Определение содержания левомицетина (хлорамфеникола) в молоке, сухом молоке, мясе и меде методом иммуноферментного анализа с использованием наборов реагентов MaxSignal® Chloramphenicol (CAP) ELISA Test Kit и ИфАантибиотик-хлорамфеникол

МВИ.МН 4230-2015 (взамен МВИ.МН 4230-2013)

МИНСК 2015

СОДЕРЖАНИЕ

1    Область приметши..........................................................................................3

2    Показатели точности......................................................................................3

3    Средства измерении, испытательное м вспомогательное оборудование,

материалы, реактивы........................... 4

4    Метод измерений...............................................................................................6

5    Требовании безопасности и требования к квалификации операторов..................7

5.1    Требования безопасности..................................................................................7

5.2    Требования к квалификации операторов...........................................................7

6    Условии выполнения измерений............................. 7

7    Условия инкубации мнкротитровальных планшетов в помещении.....................7

8    Условия храпения набора реагентов...................................................................8

9    Подготовка к выполнению измерений................................................................8

9.1    Отбор образцов.................................................................................................8

9.2    Подготовка лабораторной посуды.....................................................................8

9.3    Приготовление растворов.................................................................................8

9.4    Подготовка проб...............................................................................................9

9.5    Подготовка набора реагентов..........................................................................12

9.6    Подготовка микротитровального планшета....................................................13

10    Проведение измерений.....................................................................................13

10.1    Общие требования..........................................................................................13

10.2    Дозирование компонентов набора реагентов и последовательность операций

при выполнении анализа..........................................................................................13

11    Обработка результатов измерения...................................................................15

11.1    Расчет массовой концентрации хлорамфеникола............................................15

11.2    Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях

повторяемости..........................................................................................................16

11.3    Контроль холостой пробы мяса и меда...........................................................17

12    Оформление результатов измерений................................................................17

12.1    Форма представления результатов измерения с использованием расширенной

неопределенности.....................................................................................................17

12.2    Форма представления результатов в виде односторонней оценки массовой

концентрации хлорамфеникола с использованием предела измерения.....................17

12.3    Форма представления результатов в виде односторонней оценки массовой

концентрации хлорамфеникола с использованием значения верхней границы диапазона измерений................................................................................................18

13    Контроль точности результатов измерений......................................................18

13.1    Оперативный контроль результатов, полученных в условиях повторяемости. 18

13.2    Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях

воспроизводимость'..................................................................................................18

13.3    Контроль правильности..................................................................................20

13.4    Контроль стабильности результатов измерений с применением- контрольных

карт Шухарта (КК)...................................................................................................21

14    Нормативные ссылки......................................................................................23

15    Библиография.................................................................................................24

жидкость объемом 4 см³, и переносят ее в стеклянные пробирки вместимостью 4 ем³

Выпаривают этилацетвт из пробирок на роторном испарителе или в токе азота на водяной бане при температуре 60 °С до отсутствия запаха этилацетата.

К сухому остатку в пробирках добавляют отмеренный дозатором н-гексан объемом 2 см³, перемешивают содержимое пробирок на вортсксе в течение 1 мин. Далее й пробирки добавляют отмеренный дозатором экстракционный буфер для

образцов, приготовленный по п. 9.3.1 объемом 1 см³ и перемешивают на вортексе в течение 2 мин на максимальной скорости, после чего содержимое переливают в пробирки для центрифугирования вместимостью 15 см³.

Пробирки центрифугируют при 20-25°С, 4000 g, в течение 10 мин. После центрифу|'ирования из пробирок удаляют дозатором верхний органический слой. Если после центрифугирования образуется эмульсия, то дозатором удаляют максимально возможный объем верхнею органического слоя, выдерживают пробирки на водяной бане при т емпературе 80 °С в течение 3 мин, затем охлаждают до температуры от плюс 20 °С до плюс 25 °С и центрифугируют при 20-25 °С, 4000 g, 10 мин, после чего удаляют дозатором оставшийся верхний органический слой.

Водные растворы проб используют для проведения ИФА. Допускается хранение подготовленных проб при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 °С в течение двух часов.

9.4.4 Подготовка холостой пробы мяса

В две стеклянные пробирки вместимостью 5 см³ или 10 см³ приливают отмеренные пипеткой или дозатором 4 см³ этилацетата.

Выпариваютэтилацетат из пробирок на роторном испарителе или в токе азота на водяной бане при температуре 60 °С до отсутствия запаха этилацетата.

В пробирки добавляют отмеренный дозатором н-гексан объемом 2 см³, перемешивают содержимое пробирок на вортексе в течение 1 мин. Далее в пробирки добавляют отмеренный дозатором экстракционный буфер для образцов, приготовленный по п. 9.3.1, объемом 1 см³ и перемешивают на вортексе в течение 2 мин на максимальной скорости, после чего содержимое переливают в пробирки для центрифугирования вместимостью 15 см³.

Пробирки центрифугируют при 20-25°С, 4000 g. в течение 10 мин. После центрифугирования из пробирок удаляют дозатором верхний органический слой. Если после центрифугирования образуется эмульсия, то дозатором удаляют максимально возможный объем верхнего органического слоя, выдерживают пробирки па водяной бане при температуре 80 °С в течение 3 мин, затем охлаждают до температуры от плюс 20 °С до плюс 25 °С и центрифугируют при 20 - 25 °С, 4000 g, в течение 10 мин, после чего удаляют дозатором оставшийся верхний органический слой.

Водные растворы проб используют для проведения ИФА. Полученные растворы используют для проведения ИФА при контроле холостой пробы с периодичностью согласно п. 11.3. Допускается хранение подготовленных проб при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 °С в точен

9.4.5 Подготовка проб ме

Для подготовки пр< разделом 9.1. Доводят темп

его при комнатной температуре. От образца меда отбирают две параллельные навески массой 2,00 г, взвешенные с погрешностью 0,01 г. Навески помещают в стеклянные пробирки для центрифугирования с закручивающимися крышками вместимостью 10 см³ или 15 см³ и в каждую пробирку добавляют отмеренные с помощью пипетки или дозатора 1 см' экстракционный буфер для образцов, приготовленный по п. 9.3.1. Пробирки встряхивают до полного растворения меда, после чего добавляют отмеренные с помощью пипетки или дозатора 4 см³ ацетонитрила. Содержимое пробирок перемешивают на вортексе в течение 3 мин на максимальной скорости.

Примечание: допускается использовать пробирки для центрифугирования из полипропилена.

Пробирки центрифугируют при 20 - 25 °С, 4000 g, в течение 3 мин.

После центрифугирования из каждой пробы отбирают дозатором надосадочную жидкость объемом 1 см³, и помещают* ее в стеклянные пробирки вместимостью 5 см³ или 10 см³.

Выпаривают этил ацетат из пробирок на роторном испарителе или в токе азота на водяной бане при температуре 60 °С до отсутствия запаха этил ацетата.

К сухому остатку в пробирках добавляют отмеренный дозатором экстракционный буфер для образцов, приготовленный по п. 9.3.1 объемом 0,5 см³ и перемешивают на вортексе в течение 2 мин на максимальной скорости.

Подготовленные таким образом пробы используют для проведения ИФА. Допускается хранение подготовленных проб при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 °С в течение двух часа.

9.4.6 Подготовка холостой пробы меда

В две стеклянные пробирки вместимостью 5 см³ или 10 см³ приливают отмеренные пипеткой или дозатором 1 см³ ацетонитрила.

Выпаривают ацетонитрил из пробирок на роторном испарителе или в токе азога на водяной бане при температуре от плюс 60 °С до плюс 70 °С до отсутствия запаха ацетонитрила.

В пробирки добавляют отмеренный дозатором экстракционный буфер для образцов, приготовленный по п. 9.3.1 объемом 0,5 см³ и перемешивают на вортексе в течение 2 мин на скорости 1000 - 1500 об/мин.

Полученные растворы используют для проведения ИФА при контроле холостой пробы с периодичностью согласно п. 11.3. Допускается хранение подготовленных проб при температуре от плюс 20 ®С до плюс 25 °С в течение двух часов.

9.5 Подготовка набора реагентов

9.5.1 Предварительная подготовка и правила обращения с наборами реагентов Набор реагентов извлекают из холодильника, не открывая упаковку микрптитровалыюго планшета, выдерживают при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 °С от 1 до 2 ч, доводят температуру остальных реагентов от плюс 20 °С до плюс

попадание солиечнцЗ<;-лучей на

жЮбходим^-лерем стать путем *    Не    дойускастся    переливать

обратно в оригинальные флаконы остатки реагентов, используемых при проведении

измерений в соответствии с п. 10.

9.6 Подготовка мнкротятровалыюго планшета

Количество лунок микротитровального планшета, необходимых для проведения измерений рассчитывается по формуле

(1)

где    -    количество образцов;

12 - количество лунок для градуировочных растворов.

Микротитровальный планшет со стрипами, предварительно подготовленные соответствии с п. 9.5.1, вынимают из упаковки. В микротитровальный планшет помещают необходимое количество стрипов, рассчитанное исходя из требуемого для проведения измерений количества лунок N_w. Оставшиеся стрипы сразу же помещают в упаковку, закрывают и хранят в соответствии с разделом 8.

Распределение лунок для градуировочных растворов и проб проводят согласно схеме, предлагаемой программным обеспечением «MaxSignal® ELISA Detection Analysis System», с учетом выполнения по два параллельных измерения градуировочных растворов и образцов.

Не рекомендуется одновременно использовать более шести стрипов. Если необходимо провести измерение более 18 образцов, ИФА выполняется несколько раз.

10 Проведение измерений

10.1    Общие требования

Для проведения измерений используют пробы, подготовленные в соответствии с п. 9.4. Компоненты набора реагентов подготавливают в соответствии с п. 9.5.

10.2    Дозирование компонентов набора реагентов и последовательность операций при выполнении анализа

10.2.1    Внесение градуировочных растворов н растворов проб

В лунки микротитровального планшета, размеченного согласно п.9.6, вносят дозатором по 100 мм³ каждого градуировочного раствора в две параллельные лунки. Внесение производится в порядке возрастания концентраций градуировочных растворов (т.е. 0,00; 0,015; 0,030 0,150; 0,500; 1,500 нг/см³). В соответствующие лунки микротитровального планшета вносят дозатором по 100 мм³ растворов каждой параллельной пробы анализируемых образцов.

конъюгата. Перемешивают планшета по поверхности с

10.2.3 Инкубация опаши

от плюс 20 °С до плюс 25 °С и инкубируют в течение 60 мин. При отсутствии инкубатора микротитровальный планшет инкубируют в течение 60 мин в защищенном от света месте при условиях, указанных в разделе 7.

По окончании инкубации аккуратно удаляют пленку, закрывающую лунки (если инкубация проводилась в помещении). Жидкость из лунок выливают путем резкого переворачивания планшета.

10.2.4    Промывка планшета

Промывают планшет 3 раза, добавляя при этом каждый раз многоканальным дозатором в лунки планшета но 250 мм³ моющего раствора, приготовленного по п. 9.3.2, и затем выливая его резким переворачиванием планшета.

Допускается проводить процедуру промывки планшета с помощью устройства для отмывки планшетов, задавая следующие параметры программы: количество циклов промывки - от 3 до 4, объем заливаемого моющего раствора - 250 мм³.

После последнего промывания планшет переворачивают и удаляют остатки жидкости легким постукиванием по поверхности стола, накрытого сухим листом фильтровальной бумаги.

10.2.5    Добавление ТМВ-субстрата

Немедленно после удаления остатков промывочного раствора в лунки планшета добавляют отмеренные дозатором 100 мм³ ТМВ-субстрата, после чего сразу же засекают время начала инкубации. Перемешивают содержимое лунок медленными круговыми движениями планшета по поверхности стола в течение 1 мин.

Не допускается выливать обратно в оригинальный флакон остатки ТМВ-субстрата во избежание ею контаминации.

10.2.6    Повторная никубпция

Помещают планшет в инкубатор при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 °С и инкубируют в течение 20 мин. При отсутствии инкубатора микротитровальный планшет инкубируют в помещении в защищенном от света месте при соблюдении условий, указанных в разделе 7. По окончании инкубации аккурално удаляют пленку, закрывающую лунки (если инкубация проводилась в помещении).

10.2.7    Завершение реакции окрашивания

Сразу же после окончания времени инкубации в каждую лунку вносят.™ 100 мм³ стоп-раствора и аккуратными круговыми движениями планшета перемешивают содержимое лунок.

10.2.8    Измерение оптической плотности

Немедленно после перемешивания вытирают микрофибровой салфеткой иижшою наружную поверхность лунок планшета и измеряют оптическую плотность лунок планшета с помощью а1ггоматического микропланшетного фотометра при длине волны 450 нм. Измерения проводят в соответствии с инструкцией по эксплуатации прибора.

II Обработка результатов измерения

11.1 Расчет массовой концентрации хлорамфеннкола

Программное обеспечение «MaxSignal® ELISA Detection Analysis System», разработанное BlOO Scientific Corporation (США), далее «программное обеспечение» производит обработку результатов измерений оптической плотности, введенных оператором с помощью интерфейса программного обеспечения.

Программное обеспечение выполняет построение градуировочной зависимости относительной оптической плотности B/Bq от натурального логарифма концентрации хлорамфеннкола вида

В/В₀=а + Ь\пС,

где В - оптическая плотность раствора;

В₀ -оптическая плотность 1-го градуировочного раствора с концентрацией 0,00 нг/см³;

С - концентрация хлорамфеннкола в растворе, нг/см⁵;

<7.6 - коэффициенты линейной регрессии.

Расчет коэффициентов линейной регрессии а,Ь производится с помощью МНК на основании пар значений В,/В₀ и In С,, полученных для пяти градуировочных растворов, где (/-2..6), С, - концентрация i-го градуировочного раствора. В, -среднее значение оптической плотности, рассчитанное по двум значениям оптической плотности параллельных измерений.

Для молока сырого, пастеризованного, стерилизованного и сухого во всех случаях, а для мяса и меда в случае, если в результате проведения контроля холостой пробы согласно п. 11.3 условие (8) выполняется, концецграция хлорамфеннкола в пробе рассчитывается на основании результатов измерений оптической плотности раствора подготовленной пробы, коэффициентов линейной регрессии и фактора разбавления по формуле

(3)

где X - концентрация хлорамфеннкола в пробе, мкг/кг;

В- оптическая плотность, полученная при измерении раствора пробы;

F - фактор разбавления пробы, имеющий следующие значения:

•    молоко сырое, пастеризованное, стерилизованное - 1,25;

•    молоко сухое - 1,25;

•    мясо - 0,5;

•    мсд-1.

Если в результате проведения контроля холостой пробы мяса и меда согласно п. 11.3, условие (8) не выполняется, то вместо формулы (3) для расчета концентрации хлорамфеннкола в пробе применяется следующая формула

где X_BL - конце определяемая согласно раз За окончательный j

значение результатов двух измерений параллельных проб при выполнении условия повторяемости по п. 11.2

где А',, Х_г - результаты двух измерений массовой концентрации хлорамфеиикола в параллельных пробах, мкг/кг.

Окончательный результат измерений округляют до третьего десятичного знака после запятой.

Если окончательный результат измерений X оказывается меньше, чем предел измерений Х,₀, равный

•    для молока сырого, пастеризованного, стерилизованного - 0,030 мкг/кг,

•    для молока сухого - 0,030 мкг/кг;

•    для мяса - 0,015 мкг/кг,

•    для меда - 0,030 мкг/кг,

то дается односторонняя оценка массовой концентрации хлорамфеиикола в образце с использованием предела измерения согласно п. 12.2.

Если окончательный результат измерений X оказывается больше, чем значение верхней границы диапазона измерений, равное:

•    для молока сырого, пастеризованного, стерилизованного -1,875 мкг/кг,

•    для молока сухого - 1,875 мкг/кг;

•    для мяса - 0,750 мкг/кг;

•    для меда - 1,500 мкг/кг,

то дается односторонняя оценка массовой концентрации хлорамфеиикола в образце с использованием значения верхней границы предела измерений согласно п. 12.3.

11.2 Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях повторяемости

Проверку приемлемости результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, проводят в соответствии с требованиями СТБ ИСО 5725-6 следующим образом.

Рассчитывают расхождение между результатами измерений параллельных проб одного образца \Х,-Х₂\, значение которого сравнивают с абсолютным значением предела повторяемости г^. Если выполняется условие

Для контроля чистоты реактивов и посуды проводят анализ холостой пробы мяса и меда.

Для этого выполняют процедуру подготовки холостой пробы согласно п. 9.4.4 (мясо), п. 9.4.6 (мед). Рассчитывают массовую концентрацию хпорамфсникола в холостой пробе X_tL> мкг/кг по формулам (3), (5) (п. 11.1).

Если полученное значение массовой концентрации хлорамфеникола в холостой пробе мяса и меда удовлетворяет условию

X^X_L%    (8)

где X_L -значение концентрации хлорамфеникола в пробе, составляющее 0,015 мкг/кг для мяса и 0,030 мкг/кг для меда, то массовую концентрацию хлорамфеникола в холостой пробе при расчете результатов анализа проб мяса и меда не учитывают (расчет ведется по формуле (3)).

При невыполнении условия (8) массовая концентрация хлорамфеникола в холостой пробе при расчете результатов анализа проб мяса и/или меда учитывается (расчет массовой концентрации хлорамфеникола в пробах мяса и меда ведется по формуле (4)).

Контроль холостой пробы выполняется каждый раз при замене набора реагентов, реактивов и посуды.

12 Оформление результатов нзмеренпй

12.1 Форма прелставлепня результатов измерения с использованием расширенной неопределенности

Результат измерений, выдаваемый лабораторией, может быть представлен в

виде

(Х±и(Х)),нкг/кг при доверительной вероятности Р ■=■ 0,95, К=*2

где X результат измерений, mki/кг, полученный и соответствии с насгоящсй методикой и рассчитанный согласно разделу 11;

U(X) - расширенная неопределенность результатов измерений, мкг/кг. Расширенную неопределенность результата измерений U(X) , мкг/кг, рассчитывают по формуле

U(X) = 0,0\ U Х_у    (9)

где U - относительная расширенная неопределенность результата измерений, выполняемых в соответствии с МВИ, %, приведенная в таблице 2.

При необходимости может быть проведена оценка расширенной неопределенности измерений, выполняемых в соответствии с данной МВИ при ее реализации в конкретной лаборатории.

12.2 Форма представления резу концентрации xлopaмфe_i

Если окончательный резу.

измерения Хщ, равный:

•    для молока сырою, пастеризованного, стерилизованного - 0.030 мкг/кг;

•    для молока сухого - 0.030 мкг/кг;

•    для мяса - 0.015 мкг/кг;

•    для меда - 0,030 мкг/кг,

то дастся односторонняя оценка массовой концентрации хлорамфеннкола п образце с

использованием предела измерения, в мкг/кг

менее Хщ,

где Хщ - значение предела измерений, приведенное выше.

12.3 Форма представления результатов в виде односторонней оценки массовой концентрации хлорамфеннкола с использованием значения верхней границы диапазона измерений

Если окончательный результат измерений X оказывается больше, чем значение верхней границы диапазона измерений X_HL, равное:

•    для молока сырого, пастеризованного, стерилизованного - 1,875 мкг/кг,

•    для молока сухого- 1,875 мкг/кг;

•    для мяса - 0,750 мкг/кг;

•    для меда - 1,500 мкг/кг,

то дастся односторонняя оценка массовой концентрации хлорамфеннкола в образце с использованием значения верхней границы диапазона измерений, в мкг/кг

более X_I[L

где X_ltL - значение верхней границы диапазона измерений, приведенное выше. 13 Контроль точности результатов измерений

Контроль качества проведения измерений выполняется с периодичностью, установленной системой менеджмента качества в лаборатории, но обязательно:

•    при внедрении методики;

• при появлении факторов, влияющих на стабильность процесса по результатам анализа контрольных карт;

•    при значимых изменениях в условиях измерений (другая партия реагентов, новые средства измерений, ремонт оборудования и т.д.);

• при любых выявленных несоответствиях в работе лаборатории, применительно к методике выполнения измерений.

13.1    Оперативный контроль результатов, получепных в условиях повторяемости

Оперативный контроль повторяемости выполняется для каждой пробы после измерения концентрации хлорамфеннкола при расчете конечного результата измерений по результатам двух параллельных определений в соответствии с п. 11.2.

13.2    Проверка прием условиях воспрс

воспроизводимости,

С ГБ ИСО 5725-6 следую и

Каждая из двух лабораторий проводит измерения согласно разделу 10 и получает результат измерений» обеспечивая контроль повторяемости по п. 11.2.

Рассчитывают    среднее    арифметическое значение X    ,    мкг/кг,    результатов

измерений двух лабораторий X, и Х₂ соответственно

х-~^    по)

Рассчитывают    абсолютное    расхождение между результатами    измерений

IJP, - Л\| . полученными в двух лабораториях, значение, которого сравнивают с абсолютным значением критической разности CD^. Если выполняется условие

* CD*.,    (П)

то оба конечных результата, полученные двумя лабораториями считаются

приемлемыми и общее среднее значение X, рассчитанное по формуле (10) можег быть использовано в качестве заявляемого результата.

Абсолютное значение критической разности CD^ , мкг/кг, рассчитывают по формуле

CD_eU=W\CD X    (12)

где X - среднее арифметическое значение результатов измерений двух лабораторий, мкг/кг;

CD - относительное значение критической разности, %, рассчитываемое по формуле

где г - относительное значение предела повторяемости, %, приведенное в таблице 4;

R - относительное значение предела воспроизводимости, %, приведенное в таблице 4.

При превышении значения критической разности для разрешения различий между результатами, полученными двумя лабораториями, используют процедуры, указанные в разделе 5 СТБ ИСО 5725-6.

Контроль правильности осуществляют с периодичностью, установленной системой менеджмента качества в лаборатории, но обязательно:

•    при внедрении методики;

•    при значимых изменениях в условиях измерений (новые средства измерений, ремонт оборудования ит.д.).

Контроль правильности определения массовой концентрации хлорамфеникопа производится путем анализа образцов для контроля (ОК) с заранее известным значением концентрации вещества (рабочая проба с добавкой).

Неопределенность аттестованного значения массовой концентрации хлорамфеникола в ОК не должна превышать одной трети от значения неопределенности результата измерений.

13.3.1 ОК, представляющие собой рабочие пробы с добавкой

ОК представляют собой навески проб с массовой концентрацией хлорамфеникола менее предела измерения с добавкой раствора хлорамфеникола. ОК готовятся путем внесения раствора хлорамфеникола непосредственно в пробирки с навесками (аликвотами) проб. Значение массовой концентрации хлорамфеникола X_RF в пробе с добавкой рассчитывается по формуле

_{Хиг =} £ж1Ш'    (14)

т

где Cgf - концентрация раствора хлорамфеникола, мю'/дм³;

Vgf - объем раствора хлорамфеникола, см³;

т - масса навески пробы, г.

Примечание: принимается, что для сырого, пастеризованного, стерилизованного и растворенного сухого молока масса т численно равна объему пробы молока, см^!.

Величина массовой концентрации хлорамфеникола в пробе с добавкой должна находиться в диапазоне измерений.

Для внесения добавки используется раствор, приготовленный из хлорамфеникола в соответствии с рекомендациями производителя. Допускается использовать готовые растворы для добавки (spike-растворы) хлорамфеникола, при условии, «гго относительная стандартная неопределенность концентрации хлорамфеникола в них не превышает 3 %.

13.3.2 Проведение контрольной процедуры

Получают серию из шести результатов измерений ОК в условиях повторяемости в соответствии с требованиями раздела 10.

За результат контрольного измерения принимают результат измерения массовой концентрации хлорамфеникола Х_к в ОК, мкг/кг, рассчитанный по формуле

(15)

где X, - i-ый результат измерений ОК, мкг/кг.

Проводят контроль повторяемости по п. 11.2, используя вместо относительного продела повторяемое гн г, приведенного в таблице 4, значение 1,43 - г.

Критерием првсмлемодз^^ДД^^Цд^

^ХЖ ; V •' \ <¹⁶>

» 1 V,- . .£    .

1 Область применения

Настоящая методика распространяется на молоко (сырое, пастеризованное, стерилизованное), молоко сухое, мясо и мед и устанавливает метод конкурентного иммуноферментяого анализа (ИФА) для определения содержания лсиомицстина (хлорамфеникола).

Методика предназначена для проведения измерений массовой концентрации хлорамфеникола с использованием набора реагентов MaxSignaldD для определения хлорамфеникола, каталожный номер 1013-05В (MaxSignal® Chloramphenicol (CAP) ELISA Test Kit, Reference# 1013-05B) производства BIOO Scientific Corporation (ClUA), или набора реагентов ИФАангибиотик-хлорамфеникол, производства ООО «Кампания Альгимсд» (Республика Беларусь), далее набор реагентов.

Диапазон измерений методики составляет:

•    для молока сырого, пастеризованного, стерилизованного - от 0,030 до

1,875 мкг/кг,

•    для молока сухого от 0,030 до 1,875 мкг/кг*;

•    для мяса - от 0,015 до 0,750 мкг/кг;

•    для меда - от 0,030 до 1,500 мкг/кг.

Предел измерения для данной методики составляет:

•    для молока сырого, пастеризованного, стерилизованного - 0,030 мкг/кг;

•    для молока сухого - 0,030 мкг/кг,

•    для мяса - 0,015 мкг/кг,

•    для меда - 0,030 мкг/кг.

Настоящая методика разработана в соответствии с требованиями ГОСТ 8.010.

2 Показатели точности

Настоящая методика обеспечивает измерение массовой концентрации хлорамфеникола в указанном выше диапазоне с показателями точности, указанными в таблице 1.

где - относительный норматив контроля правильности, %, приведенный в

таблице 4.

- установленное значение массовой концентрации хлорамфепикола в ОК,

мкг/кг.

При невыполнении данного условия контрольную процедуру повторяют. При повторном невыполнении условия (16) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их усграненню.

13.4 Контроль стабильности результатов измерений с применением контрольных карт Шухарта (КК)

С помощью КК контролируют следующие показатели точности:

•    повторяемость (R-карта или карта размахов);

•    наличие смещения или правильность (Recovery-карта).

Подготовка и оформление исходных данных, расчеты параметров КК, ведение, управление и интерпретация КК должны осуществляться в соответствии с требованиями (4 ] и СТБ ИСО 5725-6, раздел 6.

Для проверки стабильности соответствия результатов испытаний показателям повторяемости, установленным данной методикой, применяются КК с заданными стандартными значениями. В этом случае для построения КК используют показатели повторяемости в соответствии с таблицей 1.

Примечание: При применении КК в течение длительного времени, для расчете границ КК могут бьггь использованы данные измерений, накопленные в процессе ведения и обработки КК. Однако соответствие результатов измерений требованиям данной методики может быть заявлено только в том случае, если показатель повторяемости, рассчитанный по накопленным лабораторией данным, статистически не превышает установленных методикой значений.

Для построения и ведения R-карт в качестве образцов для контроля (ОК) мшу г использоваться рабочие образцы.

Для построения и ведения Recovery-карт используются ОК, представляющие собой рабочие пробы с добавками стандартного раствора. Предварительно установленная массовая концентрация хлорамфепикола в данных пробах без добавки должна быть менее предела обнаружения, декларируемого производителем набора реагентов. Рекомендуется вносить добавку хлорамфепикола в образцы для контроля на уровне массовых концентраций в рабочих пробах.

13.4.1 Расчет параметров, ведение и оформление данных, интерпретация КК размахов для контроля стабильности СКО повторяемости

Рассчитываются значения центральной линии, границ регулирования и предупреждающих границ по формулам • Центральная линия

4<г_г = 1,128<7„    (17)

Г раницы peryj

Значения оценок относительной суммарной стандартной неопределенности и относительной расширенной неопределенности, полученные с учетом обнаруживаемого смешения, приведены в таблице 2. Таблица 2 - Оценки неопределенности результатов измерений, выполняемых в соответствии с МВИ

Виды продукции j Диапазон ; измерений, мкг/кг Относительная суммарпая стандартная неопределенность и(, % Относительная расширенная неопределенность U, %, К«2,/> = 95% Молоко сырое, пастеризованное, стерилизованное 1 (от 0,030 до ! 1,875 включ. 8 >6 Молоко сухое }от 0,030 до 11,875 включ. 9 18 Мясо ]от 0,015 до 0,750 включ. 9 18 Мед от 0,030 до 1,500 включ. 9 18

Указанные в таблицах 1, 2 метрологические характеристики получены на

основании данных эксперимента в соответствии с:

•    показатели прецизионности - СТБ ИСО 5725-2;

•    показатели правильности - СТБ ИСО 5725-4;

•    оценки неопределенности [ t ], [ 2 ].

3 Средства измерений, испытательное и вспомогательное оборудование, материалы, реактивы

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 высокого класса точности с наибольшим пределом взвешивания до 500 г, ценой деления не более 0,01 г.

Автоматический микронланшетный фотометр с филыром на 450 нм (допускаемая noipeiiiHocTb измерения оптической плотности не более ± 5 %), например EMax Plus, производства Molecular Devices LLC, США.

Программное обеспечение «MaxSignal® ELISA Detection Analysis System», разработанное BlOO Scientific Corporation (США).

Термометр лабораторный частичного погружения класса точности I с ценой деления I °С по ГОСТ 28498.

Центрифуга лабораторная, обеспечивающая относительное центробежное ускорение не менее 4000 g (пробирки вместимостью 15 см³), например Rotofix 32А, производства ilellich Lab Technology Aps, Германия.

Лабораторный портекс, обеспечивающий скорость вращения нс менее 1800 об/мин. например MSV-3500, производства BioSan Ltd, Латвия.

Лабораторный шейкер, обеспечивающий скорость до 300 об/мин, например термошейкер PST-60HL, производства BioSan Ltd, Латвия.

Гомогенизатор лабораторный типа ULTRA-TURRAX произволе та ПСА* Wcrke GmbH & Со. KG (Германия), например Ultra Turrax DI 25 Digital или бы говой блендер.

Роторный испаритель по, (держание температуры 60

производства Heidolph Instruments GmbH & Co.KG, Германия.

Баня водяная, обеспечивающая поддержание температуры 60 °С, 80 °С с точностью ±5°, например WB-4MS производства BioSan Ltd, Латвия.

Холодильник бытовой, позволяющий поддерживать температуру от плюс. 2 ”С до плюс 8 °С в холодильной камере и не выше минус 20 °С в морозильной камере.

Дозаторы пинеточные с комплектом одноразовых наконечников, например Acura manual 825, Асига manual 835, Асига manual 855 производства Socorex ISBA S.A., Швейцария:

-    с диапазоном объемов дозирования от 10 до 100 мм³ и относительным отклонением фактического объема дозы от номинального ± (2,5 - 1,5) %\

-    с диапазоном объемов дозирования от 100 до 1000 мм³ и относительным отклонением фактического объема дозы от номинального ± (1,5 - 1,0) %;

-    с диапазоном объемов дозирования от I до 10 см³ и относительным отклонением фактического объема дозы от номинального ± (2,0 - 1,0) %;

-    многоканальный с диапазоном объемов дозирования от 40 до 350 мм³ и относительным отклонением фактического объема дозы от номинального нс более ±(2.0 -1,5)%.

Использование следующего оборудования не является обязательным, но рекомендуется для увеличения производительности и повышения точности анализа:

•    Инкубатор для микротитро вал ьиых планшетов, обеспечивающий поддержание температуры от плюс 20 °С до плюс 25 °С с точностью не более ± L °С, например Thermomixer comfort производства Eppendorf AG, Германия в комплекте с термоблоком для микротитровальных планшетов.

•    Устройство отмывки иммунологических планшетов автоматическое с диапазоном объемов моющего раствора, заливаемого в каждую микрокювету от 100 мм³ до 350 мм3, например 3D-IW8, производства BioSan Ltd, Латвия.

Пробирки для центрифугирования из полипропилена вместимостью 15 см³.

Пробирки для центрифугирования из стекла или полистирола вместимостью 10 см³ или 15 см³. Допускается использовать пробирки для центрифугирования из полипропилена.

Пробирки микроцентрифужные с крышкой (типа Эппсндорф) из полипропилена вместимостью 1,5 -2,2 см³.

Пробирки для центрифугирования из текла вместимостью 10 см³ или 15 см³. Допускается использовать пробирки для центрифугирования из полипропилена.

Пробирки стеклянные вместимостью:

•    4 см³ или 5 см³ типа П-1-5-0,1 ХС по ГОСТ 1770.

•    10 см³, II-2-10-14/23 ХС по ГОСТ 1770;

Колбы мерные 2-100-2 или 3 - 100 - 2 но ГОСТ 1770.

Колбы Кн-1-100-14/23, Кн-1-250-24/29, Кн-1-500-29/32, Кн-1-1000-45/40 но

А*

Пипетки Пастера.

Микрофибровые салфетки, например Ultrafine 30x30, производства Marumi Optical Со. Ltd.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709 или вода деионизированная.

Лабораторный детергент.

Азот газообразный повышенной чистоты 1 сорт по ГОСТ 9293.

Этилацетат ч.д.а. по ГОСТ 22300.

Н-гексан ч.д.а. по I 3 ].

Ацетонитрил с массовой долей основного вещества 99,9 %, например ацетонитрил х.ч. по [ 5 ].

Хлорамфсмнкол с массовой долей основного вещества не менее 98 %.

Набор реагентов MaxSignal Ф для определения хлорамфеникола, каталожный номер 1013-05В (MaxSignal® Chloramphenicol (CAP) ELISA Test Kit, Reference H 1013-02B) производства BIOO Scientific Corporation (США) или ИФАантибиотик-хлорамфсникол, производства ООО «Кампания Альгимед» (Республика Беларусь), состоящие из реактивов и микротитровального планшета, необходимых для выполнения измерений по определению содержания хлорамфеникола методом иммуноферментного анализа. Состав наборов реагентов приведен в таблице 3. Таблица 3 — Состав набора реагентов

Компонент набора Количество в комплекте J Микротитровальный планшет (12 стрипов по 8 лунок, покрытых ! антителами к хлорамфениколу) 1 1 шт 1 Градуировочные растворы хлорамфеникола с концентрацией 0 иг/см*, ! 0,015 нг/см3,0,030 нг/см , 0,150 нг/см3,0,500 нг/см3, 1,500 нг/см3 6 ШТ X 1,8 см3 j Конъюгат хлорамфеникола с пероксидазой хрена 8,0 cmj • Юх концентрат экстракционного буфера для образцов 25 см-* | 20х концентрат промывочного раствора 28 cmj i Стоп-реагент 20см3 i ТМБ субстрат 12 cmj 1 ! Экстракционный буфер А 20 см" ! Экстракционный буфер В 20 смг I Буфер для доведения проб 6 cmj

Следующие компоненты набора реагентов являются взаимозаменяемыми в пределах их срока хранения при условии совпадения их номера в наборах реагентов производства BIOO Scientific Corporation:

•    10х концентрат экстракционного буфера для образцов;

•    20х концентрат промывочного раствора;

•    стоп-реагент;

•    ТМБ субстрат.

4 Метод измерений

Используемый метод основан на конкурентном колориметрическом пммуноферментном анализе. В ходе анализа в лунки планшета, покрытого антителами к хлорамфениколу, вместе с раствором пробы или градуировочным раствором добавляют конъюгат хлорамфеникола с пероксидазой хрена.    .

Присутствующий в пробе хлорамфеникол конкурирует^ коньюЬцзонаипым пероксидазой хлорамфениколом^^^Щш5ДШ|^ антитсддмУ''на стенка^ лунки. Интенсивносгь окраски,    субстрата,    обратно

пропорциональна концентрадо^RjftTBop$; Оптическая плотность

растворов измеряется при 450 НМ;

Массовая концентрация хлорамфеникола в образце определяется по градуировочной зависимости, построенной с использованием 6 градуировочных растворов.

5 Требования безопасности и требования к квалификации операторов

5.1    Требования безопасности

При выполнении работ по определению массовой концентрации хлорамфеникола обслуживающий персонал должен знать и строго соблюдать на рабочем месте требования:

•    электробезопасности поГОСТ 12.2.003;

•    пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004;

•    техники безопасности при работе в химической лаборатории в соответствии с инструкциями, утвержденными в установленном порядке;

•    техники безопасности, изложенные в инструкции по эксплуатации средств измерений и оборудования, применяемых при проведении измерений.

5.2    Требования к квалификации операторов

К проведению работ по данной методике допускаются лица, имеющие высшее специальное или среднее специальное образование по профилю выполняемых но методике работ, прошедшие обучение приемам работы на оборудовании, освоившие выполнение всех операций, предусмотренных методикой, владеющие техникой постановки иммуноферментного анализа

6    Условия выполнения измерений

При выполнении измерений в лаборатории должны быть соблюдены следующие условия:

•    температура окружающего воздуха от плюс 20 °С до плюс 25 °С;

•    температура при приготовлении растворов (20 ± 2) °С;

•    относительная влажность воздуха не более 80% при температуре 25 °С.

7    Условия    инкубации мнкротнтровальных плппшеюи в помещении

При отсутствии инкубатора микротитровальные планшеты могут инкубироваться в помещении при выполнении следующих условий:

•    температура окружающего воздуха должна быть от плюс 20 °С до плюс

• в особых случаях, которые оговорены по тексту МВИ, требуется помещать планшет в защищенное от света место, например в ящик стола.

8    Условия хранения набора реагентов

Хранение набора реагентов осуществляется в холодильнике при температуре от плюс 2 °С до плюс 8 °С в оригинальных флаконах и упаковке. Микротитровальные планшеты должны храниться в плотно закрытой упаковке. Если набор реагентов нс планируется использовать более трех месяцев, то конъюгат хлорамфеникола с нсроксидазой хрена рекомендуется хранить прн температуре минус 20 °С.

9    Подготовка к выполнению измерений

9.1    Отбор образцов

Отбор образцов проводят- по СТБ 1036. Отобранные образцы могут храниться в защищенном от света месте при температуре от плюс 2 °С до плюс 8 °С в течение 2-х дней или в замороженном виде при температуре не выше минус 20 °С в течение 14 дней. Перед проведением подготовки проб по п. 9.4 замороженные образцы должны быть разморожены при температуре от плюс 2 °С до плюс 8 °С.

9.2    Подготовка лабораторной посуды

Сильнозагрязненную лабораторную посуду предварительно обрабатывают хромовой смесью. Лабораторную посуду после мойки в растворе лабораторного дегергента промывают водопроводной, ополаскивают дистиллированной водой 2 раза и высушивают.

Запрещается:

•    повторное использование одноразовой лабораторной посуды;

•    использование бытовых моющих средств для мойки лабораторной посуды.

9.3    Приготовление растворов

9.3.1 Экстракциопный буфер для образцов

Аликвоту Юхконцснтрата экстракционного буфера для образцов, отмеренную дозатором или пипеткой, переносят в коническую колбу вместимостью 100 см³ или 250 см³ в зависимости от объема аликвоты, добавляют в 9 раз больший объем дистиллированной воды, отмеренный цилиндром, и перемешивают. Объем аликвоты концентрата, необходимый для приготовления экстракционного буфера для анализа образцов, составляет

•    мясо - 0,2 • // см³;

^,ЯГН

•    мед - 0,1 • см³.

Раствор используют свежеприготовленным.

9.3.2 Приготовление моющего раствора

Аликвоту 20хконце1прата моюще переносят в коническую колбу огмеренную мерным ЦИЛИН, больше объема аликвоты конц< выбирается в зависимости от п

составляет от 10 см³ до 28 см³. Полученный раствор хранят при температуре от плюс 2 °С до плюс 8 °С не более 1 месяца в стеклянной или полиэтиленовой посуде.

9.4 Подготовка проб

9.4.1    Подготовка проб сырого, стерилизованного и пастеризованного молока

9.4.1.1    Получение обезжиренного молока

Для подготовки проб используют образец, отобранный в соотвсгствии с разделом 9.1. Доводят температуру представленного образца от плюс 20 °С до плюс 25 °С. выдерживая молоко при комнатной температуре. Перед взятием аликвоты испытуемый образец тщательно перемешивают на ворпгексе. От образца молока с помощью пипетки или дозатора отбирают две параллельные пробы объемом по 10 см³ и помещают в пробирки для центрифугирования вместимостью 15 см³. Центрифугируют пробы в следующем режиме: 20 °С -25 °С, 4000 g, 5 мин.

Шпателем или пипеткой Пастера удаляют верхний жировой слой, образовавшийся на поверхности молока после центрифугирования.

9.4.1.2    Получение растворов проб молока

Аликвоты обезжиренного молока, полученные по п. 9.4.1.1, объемом 1см³, отобранные дозатором из каждой пробы, переносят в пробирки для центрифугирования типа Эппендорф вместимостью 1,5-2 см³ (перед тем, как вылить молоко в пробирку, наконечник пипет-дозатора вытирают фильтровальной бумагой для удаления возможных следов жира). Затем в пробирки добавляют 50 мм³ экстракционного буфера А, встряхивают 5 сек, сразу же добавляют 50 мм³ экстракционного буфера В, и перемешивают содержимое пробирки на воргсксе на максимальной скорости в течение 30 сек.

Пробирки центрифугируют в одном из двух режимов:

•    20    °С    -25    °С, 4000 g, 10 мин;

•    20    °С    -25    °С, 10000 g, 2 мин.

Дозатором переносят 440 мм³ надосадочной жидкости в новые пробирки для центрифугирования типа Эппендорф вместимостью 1,5-2 см³, добавляют в пробирки 60 мм³ буфера для доведения проб, и тщательно перемешивают содержимое пробирок на вортсксс.

Полученные растворы проб используются для проведения ИФА. Допускается хранение подготовленных проб при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 °С в течение двух часов.

9.4.2    Подготовка проб сухого молока

9.4.2.1 Получение обезжиренного молока

Для подготовки проб используют образец, отобранный в соответствии с разделом 9.1. Доводят температуру образца от плюс 20 °С до плюс 25 °С, вылерживая его при комнатной температуре.

В мерные колбы вместома    т 2 паргдо&юше навески

образца сухого молока, взвешенни    $пее 0Л ГГмЬссы навесок в

зависимости от содержания жира *    _    I

S

•    9,0 г сухого обезжиренного молока;

•    12,0 г сухого молока с содержанием жира 20 %\

•    12,5 г сухого молока с содержанием жира 25 %.

Затем приливают небольшими порциями по 10 - 20 см³ дистиллированную воду, нагретую до температуры 40 °С, перемешивая содержимое вращением колбы до полного растворения сухого молока.

Раствор охлаждают до температуры от плюс 18 °С до плюс 22 °С и ДОВОДЯТ до метки дистиллированной водой.

В две пробирки для центрифугирования вместимостью 15 см³ отбирают отмеренные дозатором аликвоты растворенного сухого молока объемом 10 см³.

Пробирки центрифугируют в следующем режиме: 20 °С -25 °С, 4000 g. 20 мин.

Шпателем или пипеткой Пастера удаляют верхний жировой слой, образовавшийся на поверхности молока после центрифугирования.

Для сухого обезжиренного молока описанную выше процедуру по удалению жира не производят.

9.4.2.2 Получение растворов проб сухого молока

Аликвоты обезжиренного молока, полученные по п. 9.4.2.1, объемом 1см³, отобранные дозатором из каждой пробы, переносят в пробирки для центрифугирования тина Эппендорф вместимостью 1,5 -2 см³ (перед тем, как вылить молоко в пробирку, наконечник пипет-дозатора вытирают фильтровальной бумагой для удаления возможных следов жира). Затем в пробирки добавляют 50 мм³ экстракционного буфера А, встряхивают 5 сек, сразу же добавляют 50 мм³ экстракционного буфера В, и перемешивают содержимое пробирки на вортексе на максимальной скорости в течение 30 сек.

Пробирки центрифугируют в одном из двух режимов:

•    20    °С    -25    °С,    4000    g,    10    мин;

•    20    °С    -25    °С,    10000 g, 2 мин.

Дозатором переносят 440 мм³ надосадочной жидкости в новые пробирки для центрифугирования типа Эппендорф вместимостью 1,5 — 2 см³, добавляют в пробирки 60 мм³ буфера для доведения проб, и тщательно перемешивают содержимое пробирок на вортексе.

Полученные растворы проб используются для проведения ИФА. Допускается хранение подготовленных проб при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 °С в течение двух часов.

9.4.3 Подготовка проб мяса

Образец мяса, отобранного в соответствии с п. 9.1, гомогенизируют с помощью гомогенизатора или блендера. Доводят температуру образца от ш.юс 20 °С до плюс 25 °С, выдерживая его при комнатной температуре.

От гомогенизированного образца мяса отбирают две параллельные навески массой 3,00 г. взвешенные с погрешностью нс более 0,01 г. Навески помещают в пробирки для центрифугирования вместимостью 15 см³ и в каждую пробирку добавляют отмеренные пипеткой или дозатором 6 см³ этилацетата. Содержимое пробирок интенсивно встряхивают^скодь|ораз, после чет'дополнительно перемешивают на вортексе на    течение Э^ПвК.

Затем пробирки це1Гфнф;«^Й£ю|2п^    g,    ^Н&ЧСНИЬ 5 МИН.

После центрифугировать!    ДоЗауором над    осадочную

•V