 (раствор Е) 10,0 2 4,0 1,00 6,60 0,40 (раствор Г) 0,05 (раствор Е) 10,0 3 10,0 1,00 6,00 1,00 (раствор Г) 0,05 (раствор Е) 10,0 4 20,0 1,00 6,80 0,20 (раствор В) 0,05 (раствор Е) 10,0 5 80,0 i,oo 6,20 0,80 (раствор В) 0,05 (раствор Е) 10,0 бП 100,0 1,00 6,00 1,00 (раствор В) 0,05 (раствор Е) 10,0

Таблица 5 - Схема приготовления градуировочных растворов пенициллинов для анализа мяса. субпродуктов и продуктов на их основе

Ns Гр.р- ра Концентрация каждого пенициллина, нг/см3 пт («чистого образца»), г V(диет, воды), см3 V (оси. стандартного р-ра смеси пенициллинов). см3 V (р-ра внутр. стандарта), см3 V(ацетонитрила), см3 0 0(бланк) 1,00 2,00 0 0,10 (раствор Е) 10.0 1 10,0 1,00 1,00 1,00 (раствор Г) 0,10 (раствор Е) 10,0 2 20,0 1,00 1,80 0,20 (раствор В) 0,10 (раствор Е) 10,0 3 80,0 1,00 1,20 0,80 (раствор В) 0,10 (раствор Е) 10,0 4 100,0 1,00 1,00 1,00 (раствор В) 0,10 (раствор Е) 10,0 5 400,0 1,00 1,60 0,40 (раствор Б) 0,10 (раствор Е) 10,0 6 800,0 1,00 1,20 0,80 (раствор Б) 0,10 (раствор Е) 10,0

Далее градуировочные растворы проходят через все стадии пробоподготовки согласно п. 8.7-8.10

8.3 Установление градуировочной характеристики

Полученные по п. 8.2.4.7 растворы хроматографируют, начиная с самой низкой

концентрации. При этом должны соблюдаться нижеследующие условия хроматографирования и

параметры настройки масс-детектора.

8.3.1 Условия хроматографирования

Колонка хроматографическая ZORBAX SB-C|g (2,1 х 150 мм), зернение 3,5 мкм

Объем вводимой пробы    20    мкл

Подвижная фаза состава    А    (0,1    %    раствор

(ацетонитрил)

1радиентнос элюирование: 0-11 мин / В от 0% до 60%; 11 - 16 мин / В 60%; 16 - 17 мин / В от 60% до 100%; 17 - 19 мин / В 100%; 19 - 20 мин / В от 100% до 0%; 20 - 28 мин / В 0%;

Скорость подачи подвижной фазы Температура термостата колонки

8.3.2 Параметры настройки масс-спектрометрического детектора

Скорость потока газа десольвации    560 щг/чвс

Давление на небулайзсре (распылителе)    241 ^х10’³ Па

Температура газа десольвации    350 °С

Напряжение на капилляре    4000 В

В таблице 6 представлены параметры воздействия на ионы пенициллинов в режиме мониторинга множественных реакций (MRM).

Таблица 6 - Параметры воздействия на ионы пенициллинов в режиме мониторинга

множественных реакций (MRM) с регистрацией положительных ионов (+)

Аналит «Родительский» ион, т/г «Дочерние» ионы, т/г Напряжение на фрагменторе, В Энергия соударений, эВ Амоксиниллин 366,2 349,1 / 114 75 2/15 I Ампициллин 350,2 160/106 95 5/15 Пенициллин G 335,2 176/160 80 10/15 1 Пенициллин G-cb 342,2 183,2/160,1 90 10/15 Пенициллин V 351,2 160,1/114,1 75 5/35 1 Оксациллин 402,2 243/160 85 10/5 [ Клоксациллин 436.1 277,1/160,1 85 10/10 1 Нафциллин 415,2 256/ 199,2 95 10/5 1 Диклоксациллин 470,1 311/160 95 10/10

Перед работой необходимо проводить оптимизацию насгроек масс-спс1сгрометричсского детектора в том числе напряжения на фрагментаторе и энергии в ячейке соударения.

Количественные измерения проводятся по одному, наиболее интенсивному, дочернему иону, а по соотношению откликов дочерних ионов подтверждается достоверность определения, так как эта величина является постоянной.

8.4 Построение градуировочных графиков

Выполняется построение 2-х градуировочных графиков для каждого пе11ищист^ЯГ’-^.

Для градуировочного графика №1 устанавливают зависимость относительной цдощади пика (площадь пика анализируемого вещества, деленная на площадь пика внутреннего стандарт)

V. 7Т■>.*» ^5,0,1    /

от соответствующей относительной концентрации антибиотика (концентрация анализируемого

Ч.' г*'»'- У

вещества, деленная на концентрацию внутреннего стандарта) в градуировочных растворах № 1 - 4, используя программное обеспечение Agilent MassHunter. Для построения градуировочного графика №2 устанавливают зависимость относительной площади пика от соответствующей относительной концентрации антибиотика в градуировочных растворах № 3 - 6. Градуировочный раствор № 0 используется для контроля за содержанием антибиотиков пенициллиновой группы в пищевой матрице.

По полученным данным методом наименьших квадратов рассчитывают коэффициенты регрессии а и b прямой

у = 6х + а,    (1)

где у - отношение площади пика каждого пенициллина к площади пика внутреннего стандарта;

х - отношение концентрации каждого пенициллина в градуировочном растворе к концентрации внутреннего стандарта;

а и Ь- коэффициенты регрессии.

8.5    Контроль градуировочного графика

Построение градуировочных графиков осуществляется каждый раз перед началом измерений. Контроль стабильности градуировочных графиков осуществляется в конце измерений по любой точке градуировочного графика, исключая первую и последнюю концентрации градуировочных растворов. Расхождение между измеренной концентрацией антибиотика в выбранном градуировочном растворе и его фактической концентрацией, выраженное в процентах, не должно превышать норматива контроля К_ф, установленного для каждого градуировочного графика. В приложении Б приведены рассчитанные значения К_ф для некоторых видов пищевых продуктов.

В противном случае необходимо провести построение нового градуировочного графика.

8.6    Подготовка анализируемых образцов

Отбирают не менее 1 кг пробы пищевого продукта или продовольственного сырья в соответствии с требованиями [9] п.7.

Отобранные пробы хранят в холодильнике.

Усредненную пробу образца предварительно тсрмостатируют при температуре (20 ± 5) °С.

8.7 Проведение пробоподготовки для анализа на содержание антибиотиков пенициллиновой группы жидких, пастообразных, твердых молочных продуктов (молоко, йогурт, сметана, сыр и т.д.)

К гомогенизированной навеске массой (1,000 - 1,500) ± 0,001 г пищево^о^продукта,

содержащего животноводческое сырье, взвешенной в полипропиленовой дфронрже объёмом 3    3    /o'/о»    нгя    им"*'-;    •

50 см, вносят 0,05 см внутреннего стандарта (пенициллин G-d₇) конденсацией 1,0/мкг/см

(раствор Е, приготовленный по п. 8.2.4.6.). В пробирку приливают 2 см³ дистиллированной воды, тщательно перемешивают, затем добавляют 10 см³ ацетонитрила и помещают на 10 минут на элсктровстряхиватель для экстракции. Далее пробы центрифугируют при 10000 об/мин в течение 10 минут при температуре 5 °С. После центрифугирования отбирают надосадочную жидкость и переносят ее в новую полипропиленовую пробирку. Далее пробирку помещают на нагревательный модуль и упаривают ацетонитрильный экстракт на нагревательном модуле в токе воздуха при 40 °С до 0,4 - 0,7 см³. К остатку приливают 5 см³ фосфатного буферного раствора с pH 6,5 и 5 см³ гексана, встряхивают в течение 5 мин. Далее содержимое пробирок отстаивается в течение 10 минут для достижения межфазного равновесия. Гексановую фракцию отбрасывают, отбирая верхний слой пипет-дозатором (полноту удаления гексана определяют общепринятыми методами - визуально по границе межфазного равновесия). Полученный водный экстракт очищают методом твердофазной экстракции на картриджах Cromabond HR-X, 3 см³, 200 мг. Перед нанесением экстракта картридж кондиционируют последовательно 3 см³ метанола и 3 см³ деионизованной воды. После пропускания экстракта картридж промывают 3 см³ деионизованной воды, сушат под вакуумом в течение 10 минут. Затем аналиты элюируют 3 см³ ацетонитрила. Элюат упаривают на нагревательном модуле при 40 °С досуха. К сухому остатку приливают 1,0 см³ деионизованной воды, помещают на встряхивагеь на 10 минут, затем фильтруют через мембранный шприцевой фильтр (13 мм, 0,2 мкм) из регенерированной целлюлозы в виалу. Полученный раствор используют для дальнейшего ВЭЖХ-МС/МС анализа.

8.8 Проведение пробоподготовки для анализа на содержание антибиотиков пенициллиновой группы сухих молочных продуктов (сухое молоко, сухая детская молочная адаптированная смесь, спортивное питание и т.д.)

К гомогенизированной навеске массой (1,000 - 1,500) ± 0,001 г сухого пищевого продукта,

содержащего животноводческое сырье, взвешенной в полипропиленовой пробирке объемом 50 см³, вносят 0,05 см³ внутреннего стандарта (пенициллин G-d7) концентрацией 1,0 мкг/см³ (раствор Е, приготовленный по п. 8.2.4.6.). В пробирку приливают 7 см³ дистиллированной воды, тщательно перемешивают, затем добавляют 10 см³ ацетонитрила и помещают на 10 минут на электровстряхиватсль для экстракции. Далее пробу центрифугируют при 10000 об/мин в течение 10 минут при температуре (5 ± 2) °С. После центрифугирования отбирают надосадочную жидкость и переносят ее в новую полипропиленовую пробирку. Далее пробирку помещают на нагревательный модуль и упаривают ацетонитрильный экстракт на нагревательном модуле в токе воздуха при 40 °С до 0,5 - 1,0 см³. Обезжиривание и дальнейшая пробоподготовка осуществляется согласно п.8.7.

8.9 Проведение пробоподготовки для анализа на содержание я&рйбиотиков пенициллиновой группы продуктов с высоким содержанием жира (масло, сгфед ц т.д.) .„.и**⁴

рО' -,«ци^И*¹ **

К гомогенизированной навеске массой (1,000 - 1,500) ± 0,001 г пищевого продукта,

содержащего животноводческое сырье, взвешенной в полипропиленовой пробирке объемом 50 см³, вносят 0,05 см³ внутреннего стандарта (пенициллин G-d?) концентрацией 1,0 мкг/см³

(раствор Е, приготовленный по п. 8.2.4.6.). В пробирку приливают 2 см³ дистиллированной воды и

10 см³ ацетонитрила, и перемешивают, затем добавляют 5 см³ гексана и помещают на 10 минут на электровстряхиватель для экстракции. Далее пробы центрифугируют при 10000 об/мин в течение 10 минут при температуре 5 °С. После центрифугирования верхний гексановый слой отбрасывают, отбирают надосадочную жидкость и переносят ее в новую полипропиленовую пробирку. Далее пробирку помещают на нагревательный модуль и упаривают ацетонитрильный экстракт на нагревательном модуле в токе воздуха при 40 °С до 0,4 - 0,7 см³. К остатку приливают 5 см³ фосфатного буферного раствора с pH 6,5, встряхивают в течение 5 мин. Далее полученный водный экстракт очищают методом твердофазной экстракции на картриджах Cromabond IIR-X, 3 см³, 200 мг согласно п. 8.7.

8.10 Проведение пробоподготовки для анализа на содержание антибиотиков пенициллиновой группы мяса,.мясных продуктов, субпродуктов и продуктов на их основе.

К гомогенизированной навеске массой (1,000 - 1,500) ± 0,001 г пищевого продукта,

содержащего животноводческое сырье, взвешенной в полипропиленовой пробирке объемом 50 см³, вносят 0,10 см³ внутреннего стандарта (пенициллин G-dj) концентрацией 1,0 мкг/см³ (раствор Е, приготовленный по п. 8.2.4.6.). В пробирку приливают 2 см³ дистиллированной воды, тщательно перемешивают, затем добавляют 10 см³ ацетонитрила и помещают на 10 минут на электровстряхиватель для экстракции. Далее пробы центрифугируют при 10000 об/мин в течение 10 минут при температуре 5 °С. После ценгрифугирования отбирают надосадочную жидкость и переносят се в новую полипропиленовую пробирку. Далее пробирку помещают на нагревательный модуль и упаривают ацетонитрильный экстракт на нагревательном модуле в токе воздуха при 40 °С до 0,4 - 0,7 см³. Обезжиривание и дальнейшая нробоподготовка осуществляется согласно

и.8.7.

9 Выполнение измерений

Анализ полученных по п. 8.7 - 8.10 фильтратов проводят на жидкостном хроматографе с масс-спектрометрическим детектором. Условия хроматографирования и параметры настройки масс-дстсктора такие же, как и при построении градуировочного графика п. 8.3. Определяют площади пиков, используя компьютерную систему обработки сигналов. Проводят анализ двух параллельных проб.

ВЭЖХ-МС анализ образцов должен выполняться в виде серии измерений включающей: 1) градуировочные растворы, 2) исследуемый образец, 3) образцы контроля стабильности

градуировки (QC).

Результаты измерений округляют до второго знака после запятой и шфажают в мкг/кг.

Если массовая доля аналита в анализируемой пробе превышает значение максимального градуировочного уровня, то анализ повторяют с уменьшенной в 2 - 5 раз навеской.

10 Обработка результатов измерений

Расчет концентрации каждого пенициллина, X, мкг/кг, проводят по формуле:

X = ^'^вия х    (2)

т

где, С₀щ - отношение концентрации пенициллина к концентрации внутреннего стандарта,

найденное по градуировочному графику, (СУС_вн.ст > нг/см³;

Смет- - концентрация внутреннего стандарта пенициллина, нг/см³;

m - масса навески, г;

V - объем разведения сухого остатка, 1,0 см³.

За окончательный результат измерения принимают среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений. Вычисления проводят до третьего знака после запятой и округляют до второго.

Допустимые расхождения между параллельными определениями по отношению к величине среднего арифметического значения не должны превышать предела повторяемости г, значения которого указаны а приложении Б (таблицы Б.1-Б.5).

Результат анализа X, представляют в следующем виде:

х₌х_!±х₁    (3)

где X/ - результат первого параллельного определения;

Хз - результат второго параллельного определения;

Если хотя бы одно из значений концентрации определяемого пенициллина окажется меньше нижней границы диапазона измерений, то вычисления по формуле (2) не производят, а дается результат в виде X < Cloq, где (Cloq) - нижний предел измерения методики.

Гарантированный результат измерений, выдаваемый лабораторией, может быть представлен в виде:

(X±U(X))_t мкг/кг,    (4)

где X - среднее арифметическое из результатов измерений 2-х параллельных проб, полученное в соответствии с п.9 и рассчитанное согласно п.10;

U(X) - абсолютное значение максимальной расширенной неопределенности. Рассчитывается по формуле:

11    Оформление результатов измерений

Результаты измерений оформляют по форме, установленной действующей в лаборатории системой регистрации данных.

Результаты должны включать следующую информацию:

-    Наименование (шифр) пробы;

-    Дату проведения измерений;

-    Результаты измерений, включая все необходимые данные и промежуточные расчеты;

-    Результаты параллельных определений;

-    Окончательный результат измерений;

-    Фамилию оператора.

12    Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях повторяемости

Проверку приемлемости результатов измерений, полученных в условиях повторяемости осуществляют согласно п. 5.2.2.1 [12]. Два результата испытаний должны быть получены в условиях повторяемости.

Рассчитывают абсолютное расхождение между результатами единичных наблюдений \Х_х -Х₂\, значение которого сравнивают с абсолютным значением предела повторяемости

Абсолютное значение предела повторяемости , мкг/кг, рассчитывают по формуле

г_ы< =0,01-г-Л”    (6)

где 0,01 - коэффициент пересчета из процентов;

X - среднее арифметическое значение двух результатов единичных наблюдений, мкг/кг; г - относительное значение предела повторяемости, %, указанное в таблицах Б.1 - Б.5.

Если для значения абсолютного расхождения между двумя результатами единичных наблюдений выполняется условие

I Х,-Х^_Л,    (7)

то оба результата считают приемлемыми и в качестве результата измерений указывают среднее

арифметическое значение X, рассчитанное по формуле (3).

Если абсолютное значение разности превышает значение г**, то следует получить еще два результата. Если размах четырех результатов испытаний равен или меньше критического размаха (формула 8), то среднее арифметическое четырех результатов (формула 10) должно указываться как конечный заявляемый результат.

\X~-XJ sCRom где CRo,93 ⁼ 3,6xSt $,=0,01 •$,* X

Значения sпредставлены в таблицах Б.1 - Б.5 приложения Б.

х^^ЫЫЫЬ.    do)

4

Если данное условие не выполняется, то следует отказаться от полученных данных, выяснить и устранить причины, приводящие к неудовлетворительным результатам.

13 Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях промежуточной прецизионности

Проверку приемлемости результатов измерений, полученных в условиях промежуточной прецизионности, осуществляют согласно [12].

После проверки полученных результатов параллельных определений по критерию

повторяемости по п.12 рассчитывают среднее арифметическое X двух результатов измерений Х\ и X2 соответственно, мкг/кг:

Х = ^Х'*^Хг ,    (11)

где Х\ и Х2 - средние значения, рассчитанные на основании двух параллельных измерений, вычисленные по формуле (3) в условиях промежуточной прецизионности.

Рассчитывают абсолютную разность результатов Х\ и Хг, и сравнивают с абсолютным значением предела промежуточной прецизионности CRa6c-

CR_o6c=0,0\CR₀„X    (12)

где 0,01 - коэффициент для пересчета процентов;

С7?0.95 ~    >    03)

где г и г/_(ГО) - относительные значения пределов повторяемости и промежуточной

прецизионности, указанные в таблице 2.

Если для значения абсолютного расхождения между результатами выполняется условие

(14)

то оба конечных результата, полученные в условиях промежуточной прецизионности, считаются

приемлемыми и среднее значение X, рассчитанное по формуле (11), может быть использовано в качестве заявляемого результата.

При превышении указанного норматива должны быть выяснены и устранены причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля промежуточной прецизионности.

14 Проверка стабильности результатов измерений

Стабильность результатов измерений проверяется с использованием контрольной карты Шухарта (R-карта размахов по ИСО 8258) в соответствии с [12] п.6.2.2.    f

При построении контрольной карты используют контрольную рабочую пробу стабильную во времени (например, пищевой продукт с внесепием пенициллина, соответствующий ‘'облаете

‘ “л*<'^и ***'•''

применения данной методики с установленным сроком годности). Содержание пенициллина в контрольной рабочей пробе должно соответствовать диапазону измерений. Контрольная рабочая проба должна храниться в условиях, обеспечивающих стабильность концентрации пенициллина во времени.

Рассчитывают:

-    центральную линию: d2xs„

где d2 = 1,128 (коэффициент для расчета центральной линии для п=2);

-    границы регулирования: UCLH^xSr,

где D2 = 3,686 (коэффициент для расчета границы регулирования для п-2);

-    предупреждающие границы: UCL=D2(2)xs_T,

где Ог(2) = 2,834 (коэффициент для расчета предупреждающих границ для п=2);

s» - стандартное отклонение повторяемости, % (таблицы Б. 1 - Б.5).

Оценку стандартного отклонения повторяемости s, за отчетный период (20 - 30 измерений)

получают по формуле:

( l \

(15)

Id2 - w/d₂

\

\Х., ~Х_Ъ\ где w₍ =- х    100% - размах;

Х_ср<

Хп и Х21 - результаты первого и второго определения для i-ой пары, мкг/кг;

Xcpi - среднее значение результатов первого и второго определений для i-ой пары, мкг/кг L - количество пар проведенных измерений за отчетный период (20 - 30 измерений).

Полученные значения заносят в лист данных контрольной карты:

Дата проведения анализа Наблюдаемые значения Размах w, % Описание X, *2 Хсо Сумма Среднее значение w/d2

Графически по оси X откладывают дату проведения анализа, по оси Y - размах w. Также отмечают центральную линию и линии предупреждающей и регулирующей границ.

Интерпретацию результатов проводят в соответствии с требованиями [12] п.6.

Методика разработана лабораторией химии пищевых продуктов Государственного предприятия «НПЦГ» М3 РБ.

Разработчики:

Заведующая лабораторией, к.х.н. Старший научный сотрудник Старший научный сотрудник, к.х.н Научный сотрудник

О.В. Шуляковская

«г

PV

Л.Л. Белышева Е.И.Полянских Е.П. Шупилова

1 Область применения

Методика предназначена для идентификации и количественного определения остаточных количеств антибиотиков пенициллиновой группы (амоксициллина, ампициллина, пенициллина G, пенициллина V, оксациллина, клоксациллина, нафциллина, диклоксациллина) в сырье животного происхождения и пищевых продуктах.

Метод основан на выделении пенициллинов из пищевой матрицы при помощи ацетонитрильно-водной смеси, отгонке растворителя, растворении остатка в фосфатном буферном растворе с pH 6,5, обезжиривании раствора с помощью гексана, очистке экстракта, концентрировании аналитов при помощи твердофазной экстракции и количественном анализе методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектромстричсским

детектированием.

Диапазон определяемых концентраций для каждого пенициллина: для молока и молочных продуктов - 2,0- 100,0 мкг/кг; для мяса и мясных продуктов - 10,0 - 800,0 мкг/кг.

Нижний предел измерения методики (LOQ) составляет: для молока и молочных продуктов - 2,0 мкг/кг; для мяса и мясных продуктов - 10,0 мкг/кг.

2 Точность измерений

Нормативы контроля градуировочных графиков, относительные значения показателей прецизионности (повторяемости, промежуточной прецизионности, пределов повторяемости и

промежуточной прецизионности) и максимальной относительной расширенной неопределенности при доверительной вероятности Р=0,95 были получены в соответствии с ТИПА (1-6] (приложение А) и представлены в таблицах 1 - 2.

Таблица 1 - Нормативы контроля градуировочных графиков, относительные значения показателей повторяемости, промежуточной прецизионности, пределов повторяемости и промежуточной прецизионности, расширенной неопределенности методики при доверительной вероятности

Наименование антибиотика К ^ % Показатель повторяемо- сти *„% Показатель промежуточ ной прецизионно сти %п».в/о Предел повторяем о-сги г.% Прелелпромеж уточной прецизионно сти гкто)-% Расширенная неопределен ность измерения, и.% 2-20 мкг/кг 10- 100 мкг/кг Амоксициллин 14 13 8 8 21 23 34 Ампициллин 14 13 7 9 19 24 32 Пенициллин G 12 8 7 8 18 21 31 Пенициллин V 11 9 6 8 16 22 29 Оксаииллин 11 9 6 8 17 22 ’ни- Клоксациллин 10 10 7 9 21 7 24 ' "-Ч 30 Нафциллин 11 II 7 9 18 //У 24 и-яп*' 29 Диклоксаииллин 12 11 7 8 18 . 23. ни» 29 1

ПРИЛОЖЕНИЕ Л (обязательное)

Нормативные ссылки

1    СТБ ИСО 5725 - 2 - 2002. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений в 6 ч. - Ч. 2: Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода определений.

2    СТБ ИСО 5725 - 3 - 2002. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений в 6 ч. - Ч. 3: Промежуточные показатели прецизионности стандартного метода измерений.

3    СТБ ИСО 5725 - 4 - 2002. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений в 6 ч. - Ч. 4: Основные методы определения правильности стандартного метода определений.

4    СТБ ИСО 5725-6-2002. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике.

5    ГОСТ 12.2.003-91. Система стандартов безопасности труда. Оборудование производственное. Общие требования безопасности.

6    ГОСТ 12.1.004-91. Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования.

7    ППБ 1.04 - 2002. Инструкции «Основные правила безопасности работы в химических лабораториях». - М.: Химия, 1979 г. ; Общие правила пожарной безопасности Республики Беларусь для общественных зданий и сооружений»

8    ГОСТ 15150-69. Машины, приборы и другие технические изделия. Исполнения для различных климатических районов. Категории, условия эксплуатации, хранения и транспортирования в части воздействия климатических факторов внешней среды.

9    СТБ 1036-97. Продукты пищевые и продовольственное сырье. Методы отбора проб для определения показателей безопасности.

10    ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры.

11    ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы.

пробирки.

13    ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия.    '

14    ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия.

list '*¹‘    •

15    ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования. »- •    i

**'"*'*' У ■ ••—• /

12 ГОСТ 245-76 Реактивы. Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный. Технические условия.

Таблица 2 - Нормативы контроля градуировочных графиков, относительные значения показателей повторяемости, промежуточной прецизионности, пределов повторяемости и промежуточной прецизионности, расширенной неопределенности методики при доверительной вероятности

Р=0,95 для мяса и мясных продуктов

Нанменоканис

антибиотика

Амоксициллин

Ампициллин

Пенициллин G

Пенициллин V

Оксаииллии

Клоксаииллин

Нафциллин_

j Диклоксациллин

%

2-20

мкг/кг

10-

100

мкг/кг

Показатель

повторяемо

сти

Показатель

промежуточ

ной

прецизионно

сти

⁵/|ТО>^в/^

Предел

повторясмо-сти

г.%

Пределпромеж

уточной

прецизионно

сти

^КТоХ%

Расширенная

неопределен

ность

измерения,

и.%

15

13

10

10

21

18

13

14

14

16

13

8

14

18

14

12

13

12

15

14

21

22

15

15

19

21

19

18

_3_1_

29_

2L

26

26

2]_

26

25

Для всех проб во всем диапазоне измерений смещение незначимо.

3 Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы 3.1 Средства измерений Жидкостный хроматограф Agilent 1200    Фирма    «Agilent

с масс-спектрометрическим детектором Agilent 6410    Technologies»

Весы лабораторные общего назначения ВЛР 200, высокого    ГОСТ    24104

класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г

Дозаторы пи источи ыс 1 -канальные с Диапазон измерений: фирма «Thermo Scientific»

варьируемым объемом дозирования    0“^)^см

(0,1-1,0) см³ (0,01-0,10) см³

3.2 Вспомогательные устройства и оборудование

Колонка хроматографическая Zorbax SB-C18 размером 2,1 мм х 150 мм, зернение 3,5 мкм Предколонка Zorbax SB-C18 5 мкм, (2,0 мм х 12,5 мм) Пробирки полипропиленовые вместимостью 15 и 50 см¹ с завинчивающимися крышками Центрифуга лабораторная охлаждаемая 3-18К Электровстряхиватель вортсксного типа Multi Reax Электровстряхиватель вортсксного типа Rcax Control Ультразвуковая баня Sonorex super RK 103Н Вакуумное устройство для твердофазной экстракции

фирма «Agilent Technologies»

фирма «Agilent Technologies» фирма «Oxygen Scientific»

фирма «Sigma» фирма «Heidolph» фирма «Heidolph» фирма «ВапЬейд»'^

/ w,'    ..    у,_Л    •»»••**

фирма «Agilent Technologies»

Мембранный вакуумный насос N 022 АТ. 18

фирма «KNF Neubergcr»

фирма «Macherey-Nagel».

кат. № 730931

фирма «Thermo Scientific»

фирма «Glas-Col»

фирма «Agilent Technologies»

фирма «Tefal» фирма «Macherey-Nagel»

фирма «МедПласт» фирма «Mitsubishi» фирма «Hewlett-Packard»

ООО «Ремеза БслТС»

ООО «Атлант»

фирма «Agilent Technologies»

фирма «Agilent Technologies»

ГОСТ 25336

ГОСТ 25336 ГОСТ 25336 ГОСТ 1770 ГОСТ 1770 ГОСТ 1770 ГОСТ 1770 ГОСТ 1770 ГОСТ 1770

Картриджи для твердофазной экстракции

«Chromabond HR-Х», Зсм³, 200 мг

Система очистки воды Easy pure II RF/UV; D7035

Испаритель аналитический Zipvap 20

Виалы для автосамплера вместимостью 2 см¹

с завинчивающимися крышками и тефлоновыми прокладками

Измельчитель

Шприцсвой мембранный фильтр Chromafil RC-20/15 MS с размером пор 0,2 мкм диаметром 15 мм Шприц инъекционный однократного применения 2А Кондиционер

Компьютер HP xw 4600 Workstation

с установленным программным обеспечением Mass Hunter

Установка компрессорная CB4-16.GMS150K

Холодильник с морозильной камерой

Система для фильтрования и дегазации элюента

Мембранные фильтры из регенерированной целлюлозы

с размером пор 0,2 мкм диаметром 13 мм

Колба плоскодонная    Кн-2-250-29/32 ТС

Стакан химический    В-1-250 ТС

В-1-500 ТС

Колбы мерные    2-10-2

2-50-2

2-100-2

2-500-2

2-1000-2

Цилиндр мерный    2-100-1

3.3 Реактивы и материалы

фирма «Fluka

Ампициллина тригидрат, содержание основного вещества >99,7%    Analytical»,    кат.

№31591 фирма «Sigma-

Амоксициллина тригидрат, содержание основного вещсства> 98,7 %     _

Aldricbf; кат. № 31586

Пенициллина V калиевая соль, содержание основного вещества >98,9 % фирма «Sigma- \

Пенициллина G калиевая соль, содержание основного вещества >99,6 %

Aldrich»; кат. № 46616 фирма «Sigma-Aldrich»; кат. № 46609 фирма «Sigma-Aldrich»; кат. № 32985 фирма «Sigma-Aldrich»; кат. Х° 46589 фирма «Sigma-Aldrich»; кат. № 46140 фирма «Sigma-Aldrich»; кат. № 46182 фирма «Sigma»; кат. № 32071 фирма «Sigma-Aldrich», кат. № 34851 фирма «Sigma-Aldrich»; кат. Хг 34860 фирма «Рапгсас»; кат. X» 361347.1612 фирма «Acros organics»; кат. Хо 147930010 фирма «Applichem»; кат. Хо А3567,0500

Пенициллина G-d7 N-этилпиперидиновая соль, содержание основного вещества >98 %

Оксациллина натриевой соли гидрат, содержание основного вещества

>99,2 %

Клоксациллина натревой соли моногидрат, содержание основного веществам 98,5 %

Диклоксациллина натревой соли гидрат, содержание основного вещества >99,0 %

Нафциллина натриевая соль, содержание основного вещества 99,4 %

Ацетонитрил для ВЭЖХ, > 99,9 %

Метанол для ВЭЖХ, > 99,9 % н-Гексан для ВЭЖХ, > 99,9 %

Муравьиная кислота, > 99,9 %

ГОСТ 245 ГОСТ 4328 ГОСТ 6709

Натрий фосфорнокислый 2- замещенный, 2-х водный

Натрий фосфорнокислый 1 -замещенный, 2-х водный, ч.д.а. Натрия гидроокись, ч.д.а.

Вода дистиллированная

Могут быть использованы другие средства измерения и вспомогательные устройства по точности, не уступающие рекомендуемым, а также реактивы не ниже указанной чистоты.

4 Метод измерения

Метод основан на выделении пенициллинов из пищевой матрицы при помощи ацетонитрильно-водной смеси, отгонке растворителя, растворении остатка в фос<^юг<$* буферном растворе с pH 6,5, обезжиривании раствора с помощью гексана, oya&pti:    и

концентрировании аналита при помощи твердофазной экстракции и кодичеегьейном анализе

j

методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием.

5    Требования безопасности

При выполнении работ персонал должен знать и строго соблюдать на рабочем месте требования:

-    электробезопасности [5]

-    пожарной безопасности [6]

-    техники безопасности при работе в химической лаборатории [7]

-    техники безопасности, изложенные в эксплуатационных документах на средства измерений и оборудование, применяемые при проведении измерений.

Помещение, в котором проводится определение антибиотиков, должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией и подводкой воды. Работу с раствори телями следует проводить в вытяжном шкафу с использованием индивидуальных средств защиты (очки, перчатки).

6    Требования к квалификации оператора

К выполнению измерений могут быть допущены лица, имеющие высшее образование, изучившие настоящую методику, прошедшие подготовку для работы на жидкостном хроматографе с масс-спсюрометрическим детектором.

7    Условия выполнения измерений

При выполнении измерений в лаборатории согласно [8] должны быть соблюдены следующие условия:

-    температура воздуха при приготовлении растворов, в том числе градуировочных (20 ± 2) °С;

-    температура воздуха при выполнении измерений (20 ± 5) °С;

-    атмосферное давление (630 - 800) мм рт. ст.;

-    влажность воздуха не более 70 % при температуре 25 °С;

-    напряжение питающей сети (230 ± 10) В;

-    частота переменного тока (50 ± 0,4) Гц

Помещения для проведения измерений должны быть оснащены приточно-вытяжной вентиляцией, подводкой воды и системой кондиционирования.

Выполнение измерений на жидкостном хроматографе с масс-спектрометрическим детектором проводятся в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору и настоящей методикой.

8 Подготовка к выполнению измерений

Перед выполнением измерений должны быть проведены следующие работы: подготовка измерительной аппаратуры, приготовление растворов, установление градуировочной характеристики, отбор и подготовка проб к анализу.

8.1    Подготовка измерительной аппаратуры

Включают хроматограф согласно инструкции по эксплуатации. Устанавливают рабочие режимы для колонки и детектора. Проводят стабилизацию работы хроматографа на рабочих режимах в течение 40 - 60 мин. Стабилизацию работы детектора после отключения электропитания проводят в течение 1 суток.

8.2    Приготовление растворов

8.2.1    Приготовление 10 % раствора гидроокиси натрия

В стакан вместимостью 250 см³ взвешивают (10,00 ± 0,01) г гидроокиси натрия, приливают 90 см³ дистиллированной воды, перемешивают до полного растворения соли.

Раствор хранится в закрытой емкости при комнатной температуре в течение 1 месяца.

8.2.2    Приготовление фосфатного буферного раствора с pH 6,5

В стакан вместимостью 500 см³ взвешивают (6,23 ± 0,01) г гидрофосфата натрия 2-х водного и (10,41 ± 0,01) г дигидрофосфата натрия 2-х водного, приливают 300 см³ дистиллированной воды, перемешивают до полного растворения соли. Измеряют pH полученного раствора. При необходимости регулируют кислотность до pH 6,5 с помощью 10 % раствора гидроокиси натрия. Полученный раствор помещают в мерную колбу вместимостью 500 см³ и доводят объем дистиллированной водой до метки.

Раствор хранится в закрытой емкости при комнатной температуре в течение 1 месяца.

8.2.3    Приготовление 0,1 % раствора муравьиной кислоты (по объему)

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ содержащую 600 см³ деионизованной воды помещают 1 см³ муравьиной кислоты, доводят объем колбы до метки деионизованной водой, перемешивают и фильтруют через фильтр миллипоре.

Раствор хранится в закрытой емкости при комнатной температуре в течение 1 месяца.

8.2.4    Приготовление градуировочных растворов

8.2.4.1 Приготовление основных растворов пенициллинов концентрацией 1,0 мг/см³ (растворы А)

Взвешивают навеску каждого пенициллина (ампициллина, амоксициллина, пенициллина G, пенициллина V, оксациллнна, клоксациллина, диклоксациллина, нафциллина) (п.3.3.) эквивалентную (0,010 ± 0,0003) г чистого вещества (с учетом молскулярно^-^сба еоедоения в

диссоциированном состоянии) и помещают в отдельные мерные колбы .^ёбтимоеты&^О см'.

fiS, хс«.1^,и"^<’^KtHi

Добавляют 8 см³ деионизованной воды и помещают в ультразвуковую !бавю на ) мЙнугу гфи

t=(20 ± 2) °C, затем доводят объем полученного раствора до метки деионизованной водой и перемешивают.

Растворы хранятся в морозильной камере в полипропиленовых пробирках с завинчивающимися крышками при температуре (-18 ± 2) °С в течение 1 месяца. Растворы стабильны при 6-7 циклах замораживания - размораживания.

8.2.4.2    Приготовление основного раствора смеси пенициллинов концентрацией

1,0 мкг/см³ (раствор Б)

По 0,1 см³ каждого основного стандартного раствора пенициллина концентрацией 1,0 мг/см³ (растворы А), приготовленные по 8.2.4.1, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³, доводят объем до метки деионизованной водой и тщательно перемешивают. Раствор готовят непосредственно перед применением. Хранению не подлежит.

8.2.4.3 Приготовление рабочего градуировочного раствора смеси пенициллинов концентрацией 100,0 нг/см³ (раствор В)

5 см³ основного стандартного раствора смеси пенициллинов концентрацией 1,0 мкг/см³ (раствор Б), приготовленного по 8.2.4.2, переносят в мерную колбу вместимостью 50 см³, доводят объем до метки деионизованной водой и тщательно перемешивают.

8.2.4.4 Приготовление рабочего градуировочного раствора смеси пенициллинов концентрацией 10,0 нг/см³ (раствор Г)

1 см³ основного стандартного раствора смеси пенициллинов концентрацией 1,0 мкг/см³ (раствор Б), приготовленного по 8.2.4.2, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³, доводят объем до метки деионизованной водой и тщательно перемешивают.

Раствор готовят непосредственно перед применением. Хранению не подлежит.

8.2.4.5    Приготовление основного раствора внутреннего стандарта пенициллина G-dj концентрацией 100,0 мкг/см³ (раствор Д)

10 мг внутреннего стандарта пенициллина G-d7 количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см⁵. Добавляют в колбу 80 см⁵ деионизованной воды, перемешивают и помещают в ультразвуковую баню на 1 минуту, доводят объем полученного раствора до метки деионизованной водой и перемешивают.

Раствор хранится в холодильнике в полипропиленовых пробирках вместимостью 15 см³ с завинчивающимися пробками при температуре (-20 ± 2)°С в течение 1 года. Раствор стабилен при 6-7 циклах замораживания - размораживаниях.

8.2.4.6    Приготовление рабочего раствора внутреннего стандарта пенициллина G~d7

концентрацией 1,0 мкг/см³ (раствор Е)

1 см³ основного раствора внутреннего стандарта пенициллина G-d7 концентрацией100,0^

доводят объем до метки деионизованной водой и тщательно перемешивают. Раствор готовят непосредственно перед применением. Хранению нс подлежит.

8.2.4.7 Приготовление градуировочных растворов пенициллинов

При анализе методом ВЭЖХ-МС/МС большое влияние на отклик аналита оказывают соединения, присутствующие в пищевой матрице, которые могут, как увеличивать, так и уменьшать его ионизацию. Поэтому, чтобы минимизировать этот эффект и учесть потери аналита в результате пробоподготовки, в ВЭЖХ-МС/МС анализе принято пользоваться матричной калибровкой. Для построения матричной калибровки из основных стандартных растворов смеси пенициллинов готовят серию градуировочных растворов с концентрациями пенициллинов 2,0; 4,0; 10,0; 20,0; 80,0 и 100 нг/см³ каждого, содержащих 50 нг/см³ внутреннего стандарта (для молока и молочных продуктов) и 10,0; 20,0; 80,0; 100,0; 400,0; и 800,0 нг/см³ каждого, содержащих 100 нг/см³ внутреннего стандарта (для мяса, печени и продуктов на их основе). Для этого в центрифужные пробирки вместимостью 50 см³ помещают по (1,000 ± 0,005) г соответствующей пищевой матрицы нс содержащей пенициллины (бланк) и предварительно подготовленной согласно п. 8.6, последовательно приливают необходимое количество дистиллированной воды, основных градуировочных растворов пенициллинов и дейтерированного пенициллина G4I7. Схема приготовления градуировочных растворов пенициллинов представлена в таблицах 3-5.

Таблица 3 - Схема приготовления градуировочных расгворов пенициллинов для анализа молока. жидких, твердых и пастообразных молочных продуктов

Яг Гр.р- Ра Концентрация каждого пенициллина, нг/см5 ш («чистого образца»), г V (диет, воды), см5 V(осн. стандартного р-ра смеси пенициллинов), см5 V (р-ра внутр. стандарта), см3 V (ацетонитрила), см3 0 0(бланк) 1,00 2,00 0 0,05 (раствор Е) 10,0 1 2,0 1,00 1,80 0,20 (раствор Г) 0,05 (раствор Е) 10,0 2 4,0 1,00 1,60 0,40 (раствор Г) 0,05 (раствор Е) 10,0 3 10,0 1,00 1,00 1,00 (раствор Г) 0,05 (раствор Е) 10,0 4 20.0 1,00 1,80 0,20 (раствор В) 0,05 (раствор Е) 10,0 5 80,0 1,00 1,20 0,80 (раствор В) 0,05 (раствор Е) 10,0 6 100,0 1,00 1,00 1.00 (раствор В) 0,05 (раствор Е) 10,0