СОДЕРЖАНИЕ

1    Область применения.......................................................................................3

2    Точность измерений........................................................................................3

3    Средства измерений, испытательное и вспомогательное оборудование,

материалы, реактивы...............................................................................................4

3.1    Средства измерений, испытательное и вспомогательное оборудование,

материалы..................................................................................................................4

3.2    Реактивы...........................................................................................................5

4    Метол измерений.............................................................................................5

5    Требования безопасности н требовании к квалификации операторов........6

5.1    Общие требования безопасности.......................................................................6

5.2    Требования безопасности при работе с метанолом...........................................6

5.3    Требования к квалификации операторов...........................................................6

6    Условия выполнения измерений....................................................................6

7    Условия инкубации микротитровальных планшетов в помещении............6

8    Условия хранения тест-систем.......................................................................7

9    Подготовка к выполнению измерений...........................................................7

9.1    Отбор образцов.................................................................................................7

9.2    Подготовка лабораторной посулы.....................................................................7

9.3    Приготовление растворов.................................................................................7

9.4    Подготовка проб...............................................................................................8

9.5    Подготовка тест-систем....................................................................................8

9.6    Приготовление раствора коньюгата................................................................10

10    Выполнение измерений.................................................................................10

11    Обработка результатов измерений...............................................................11

12    Контроль бланка...........................................................................................13

13    Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях

повторяемости........................................................................................................13

14    Оформление результатов измерений...........................................................14

14.1    Форма представления результата измерения с использованием расширенной

неопределенности.....................................................................................................14

14.2    Форма представления результата измерения в виде односторонней оценки с

использованием предела измерения.........................................................................14

14.3    Форма представления результата измерения в виде односторонней оценки с

использованием значения верхней границы диапазона измерений...........................14

15    Контроль точности результатов измерений................................................14

15.1    Оперативный контроль результатов, полученных в условиях повторяемости. 15

15.2    Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях

промежуточной прецизионности..............................................................................15

15.3    Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях

воспроизводимости..................................................................................................15

15.4    Контроль правильности..................................................................................16

15.5    Контроль стабильности результатов измерений с применением контрольных

карт Шухарта (КК)...................................................................................................17

16    Нормативные ссылки....................................................................................19

Библиография.........................................................................................................20

объемом 50 мм³.

10.3    Аккуратными круговыми движениями планшета по поверхности стола перемешивают содержимое. Встряхивания, постукивания планшетом по столу не допустимы.

10.4    Закрывают планшет пленкой «парафильм» или заклеивают скотчем.

10.5    Помещают планшет в инкубатор при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 °С и инкубируют в течение 60 мин. При отсутствии инкубатора микротитровальный планшет инкубируют в течение 60 мин при условиях, указанных в разделе 7.

10.6    По окончании инкубации жидкость из лунок выливают путем резкого переворачивания планшета.

10.7    Промывают планшет три раза, добавляя при этом каждый раз многоканальным дозатором в лунки планшета по 300 мм³ моющего буфера, приготовленного по п. 9.5.3, и затем выливая его резким переворачиванием планшета. После последнего промывания планшет переворачивают и удаляют остатки жидкости путем энергичного троекратного постукивания рамки с лунками по столу, накрытому листом сухой фильтровальной бумаги.

Примечание: В процессе работы следует избегать высыхания лунок в перерывах между отдельными этапами работы и увеличения длительности перерывов. Точность результатов измерений зависит от равномерного промывания лунок, поэтому следует точно соблюдать процесс промывки. Рекомендуется проводить процедуру промывки планшета с помощью устройства для промывки планшетов, задавая следующие параметры программы: количество циклов промывки - 3, объем используемого промывочного раствора - 300 мм³.

10.8    В каждую лунку вносят дозатором но 100 мм³ раствора субстрата и аккуратными круговыми движениями планшета перемешивают его содержимое.

10.9    Помещают планшет в инкубатор при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 °С и инкубируют в течение 30 мин. Отсчет времени инкубации начинают немедленно после окончания внесения раствора субстрата. При отсутствии инкубатора микротитровальный гшаншег инкубируют в течение 30 мин в защищенном от света месте, при условиях, указанных в разделе 7.

10.10    Сразу же после окончания инкубации в каждую лунку планшета дозатором вносят но 100 мм³ раствора стоп-реагента и аккуратными круговыми движениями перемешивают сю содержимое.

10.11    Немсхзснно после добавления стоп-рсагеита измеряют оптическую плотность в каждой лунке планшета на автоматическом микропланшетном фотометре при длине волны 450 им. Измерения проводят в соответствии с инструкцией по эксплуатации прибора.

При наличии автоматического микропланшетного фотометра, позволяющего выполнять измерения с рефсрснсным фильтром на 630 нм (620 нм) измерения производят с использованием референсного филыра. Использование данного режима измерений возможно при положительном результате контроля бланка согласно п. 12.

11 Обработка результатов измерений

Обработка результатов измерений производится с помощью обеспечения «Simplerfits» версии не ниже 2.3, разработащюго Нидерланды, далее «программное обеспечение».

Программным обеспечением строится

lg[f?/(4^ - 5)] от десятичного логарифма концентрации вида

lg[^/(^-fi)] = a ₊ 6]gC,    (5)

где В₀ ■ оптическая плотность нулевого градуировочного раствора (концентрация 0 нг/см³);

С - концентрация бацитрацина в растворе, нг/см³;

В’ - скорректированная оптическая плотность раствора, рассчитывается по формуле

& = B-B_bl>    (6)

где В_в1 оптическая плотность бланка, рассчитываемая по формуле

(7)

где В_ш,В_и2 -опгическис плотности, измеренные в лунках А1 и А2 (бланк);

При измерении оптической плотности с рефсрснсным фильтром измерения бланка не производят и при расчетах принимают, что В¹ = В при условии получения положительного результата контроля бланка в соответствии с п. 12.

Расчет коэффициентов линейной регрессии а>Ь производится программным

обеспечением с помощью МНК на основании пар значений    -Д)], IgC,

полученных для шести фалуировочных растворов, где (i-\..6),C,~ концентрация / -го фадуировочного раствора, В, - среднее значение оптической плотности, рассчитанное по двум значениям двух измерений оптической плотности, В* -скорректированное по формуле (6) среднее значение двух измерений оптической плотности.

Содержание бацитрацина в пробе рассчитывается на основании результатов измерений оптической плотности раствора подготовленной пробы, коэффициентов линейной рефессии и фактора разбавления по формуле

%(g.Av*.))-

X = F-l 0    * ,    (8)

где X - концентрация бацитрацина в пробе, мкг/кг;

В_я - оптическая плотность, полученная при измерении раствора пробы;

В>_х - скорректированная по формуле (6) оптическая плотность, полученная при измерении раствора пробы;

F - фактор разбавления пробы, равный 15.

За окончательный результат измерений принимают среднее арифметическое значение результатов двух измерений параллельных проб при выполнении условия повторяемости по п. 13

х₌х₁±х_Х'    ₍₉₎

где X_VX₂ - результаты измерений массовой концентрации бацитрацина в двух параллельных пробах, мкг/кг.

Окончательный результат измерений округляют до первого Если окончательный результат измерений X оказывается измерений Хщ , равный 9,40 мкг/кг, то дается односто!

концентрации бацитрацина в образце с использованием предела измерения согласно п. 14.2.

Нели окончательный результат измерений X оказывается больше, чем значение верхней границы диапазона измерений, равное 300,0 мкг/кг, то дается односторонняя оценка массовой концентрации бацитрацина в образце с использованием значения верхней границы предела измерений согласно п. 14.3.

Примечание: допускается использовать для обработки результатов измерений про1раммнос обеспечение "RIDA®Soft", версии 7.01 и выше, разработанное R-Biopharm AG (Германия) с применением файлов методов (ЕР ВЛС.МЕТ), предоставленных официальным представителем компаний EuroProxima B.V., R-Biophann AG в Республике Беларусь -ОДО «КомПродСервис».

12 Контроль бланка

Данная процедура проводится, если при выполнении измерений в соответствии с п. 10 бланк в лунки микротитровалыюго планшета согласно п. 10.1 не вносят, и оптическая плотность по п. 10.11 измеряется с использованием рсференсного фильтра.

При выполнении процедуры контроля бланка производится измерение оптической плотности бланка согласно п. 10 с использованием референсного фильтра. Если рассчитанное по формуле (7) значение B_BL удовлетворяет следующему условию

B_tL £0,010.    (10)

то результат контроля бланка признается положительным, в противном случае -отрицательным.

Процедура выполняется однократно для каждой новой партии тест-систем в ходе выполнения серии измерений проб.

13 Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях повторяемости

Проверку приемлемости результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, проводят в соответствии с требованиями СТБ ИСО 5725-6-2002 следующим образом.

Рассчитывают расхождение между результатами измерений параллельных проб одного образна \Х_х-Х₂\, значение которого сравнивают с абсолютным значением предела повторяемости г^. Если выполняется условие

\Х,-Х,\йг_ш.    (11)

то оба результата считают приемлемыми и в качестве результата измерений указывают среднее арифметическое значение X, рассчитанное по формуле (9).

Абсолютное значение предела повторяемости , мкг/кг, рассчитывают по формуле

Ъ,=0,01г*.    (12)

где X - среднее арифметическое значение результатов измерений параллельных

проб одного образца, мкг/кг;     .___

г - относительное значение предела новторяемости_гприведенное При невыполнении условия (11) проводят    i    ссдад$;^\Ч

разделу 10.

&

14 Оформление результатов измерений

14.1    Форма представления результата измерения с использованием расширенной неопределенности

Результат измерений, выдаваемый лабораторией, может быть представлен в

виде

(.Yit/W), мкг/кг при доверительной вероятности Р = 0,95, К=2

где X -результат измерений, мкг/кг, полученный в соответствии с настоящей методикой и рассчитанный согласно разделу 11;

U(X)- расширенная неопределенность результатов измерений, мкг/кг. Расширенную неопределенность результата измерений 1/(Х) , мкг/кг, рассчитывают по формуле

U(X) = 0,0\UX,    (13)

где U - относительная расширенная неопределенность результата измерений, выполняемых в соответствии с МВИ, %, приведенная в таблице 2.

При необходимости может быть проведена оценка расширенной неопределенности измерений, выполняемых в соответствии с данной МВИ при ее реализации в конкретной лаборатории.

14.2    Форма представления результата измерения в виде односторонней оценки с использованием предела измерения

Если конечный результат измерений X оказывается меньше, чем предел измерения X^ , равный 9,40 мкг/кг, то дается односторонняя оценка массовой концентрации бацитрацина в образце с использованием предела измерения, в мкг/кг

менее Хщ,

где Хщ - значение предела измерений, приведенное выше.

14.3    Форма представления результата измерения в виде односторонней оценки с использованием значения верхней границы диапазона измерений

Если конечный результат измерений X оказывается больше, чем значение верхней границы диапазона измерений Х_ш , равное 300,0 мкг/кг, то дается односторонняя оценка массовой концентрации бацитрацина в образце с использованием значения верхней границы диапазона измерений, в мкг/кг

более X _HL,

где X„_L - значение верхней границы диапазона измерений, приведенное выше.

15 Контроль точности результатов измерений

Ко»ггроль точности проведения измерений выполняется с дериоличностью, установленной системой менеджмента качества в лаборатории, но

•    при внедрении методики;    /£/

•    при появлении факторов, влияющих на стаб^д] результатам анализа контрольных карт;

•    при значимых изменениях в условиях измерени

новые средства измерений, ремонт оборудования и т.д.);

• при любых выявленных несоответствиях в работе лаборатории, применительно к методике выполнения измерений.

15.1    Оперативный контроль результатов, полученных в условиях повторяемости

Оперативный контроль повторяемости выполняется для каждой пробы после измерения концентрации бацитрацина при расчете конечного результата измерений по результатам двух параллельных определений в соответствии с п. 13.

15.2    Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях промежуточной прецизионности

Проверку приемлемости результатов измерений, полученных в условиях промежуточной прецизионности с изменяющимися факторами оператор-время, проводят в соответствии с требованиями СТБ ИСО 5725-6-2002 следующим образом.

Лаборатория получает два результата измерений Х_х%Х₂ согласно разделу 10, варьируя факторы промежуточной прецизионности оператор, время и обеспечивая контроль повторяемости по и. 12. За результат измерений принимают среднее арифметическое значение двух результатов X_VX₂

J ₌ X₁±X₂.'    ₍₎₄₎

при их соответствии критерию приемлемости.

Критерием приемлемости являстсн условие

£ CD*,,    (15)

где CD^ - абсолютное значение критической разности, мг/кг, рассчитываемое по формуле

CD^«0_t0\CDX_t    (16)

где CD - относительное значение критической разности, приведенное в таблице 4, %.

15.3    Проверка приемлемостн результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости

Проверку приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости, проводят в соответствии с требованиями СТБ ИСО 5725-6-2002 следующим образом.

Каждая из двух лабораторий проводит измерения согласно разделу 10 и получает результат измерений, обеспечивая контроль повторяемости по п. 12.

Рассчитывают среднее арифметическое значение X , мкг/кг, результатов измерений двух лабораторий Х_х и Х₂

Рассчитывают абсолютное расхождение между результатами измерений полученными в двух лабораториях, значение, которого сравнивают с абсолютным значением критической разности CD_% . Если выполняется условие

\Х_х-Х_г\ £CD_r,    (18)

it) оба конечных результата, полученные двумя лабораториями считаются

приемлемыми и общее среднее значение ¹, рассчитанное по формуле (17), может быть использовано в качестве заявляемого результата.

Абсолютное значение критической разности CD_R , мкг/кг, рассчитывают по формуле

CZ>_R = 0,01¹CD¹,    (19)

где ¹ - среднее арифметическое значение результатов измерений двух лабораторий, мкг/кг,

к - коэффициент, равный 1,3;

CD - относительное значение критической разности, %, приведенное в таблице 4.

При превышении значения критической разности для разрешения различий между результатами, полученными двумя лабораториями, используют процедуры, указанные в разделе 5 СТБ ИСО 5725-6-2002.

Таблица 4 - Относительные значения предела повторяемости, критической разности и норматива контроля правильности

Виды продукции Предел повторяемости г,% Критическая разность CD у % Норматив контроля правильности К", % Мясо, колбасные изделия 13 15 14 Яйца 10 20 18

15.4 Контроль правильности

Контроль правильности определения массовой концентрации бацитрацина производится путем анализа образцов для контроля (ОК) с заранее известным значением концентрации вещества (рабочая проба с добавкой).

Неопределенность аттестованного значения массовой концентрации бацитрацина в ОК не должна превышать одной трети от значения неопределенности результата измерений.

15.4.1 ОК, представляющим собой рабочие пробы с добавкой

Значение Macc^B^^nyj^eHtpauHH бацитрацина э формуле

Г' уК?/ ^ NS¹

_    ' га    "^1>мнп'    пв\

tn-\w\ _ч1»Д    jpij

ММО|>Ч.И1«¹ИпМ в донупгмгацми/

Данные образцы для контроля представляют собой навеску пробы, массовая концентрация бацитрацина в которой менее предела измерения данной МВИ, в которую внесена добавка. Добавка вносится в виде растворов бацитрацина непосредственно в пробирки с навесками (аликвотами) проб, в пробе с добавкой рассчитывается го

где Cgj- - концентрация бацитрацина в растворе, нг/см³;

- объем добавляемого раствора, см³; т - масса навески пробы, г.

Величина массовой концентрации бацитрацина в пробе с добавкой должна находиться в диапазоне измерений.

Для внесения добавки используегся раствор, приготовленный из бацитрацина цинковой соли в соответствии с рекомендациями производителя. Допускаегся использовать готовые растворы для добавки (spike-растворы). Относительная стандартная неопределенность концогграции бацитрацина в растворах для добавки нс должна превышать 3 %.

15.4.2 Проведение контрольной процедуры

Получают результаты измерений ОК в соответствии с требованиями раздела 10. За результат контрольного измерения принимают результат измерения массовой

концентрации бацитрацина Х_к в ОК, мкг/кг, рассчитанный по формуле (17) при выполнении условия повторяемости по п. 12.

Критерием приемлемости является условие

I*j-S 0.01    (21)

где - относительный норматив контроля правильности, %, приведенный в таблице 4.

- установленное значение массовой концентрации бацитрацина в ОК, мкг/кг. При невыполнении данного условия контрольную процедуру повторяют. При повторном невыполнении условия (21) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их усгранению.

15.5 Контроль стабильности результатов измерений с применением контрольных карт Шухарта (КК)

С помощью КК контролируют следующие показатели точности:

•    повторяемость (R-карта или карта размахов);

•    наличие смещения или правильность (Recovery-карта).

Подготовка и оформление исходных данных, расчеты параметров КК, ведение, управление и интерпретация КК должны осущесгвляться в соответствии с требованиями [ 3 1 и СТБ ИСО 5725-6-2002, раздел 6.

Для проверки стабильности соответствия результатов испытаний показателям повторяемости, установленным данной методикой, применяются КК с заданными стандартными значениями. В этом случае для построения КК используют показатели повторяемости в соответствии с таблицей 1.

Примечание: При применении КК в течение длительного времени, для расчета границ Ю< могут быть использованы данные измерений, накопленные в процессе ведения и обработки КК. Однако соответствие результатов измерений требованиям данной методики может быть заявлено только в том случае, если логазат^&л рассчитанный по накопленным лабораторией данным, р1^тистичес'|^йв^ п^выпйц^ установленных методикой значений.    —^

Для построения и ведения R-карт в качестве образцов для контроля (ОК) могут использоваться рабочие образцы.

Для построения и ведения Recovery-карт используются ОК, представляющие собой рабочие пробы с добавками стандартного раствора. Предварительно установленная массовая концентрация бацитрацина в данных пробах без добавки должна быть менее предела измерения данной МВИ. Рекомендуется вносить добавку бацитрацина в образцы для контроля на уровне массовых концентраций в рабочих пробах.

15.5.1 Расчет параметров, ведение и оформление данных, интерпретация КК размахов для контроля стабильности СКО повторяемости

Рассчитываются значения центральной линии, границ регулирования и предупреждающих границ но формулам

•    Центральная линия

4.<7, = U28<7„    (22)

где <т_г - относительное СКО повторяемости, %, приведенное в таблице 1.

•    Предупреждающие границы

UCL = D₂' <j, =2,834-ст,    (23)

(24)

• Гранины регулирования

UCL = D₂<j, = 3,686 • о.

Графическое построение КК состоит в проведении на выбранной шкале центральной линии и контрольных границ.

Ведение КК предусматривает набор данных X,, Х₂ при выполнении испытаний ОК в условиях повторяемости в полном соответствии с методикой, расчета фактических относительных значений размаха W по формуле (25), оформлении Листа данных КК и нанесения данных на КК.

(25)

МО-1*.-ЛГ,|

x_t + x₂ *

где Х_х у Х₂ - значение результатов измерений в условиях повторяемости. Интерпретация данных КК осуществляется в соответствии с ( 3 ], п. 7.

Оценку СКО повторяемости S_r за контролируемый период получают но формулам (25), (26)

где N - общее число измерений (точек) на КК, для получения^здоедий центральной линии и границ необходимо, чтобы N = 15..20; d₂ - коэффициент, d₂=1,128.

1S.S.2 Расчет параметров, ведение и оформление данных, интерпретация Recovery-карт для контроля стабильности правильности

Рассчитываются значения центральной линии, границ регулирования и предупреждающих границ по формулам

•    Центральная линия

_

Re с = -Ы-,    (27)

N    ^V '

где N - количество измерений дня расчета значений центральной линии и границ КК;

Re с, - значение извлечения (Recovery), %, рассчитываемое по результатам /-го

измерения пробы с добавкой бацитрацина, по формуле

Rec,=-^-100,    (28)

где X, - массовая концешрация бацитрацина в пробе с добавкой, полученное для / -го измерения, мкг/кг;

Х_пр - рассчитанное значение массовой концентрации бацитрацина в пробе с добавкой, мкг/кг.

•    Предупреждающие границы

UCL — Rec + 2*5Jwr LCL = Rec - 2 • SKEC, (29) Границы регулирования UCL = Rcc ^3-S^ LCL = Rec - 3 • (30)

где    - стандартное отклонение извлечения, %, рассчитываемое по    формуле

£(Rec-Rcc,)²

S.._r = - (31)

"^r    N-1

Графическое построение КК состоит в проведении на выбранной шкале центральной линии и контрольных границ.

Ведение КК предусматривает набор данных единичных измерений X, при выполнении испытаний ОК в соответствии с МВИ, расчета фактических значений коэффициента извлечения Rcc, но формуле (28), оформлении Листа данных КК и нанесения данных на КК.

Интерпретация данных КК осуществляется в соответствии с [ 3 ], п. 7.

16 Нормативные ссылки

В настоящей методике использованы ссылки на следующие документы:

ГОС Т 8.010-99    Государственная    система    обеспечения    единства    измерений.

Методика выполнения измерений. Основные положения

Система стандартов безопасности труда. Пожапр£^_Сннм₍Г'

безопасность. Общие требования    ,

_    _    rf&jhffyпЧ&'&г"'* л»

Система стандартов безопасности труда,:066пудова>«й*.‘¹¹ ' *4

производственное. Общие требования'

Продукты пищевые и продовольственное сырье. Методы отбора проб для определения показателей безопасности. Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия Реактивы. Метанол-яд. Технические условия Вода дистиллированная. Технические условия Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия Весы лабораторные. Общие технические требования Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний

Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2 Основной метод измерения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений

СТБ ИСО 5725-4-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 4 Основные методы определения правильности стандартного метода измерений

СТБ ИСО 5725-6-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и

результатов измерений. Часть 6 Использование значений точности на практике

Библиография

ш VAM Project 3.2.1 Development and Harmonization of Measurement Uncertainty Principles Part (d): Protocol for uncertainty evaluation from validation data, V.J. Barvvick and S.L.R. Ellison, LGC/VAM/1998/088 121 ISO 21748:2010 Руководство по использованию оценок повторяемости, воспроизводимости и правильности при оценивании неопределенности измерения [3] ГОСТ Р 50779.42-99 (ИСО 8258-91) Статистические методы. Контрольные карты Шухарта

1 Область применения

Настоящая методика распространяется на мясо (мышцы), колбасные изделия, яйца и устанавливает метод конкурентного иммуноферментного анализа (ИФА) для определения содержания бацитрацина.

Методика предназначена для проведения измерений массовой конценграции бацитрацина с использованием тест-систем BACITRACIN ELISA производства EuroProxima B.V., Нидерланды.

Диапазон измерений методики составляет от 9,4 мкг/кг до 300,0 мкг/кг.

Предел измерения для данной методики составляет 9,4 мкг/кг.

2 Точность измерений

Настоящая методика обеспечивает измерение массовой конценграции бацитрацина в указанном выше диапазоне с показателями прецизионности, указанными в таблице 1.

Таблица 1 - Относительные значения показателей повторяемости и промежуточной прецизионности

установлена незначимость смещения во всем диапазоне измерений.

Значения оценок относительной суммарной стандартной неопределенности и относительной расширенной неопределенности приведены в таблице 2.

Указанные в таблицах 1, 2 метрологические характеристики получены на основании данных эксперимента, проведенного в соответствии с:

•    показатели прецизионности - СТБ ИСО 5725-2;

•    показатели правильности — [ 1 ];

•    оценки неопределенности [ 2 ], [ 1 ].

Таблица 2 - Оценки неопределенности результатов измерений, выполняемых в соответствии с МВИ

Виды продукции Диапазон измерений, мкг/кг Относительная суммарная стандартная неопределенность ис, % Относительная расширенная неопределенность U, %, К = 2,Р = 95 % Мясо, колбасные изделия от 9,4 до 300,0 включ 9 18 Яйца егг 9,4 до 300,0 включ. 10 20

3 Средства измерений, испытательное и вспомогательное оборудование, материалы, реактивы

3.1 Средства измерений, испытательное и вспомогательное оборудование, материалы

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 высокого класса точности с наибольшим пределом взвешивания до 500 г, ценой деления не более 0,01 г.

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 высокого класса точности с наибольшим пределом взвешивания до 220 г, ценой деления не более 0,0001 г.

Автоматический микропланшетный фотометр с фильтром на 450 нм (допускаемая погрешность измерения оптической плотности не более ± 5 %).

'Гермометр лабораторный частичного погружения класса точности I с ценой деления 1 °С по ГОСТ 28498.

Центрифуга лабораторная, обеспечивающая относительное центробежное ускорение нс менее 2000 g (пробирки вместимостью 15 см³).

Холодильник бытовой, позволяющий поддерживать температуру от плюс 2 °С до плюс 8 °С в холодильной камере и нс выше минус 20 °С в морозильной камере.

Лабораторный вортекс. обеспечивающий скорость вращения не менее 1800 об/мин, имеющий в комплекте вставку для микротитровальных планшетов.

Лабораторный ротатор, обеспечивающий скорость вращения до 60 об/мин.

Гомогенизатор лабораторный или бытовой блендер.

Дозаторы пинеточные с комплектом одноразовых наконечников:

•    с диапазоном объемов дозирования от 10 мм³ до 100 мм³ и относительным отклонением фактического объема дозы от номинального ± 2,0 %;

•    с диапазоном объемов дозирования от 100 мм³ до 1000 мм³ и относительным отклонением фактического объема дозы от номинального ± 1,5 %;

•    с диапазоном объемов дозирования от 1см³ до 5 см³ и относительным отклонением фактического объема дозы от номинального ± 1,0 %;

•    с диапазоном объемов дозирования от 2 см³ до 10 см³ и относительным отклонением фактического объема дозы от номинального ± 1,0 %\

•    многоканальный с диапазоном объемов дозирования от 50 мм³ до 350 мм³ и относительным отклонением факгического объема дозы от номинального не более ± 4,6 % (при отсутствии автоматического устройства для отмывки иммунологических планшетов).

Пленка «парафильм» или скотч.

Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.

Штатив для пробирок.

Пробирки полипропиленовые для це1ггрифугирования вместимостью 15 см³.

Пробирки стеклянные вместимостью 5 см³ типа П-1-5-0,1 ХС по ГОСТ 1770 или пробирки микроцентрифужные с крышкой (типа Эппендорф) из полипропилена вместимостью 1,5 см³.

Колбы конические вместимостью 100 см³, 500 см&

Кн-1-500-29/32 ТС по ГОСТ 25336.

Воронки типа В-56-80 ХС, В-75-110 ХС но Г ОС

Стаканы Н-1-100 или Н-1-150 по ГОСТ 25336

Пипетки 1-2-1, 1-2-5,1-2-10 по ГОСТ 29169.

Палочки стеклянные оплавленные.

Цилиндры мерные вместимостью 25 см³, 50 см³, 100 см³ типа 3-25-2, 3-50-2, 3-100-2 по ГОСТ 1770.

Использование следующего оборудования нс является обязательным, но рекомендуется для увеличения производительности и повышения точности анализа:

•    инкубатор для микротитровальных планшетов, обеспечивающий поддержание температуры от плюс 20 °С до плюс 25 °С с точностью не более ± 1 °С;

•    устройство огмывки иммунологических планшетов автоматическое с диапазоном объемов моющего раствора, заливаемого в каждую микрокювету от 100 мм³ до 350 мм³;

3.2 Реактивы

Метанол ч.д.а по ГОСТ 6995.

Вода деионизированная (бидистиллированная) или дистиллированная по ГОСТ 6709.

Лабораторный детергент, например Triton Х-100.

Бациграцина цинковая соль с массовой долей основного вещества не менее 90 %. Тест-системы BACITRACIN ELISA производства EuroProxima B.V., Нидерланды, каталожный номер 5151 ВАС, в составе (таблица 3).

Таблица 3 - Состав тест-системы BACITRACIN ELISA

Компонент тест-систем Количество в комплекте Микротитровальный планшет (12 стрипов но 8 лунок, покрытых специфичными антителами) 1 шт Нулевой градуировочный раствор (с концентрацией 0 нг/см ) 1 шт. х 2 см3 Градуировочные растворы 1 - 6 с концентрацией 0,625; 1,250; 2,500; 5,000; 10,000; 20,000 нг/см3 6 шт. х 1 см3 ЮОх кон центрат конъюгата 1 шт. х ЮО мм3 Раствор субстрата (готовый к применению) 1 шт. х 12 см3 Стоп-реагент (готовый к применению) 1 ШТ. X 15 см3 Буфер для разбавления 1 шт. х 15 см3 Буфер для разбавления образцов 1 шт. х 40 см3 20хконцснтрат моющего буфера 1 шт. х 30 см3

Дотскается использовать другие средства измерений, испытательное и вспомогательное оборудование по метрологическим и техническим характеристикам, а материалы и реактивы (кроме тест-систем) по качеству не хуже указанных.

4 Метод измерений

В лунки микротитровального планшета, сенсибилизированные специфичными антителами к бацитрацину, добавляются градуировочные растворы или растворы проб вместе с коньюгатом, представляющим собой бацитрацин, маркированный пероксидазой хрена. Бацитрацин, маркированный псроксидазой хрена и бацитрацин, присутствующий в градуировочных растворах и растворах проб, конкддаруют за центры связывания антител (конкурентный ИФА). После бО^шцдо^ несвязанные реагенты удаляются на стадии промывки.

После добавления раствора субстрата/хромогеи£/

связанный конъюгат превращает бесцветный хромоген в окрашенный продукт.

Реакция окрашивания останавливается внесением серной кислоты. Интенсивность окрашивания измеряется фотометрически при длине волны 450 нм. Измеренная оптическая плотность обратно пропорциональна концентрации бацитрацина в пробе. Массовая концентрация бацитрацина в пробе определяется с использованием градуировочной зависимости, построенной по 7 градуировочным растворам.

5 Требования безопасности и требования к квалификации операторов

5.1    Общие требования безопасности

При выполнении работ по определению массовой концентрации бацитрацина обслуживающий персонал должен знать и строго соблюдать на рабочем месте гребования:

•    электробезопасности по ГОСТ 12.2.003;

•    пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004;

•    техники безопасности при работе в химической лаборатории в соответствии с инсгрукциями, утвержденными в установленном порядке;

•    техники безопасности, изложенные в инструкции по эксплуатации средств измерений и оборудования, применяемых при проведении измерений.

5.2    Требования безопасности при работе с метанолом

Персонал, работающий с метанолом и его растворами, должен знать и сгрого соблюдать на рабочем месте требования инструкции по технике бсзопасносги при работе с метанолом, утвержденной в установленном порядке.

Все работы с метанолом и его растворами должны проводиться строго в вытяжном шкафу с использованием средств индивидуальной защиты (фартуки, перчатки, очки). Запрещается работать с метанолом при выключенной приточно-вытяжной вентиляции и без применения средств индивидуальной защиты.

5.3 Требования к квалификации операторов

К проведению работ по данной методике допускаются лица, имеющие высшее специальное или среднее специальное образование по профилю выполняемых работ, прошедшие обучение приемам работы на оборудовании, освоившие выполнение всех операций, предусмотренных методикой, владеющие техникой постановки нммуноферментного анализа.

6 Условия выполнения измерений

При выполнении измерений в лаборатории должны быть соблюдены следующие условия:

•    температура окружающего воздуха от плюс 20 °С до плюс 25 °С;

•    огносительная влажность воздуха не более 80 % при температуре 25 °С.

7 Условия инкубации микротитровальных планшето

При отсутствии инкубатора микротитровальные инкубироваться в помещении при выполнении следующих

•    температура окружающего воздуха должна быть от плюс 20 °С до плюс 25 °С;

•    не должно происходить попадание прямых солнечных лучей на планшет;

•    планшет не должен подвергаться воздействию сильных естественных или искусственных потоков воздуха, вызванных, например, принудительной вентиляцией;

•    с целью устранения воздействия холодной поверхности стола, на котором находится планшет, рекомендуется помещать под него теплоизоляционный материал, например, сложенное в несколько слоев бумажное полотенце.

•    в особых случаях, которые оговорены по тексту методики, требуется помещать планшет в защищенное от света место, например в ящик стола.

8    Условия хранения тест-систем

Хранение тест-систем осуществляется в холодильнике при температуре от плюс 2°С до плюс 8°С в оригинальных флаконах и упаковке. Не допускается замораживание реагентов с целью увеличения их срока хранения.

Хранение неиспользованных стрипов (лунок) осуществляется в холодильнике при температуре от плюс 2 °С до плюс 8 °С в плотно закрытом оригинальном пакете. Необходимо исключить прямое попадание света на раствор субстрата.

9    Подготовка к выполнению измерений

9.1    Отбор образцов

Отбор образцов для анализа проводят по СТЬ 1036. Отобранные образцы могут храниться в защищенном от света месте при температуре от плюс 2 °С до плюс 4 °С в течение 2-х дней или в замороженном виде при температуре не выше минус 20 °С в течение 14 дней. Перед проведением подготовки проб по п. 9.4 замороженные образцы должны быть разморожены при температуре от плюс 2 °С до плюс 8 °С.

9.2    Подготовка лабораторной посуды

Сильнозагрязненную лабораторную посуду предварительно обрабатывают хромовой смесью. Лабораторную посуду после мойки в растворе специализированного моющего средства промывают водопроводной, ополаскивают дистиллированной колой 2 раза и высушивают.

Запрещается:

•    многократное использование одноразовой лабораторной посуды;

•    использование бытовых моющих средств для мойки лабораторной посуды.

9.3    Приготовление растворов

9.3.1 Приготовление смеси метанол - буфер для разбавления образцов (80 % метанола)

В пробирку для центрифугирования вместимостью 15 см³ или коническую колбу вместимостью 100 см³ (в зависимости от приготовляемого объема) приливают аликвоту буфера для разбавления образцов объемом V_B, см³, отмереннь или пипеткой, затем приливают в 4 раза большую по объему отмеренную цилиндром и перемешивают.

Требуемый объем аликвоты буфера для разбавле

определяют, исходя из количества анализируемых образцов N^, по следующей формуле

Г

где V, - объем смеси, приготавливаемой в запас, см³ (не менее 5 % от приготавливаемого объема).

Раствор используют свежеприготовленным.

9.4 Подготовка проб

Доводят температуру образца, отобранного в соответствии с п. 9.1, от плюс 20 °С до плюс 25 °С, выдерживая его при комнатной температуре. Образцы гомогенизируют с помощью юмогснизатора или блендера.

От гомо!енизированного образца отбирают две параллельные навески массой 1,00 г, взвешенные с точностью до 0,01г. Навески помещают в пробирки для центрифугирования вмссгимостыо 15 см³ и в каждую пробирку добавляют отмеренные пипеткой или дозатором 2 см³ смеси метанол-буфер для разбавления образцов, приготовленной по п. 9.3.1. Содержимое пробирок перемешивают путем переворачивания вверх-вниз на ротаторе в течение 15 мин, после чего центрифугируют при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 °С, 2000 g, в течение 10 мин.

После центрифугирования из каждой пробы отбирают дозатором аликвоты надосадочной жидкости объемом 50 мм³, и переносят их в стеклянные пробирки вмесгимостью 5 см³ или в микроцентрифужные пробирки типа Эппсндорф. В пробирки с аликвотами налосадочной жидкостью добавляют отмеренные дозатором 200 мм³ буфера для разбавления образцов и тщательно перемешивают содержимое пробирок на вортсксс.

Полученные растворы проб используются для проведения ИФА. Допускается хранение подготовленных проб при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 °С не более одного часа.

9.5 Подготовка тест-систем

9.5.1 Предварительная подготовка и правила обращения с тест-системами

Тест-систему извлекают из холодильника, нс открывая упаковку микротитровального планшета, выдерживают при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 °С от 0,5 до 1 ч, доводят температуру остальных реагентов от плюс 20 °С до плюс 25 °С.

Растворы из тест-системы следует готовить непосредственно перед проведением ИФА. Перед использованием реагенты необходимо аккуратно перемешать круговыми движениями флаконов.

Особенное внимание следует обратить на раствор субстрата, в котором при температуре 4°С выпадает осадок. Перед применением расл^] предварительно нагретый до температуры от плюс 20 °С до гонору аккуратно перемешать до растворения осадка.    ,

Замена отдельных реагентов на реагенты из тест-систеь

допускается.

Нс допускается использование реагентов, имеющих следующие признаки распада:

•    голубая окраска раствора хромогена до внесения его в лунки;

•    оптическая плотность нулевого |радуировочного раствора (концентрация О нг/см³) меньше 0,8.

9.5.2 Подготовка микротитровалыюго планшета

Количество лунок микротитровалыюго планшета, необходимых для проведения анализа N_w, рассчитывается по формуле

= \6 + 2N_SMP,    (2)

где Ngyr - количество образцов;

16 - количество лунок для градуировочных растворов и бланка. Микротитровальный планшет со стрипами, предварительно подготовленными в соответствии с п. 9.5.1, вынимают из упаковки. В микротитровальный планшет помещают необходимое количество стрипов, рассчитанное исходя из требуемого для проведения измерений количества лунок N_w. Оставшиеся стрипы сразу же помещают в упаковку, закрывают и хранят в соответствии с разделом 8.

Размечают положения лунок, предназначенные для бланка, (радуировочных растворов и растворов проб, согласно рисунку 1.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

А

Б

Б

П-1

П-1

П-9

П-9

В

С-0

С-0

П-2

П-2

П-10

П-10

С

С-1

С-1

П-3

П-3

П-1!

П-11

D

С-2

С-2

П-4

П-4

П-12

П-12

Е

С-3

С-3

П-5

11-5

11-13

11-13

F

С-4

С-4

11-6

Г1-6

II-14

11-14

J

С-5

С-5

П-7

П-7

11-15

11-15

G

С-6

С-6

11-8

П-8

П-16

П-16

Рисунок 1 - Схема расположения лунок для бланка, градуировочных растворов и

растворов проб

где Б - бланк,

С-0, С-1,... С-6 - 1радуировочные растворы, включая нулевой,

/7-1, //-2,... П -16 - исследуемые пробы,

1,2,3.... 12 - номера стрипов в планшете,

А, В,... G - обозначения лунок в стрипах.

Нс рекомендуется одновременно использовать более 6-ти стрипов. При необходимости исследовать большее количество проб анализ выполняется в несколько этапов.

9.5.3 Приготовление моющего буфера

В коническую колбу вместимостью 500 см³ вносят д» 20хконцентрата моющего буфера, подготовленного по цилиндром в 19 раз больший объем деионизированной воды

колбы перемешивают. Требуемый объем аликвоты 20хконцентрата моющего буфера V_K, см³, определяют, исходя из планируемого к использованию количества стрипов N_m, по формуле:

К =2(3)

Полученный раствор используют свежеприготовленным.

9.6 Приготовление раствора коньюгата

Раствор готовится непосредственно перед проведением ИФЛ и хранению не подлежит.

ЮОхконцентрат коньюгата, подготовленный по п. 9.5.1, центрифугируют в следующем режиме: от 20 °С до 25 °С, 1000 g, 1 мин. Отбирают дозатором аликвоту ЮОхконцентрата коньюгата и переносят в пробирку вместимостью 5 см³ или в микроцентрифужную пробирку типа Эппсндорф. В пробирку добавляют отмеренный дозатором буфер для разбавления из расчета 990 мм³ на 10 мм³ ЮОхконцентрата коньюгата (99:1) и перемешивают на вортексе. ЮОхконцентрат коньюгата сразу же убирают в холодильник и хранят в соответствии с п. 8.

Требуемый объем аликвоты ЮОхконцентрата коньюгата V, мм³, определяют, исходя из планируемого к использованию количества лунок N,y , по следующей формуле

у 50-(А1-2)+Ц 100

где V, объем раствора коньюгата, приготавливаемого в запас, мм³ (нс менее 50 мм³).

Если согласно п. 10.1 бланк в лунки микротитровального планшета нс вносят, то расчет по формуле (4) производят, увеличивая количество лунок N_w на 2.

10 Выполнение измерений

Для проведения измерений используют пробы, подготовленные в соответствии с п. 9.4. Компоненты тест-систем подготавливают в соответствии с п. 9.5.

10.1    В лунки микротитровального планшета, размеченного согласно п. 9.5.2, вносят отобранные дозатором:

•    в лунки Л1, Л2 — две аликвоты объемом 100 мм³ буфера для разбавления проб (бланка);

•    в лунки В1 - G2 - по две аликвоты объемом 50 мм³ каждого градуировочного раствора, включая нулевой;

•    в лунки АЗ - G6 - аликвоты объемом 50 мм³ двух параллельных проб каждого образца.

Каждую аликвоту вносят в отдельную лунку, внесение градуировочных растворов производится в порядке возрастания их концентраций.

Примечание:    при    выполнении    измерений согласно п. 10.11 с

использованием автоматического микропланшетного фотометра с референсным фильтром на 630 нм (620 нм), бланк в лунки микротитровального шшживза^не вносят. Освободившиеся лунки используют для градуировочдо(^1ш растворов проб.

10.2    В каждую лунку микротитровального планшета, за ис»

Л2, вносят отобранный дозатором раствор коньюгата, прий

1