МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

МЕТОДИКА

ОПРЕДЕЛЕНИЯ НИТРОЗ AM И НОВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ И ПРОДОВОЛЬСТВЕННОМ СЫРЬЕ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МВИ.МН b5Vb~M(Q

МВИ аттестована РУЛ "Белорусски?! государственный институт петрологии" Свидететьстьо об аттестации №    525] АНО

от ^>r7-P ю _ЭТбГг.

Минск 2010

ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ РЕСПУБЛИКАНСКИЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ ЦЕНТР ГИГИЕНЫ

СОГЛАСОВАНО    УТВЕРЖДАЮ

Зам. директора Бел 1 ИМ    Заместитель Министра

Главный государственный врач Республики Беларусь

Т А. Коломиец

«    »    2010г.

МЕТОДИКА

ОПРЕДЕЛЕНИЯ НИТРОЗАМИНОВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ И ПРОДОВОЛЬСТВЕННОМ С ЫРЬЕ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МВИМН -2010

Директор ГУ «РНПЦ гигиены» профессор

В.П. Филонов 2010г.

Минск 2010

дистиллирован ном воды, добавляю! рабочим раствор ДПНЛ (и. 8.2.7.1). К смеси добавляют 10 г сульфата натрия, 1 г сульфаминовой кислоты, 10 г хлорида натрия, 10 см³ I н раствора серной кислоты. Смесь перемешивают, подсоединяют колбу к системе и отгоняют 11А с водяным паром, собирая 250 см' дистиллята в колбу вместимостью 250 см\ Далее действуют в соответствии с п 8.2 9.3. п 8 2.9 4.

Н.З Успюшж/ет/е градуировочит! характеристики

Н.З. /. У см шин х/нпншю.’/тфп/ншанпя

Хроматографирование градуировочных растворов и холостой пробы проводят на жидкосиюм хроматографе с флуоресцентным детектором; при следующих условиях:

-    колонка из нержавеющей сгали (250 х 4,6 мм), заполненная сорбентом Eclipse XDB-C18, размер частиц 5 мкм,

-    температура колонки 30°С;

-    подвижная фаза - смесь ацетон нитрил-вода в объемном соответствии 7:3,

-    скорость элюирования - 1.2 см'/мин,

-    длина волны возбуждения 350 нм;

-    эмиссионный фильтр 530 нм;

-    коэффициент усиления ФЭУ - 10;

-    ширина пика > 0,2 мин, постоянная отклика 4 с;

-    объем вводимой пробы - 20 мкл;

-    время удерживания дансилпроизводных НА устанавливают по градуировочным paci ворам при вышеприведенных условиях хроматографии.

Я.3.2. Насчет относитс.п.но.ч) ,’/ки)уи/чшочно.'о ком/мрициента

Для расчета относительного градуировочного коэффициента каждого определяемого НА используют градуировочные растворы, приготовленные в соответствии с п. 8.2.9.2-8 2.9.4 и холоаую пробу. Для этого аликвотную чаегь 0,020 см' каждого фадуировочного раствора вводят в инжектор жидкосгного хроматофафа Регистрируют площади пиков ДМНА и ДЭНА и внутреннего стандарта Хроматофафирование каждого фадуировочного раствора и холостой пробы проводят трижды

Рассчи1ываюг о i постельные фалуировочные коэффициенты К.₀для каждой концентрации ДМНА и ДЭНА относительно внутреннего стандарта с концентрацией 2,00 мкг/см' по формулам (1) - (6), средние значения коэффициентов К 11чн рассчитывают по формулам (7), (8) для каждого определяемого НА (ДМНА и ДЭНА) во всем диапазоне измерений.

V'

*> .яапххк! = —

где

S.nm.im. - средняя площадь пика ДМНА в холости пробе;

■ площадь пика ДМНА при j-ом измерении холостой пробы

S.r

SjT)m.u>a$ - средняя площадь пика ДЭНА в холостой пробе,

•\_rwtw - площадь пика ДЭНА при j-ом измерении холостой пробы

10

С'

А~

(3)

где

К,__-pffrj - относительным градуировочным коэффициент для i-ro раствора ДМ11А.

по результатам j-ro измерения,

С_1Л<И, - концентрация ДМНА в i-ом градуировочном растворе (таблица 3), мкг/см³;

" площадь пика ДМНА по результатам j-ro измерения i-ro градуировочного раствора,

- концентрация внутреннего стандарта (ДПНА) в i-ом градуировочном растворе, мктУсм³,(С’_Л,_О1г~2,00 мкг/см³);

_1Ш - площадь пика внутреннего стандарта (ДМНА) по результатам j-ro измерения i-ro 1радуировочно10 раствора;

К^нъян = —— - (4)

где

К    в и    - среднее значение относ ительного градуировочного коэффициента для

концентрации ДМНА в i-ом градуировочном растворе.

Аналогично рассчитываю! относительным 1радуировочный коэффициент К,.гна концентрации ДЭНА в i-ом градуировочном растворе

К

Ччтм.1HI.I

^ ..I V/. 1 ‘Vj-V.

'fabJVl, I    b.OILlvu

)

(5)

где

К_1/отач!л ~ относительным градуировочный коэффициент для i-ro раствора ДЭНА, по результатам j-ro измерения,

С\_Г)П1 - концентрация ДЭНА в i-ом градуировочном растворе (таблица 3), мкг/см³; \.mi * площадь пика ДЭНА по результатам j-ro измерения i-ro градуировочного раствора;

• концентрация внутреннего стандарта (ДПНА) в i-ом градуировочном растворе, мкг/см³ ,(C'_ailtw =2,00 мкг/см³);

‘ площадь пика внутреннего стандарта (ДПНА) по результатам j-ro измерения i-ro 1радуировочного paci вора;

КнящХли --    (6)

9

где

К„т^.пи.1 - среднее значение относительного 1радуировочного коэффициента для концентрации ДЭНА в i-ом градуировочном растворе

II

К киннЯВИ

Кою&аи-—— - (7)

Кom*x.ai* - среднее значение относительного градуировочного коэффициента для ДМНА по всему диапазону концентраций;

/ . К юткГЯЫ

КоаьОЯи — ^1Ш' ^    (8)

Коттши - среднее значение относительного градуировочного коэффициента для ДЭНА по всему диапазону концентраций.

Н. 4 Отбор проб &!Я (шалим

Отбор проб производят в соответствии с СТБ 1036. Масса средней пробы пищевого продукта или продовольственного сырья должна быть не менее 1 кг.

Отобранные пробы хранят в морозильной камере при температуре от минус 8°С до минус18°С

9 Проведение анализа

Перед проведением анализа испытуемого образца должны быть выполнены следующие этапы:

1)    Проверка стабильности градуировочного коэффециента

2)    Проверка на чисготу реактивов (котроль холосгой пробы)

3)    Приготовление неминуемой пробы

4)    Приготовление пробы с добавкой

9. / П/нтерка стабильности г/xidyupoeoиного коэффициента

Для контроля С1абильности градуировочного коэффициент перед проведением анализа испытуемых образцов в инжектор хроматографа однократно вводят градуировочные растворы № 2 и 4 (в соответствии с таблицей 3). приготовленные по пп. 8.2.9.2-8.2.9 4 и холос1ую пробу После этого рассчитывают    и    А‘^-_{|    ГпГУ}/_Г    ^по

формулам (3), (5). Отклонение относительных градуировочных коэффициентов для ДМНА и ДЭНА в каждом из paciворов от значений, полученных при расчете относительного градуировочного коэффициента по м 8 3.2 не должно превышать 10% для каждого определяемого НА

где

К,и*. - среднее значение отнооггсльного градуировочного коэффициента ДМНА или ДЭНА, полученное при расчете по и.8.3.2.

Ко,*»* - значение относительного градуировочного коэффициента ДМНА или ДЭНА, полученное при проверке градуировочного коэффициента

12

В случае получения значения относительного 1ралуировочиого коэффициента, отличающегося более чем на 10,0% для любого определяемого НА необходимо принять меры по устранению причин невыполнения условия (9)

9.2 Контроль холостой пробы

Проверку на чисготу реактивов (контроль холостой пробы) проводя! при использовании новой партии реактивов в соответствии с п. 8.2.9.5, полученный раствор хроматографируют дважды Концентрации ДМНА и ДЭНА в холостой пробе, рассчитанные по п 10.1.1, 10.1.2, нс должны превышать соответственно 0.0010 мг/кг и 0,00075 мг/кг. В случае превышения указанных пределов необходимо принять меры по очиегке используемых реактивов, либо заменить реактивы В случае, если сумма концентраций определяемых НА в холостой пробе не превышает 0,0001 мг/кг, то при расчете результатов измерений содержание НА в холостой пробе допускается не учитывать.

9.3 Пригопкмпепие испытуемой п/нюы

9.3. / НьЮеленпе НА путем отгонки с ноОнным па/юм

Среднюю пробу в количестве 1 кг измельчают, хорошо перемешивают и из полученной пробы отбирают 2 навески по 100 г (взвешенные с точностью 0,1 г). Каждую навеску помещают в круглодонную колбу вмеешмоаыо 500 см¹. К навеске добавляют 150 см дистиллированной воды и при помощи пинетки вмес1имос1ЫО 1 см¹ вносят раствор ДПНА концентрацией 2 мкг/см³ (п. 8 2.7.1) в количестве 1 см³. В полученную смесь добавляют 10 г хлорида натрия, 10 г сульфата натрия, I г сульфаниловой кислоты, 10 см³ 1 н раствора серной кислоты Смесь перемешивают, колбу устанавливают в систему для отгонки НА с водяным паром, собирют 200-250 см³ дистиллята Схема прибора для перегонки с водяным паром приведена в приложении А.

9.3.2 Экст/KiKifiiH НА и j Оисптллята

200-250 см’ дистиллята, полученного по п.9.3.1 помешают в делительную воронку на 500 см³, колбу ополаскивают 20 см³ хлористого метилена, который затем сливают в делительную воронку с дистиллятом, смесь интенсивно встряхивают в течении 5 мин и оставляют до четкого расслаивания фаз Экстракцию хлористым метиленом повторяют еще дважды порциями по 20 см³ Каждую порцию экстракта в хлористом метилене сливают через воронку с бумажным фильтром, заполненную 5 г безводного сульфата натрия или сульфата магния в колбу для отгонки на 100 см³ Фильтр с сульфатом натрия промывают 10 см³ экстрагента Далее в осушенный экстракт добавляют 2 см³ 3,3%-ного раствора бромистого водорода в уксусной кислоте, приготовленного по и. 8.2.2., перемешивают и оставляют для процесса денитротирования не менее чем на 30 мин при комнатной температуре Упаривают хлористый метилен на ротационном испарителе при температуре водяной бани не более 30°С. Полученный экстракт количественно переносят в фарфоровую чашку, колбу для упаривания омывают 0,5 см³ уксусной кислоты и присоединяют к содержимому фарфоровой чашки Экстракт осторожно упаривают на песчаной бане при температуре не более 120°С досуха.

Чашку с сухим остатком охлаждают до комнатной температуры После охлаждения в фарфоровую чашку добавляют 0.6 см³ буферного раствора и круговыми движениями растворяют сухой остаток. К полученному экстракту добавляют 0,8 см'³ раствора дансилхлорида. приготовленного по п 8 2.1.. перемешивают и немедленно переносят

13

смесь и пробирку с притертой пробкой вместимостью 5 см\ Плотно закрытую пробирку помешают в водяную баню с температурой 55°С не менее чем на 40 мин для прохождения процесса получения дансил-производнмх

Затем пробирку извлекают из водяной бани и охлаждают до комнатной температуры К полученному раствору добавляют 1 см' бензола, интенсивно встряхивают в течении 5 минуг и оставляют до момента четкого разделения фаз. Из верхнего прозрачного бензольно-ацетонового слоя пипеткой вместимостью 2,0см' отбирают прозрачный экстракт и переносят в пробирку вместимостью 5 см' с пришлифованной пробкой После этого экстракцию бензолом повторяют еще раз и снова отбирают прозрачный бензольноацетоновый экстракт, объединяя его с первой порцией Суммарный объем растворителей из экстракта отдувают в токе азота досуха строго в вытяжном шкафу К полученному сухому ост ку добавляю! I см подвижной фазы, нлозно закрывают и растворяют сухой остаток путем интенсивного встряхивания. Полученный прозрачный раезвор хроматографируют дважды при условиях хроматографирования, указанных в п. 8.3.1.

9.    •/ Приготовление пробы с добавкой

При! о ювление и анализ пробы с добавкой проводят I раз в серии из 5 образцов Для этого из средней пробы образца, приготовленной по п. 9.3.1 отбирают 2 навески по 100 г, взвешенные с точностью 0,1 г. Каждую навеску помещают в круглодонную колбу вместимостью 500 см^-'. К навеске добавляют 150 см' дистиллированной воды и при помощи пипетки вместимостью 1 см' вносят раствор Д1111А с концентрацией 2.00 мкг/см' (п 8 2.7 I) в количестве I см' и основной раствор смеси ДМНД и ДЭНА (п. 8.2.9.1) в количестве 3,3 см' при помощи пипетки вмесшмосгыо 5 см'

Дальнейший анализ проводят по п. 9.3.1-9.3.2.

10 Результаты измерений

10.    / Насчет содержания НА

/0.1.1 Насчет концент/ктнн ДМ НА в холоспнт п/хюе

Концентрация ДМНА в холостой пробе рассчитывается на основании измерений,

* S.MI.1дм »1 4 А втлхни

Г

(10)

ЛШДпЫ

проведенных в соответствии с п 9.2.

где

- концентрация ДМНА в холостой пробе по 1 хроматограмме, мкг/см³; .V_MteBl - площадь пика ДМНА в холостой пробе по 1 хроматограмме,

А‘отч.ля/1 - относительный градуировочный коэффициент для ДМНА (рассчитывается по формуле (7));

С_иа, - концентрация внутреннего стандарта, мкг/см', ((’_e,_tB, =2,00 мкг/см');

^>4»t»vwi " площадь пика внутреннего стандарта (ДПНА) в холостой пробе по I хроматограмме;

Аналогично рассчитывают концентрацию ДМНА по 2 хроматограмме С._МК1ям1% по формуле (10)

14

Затем рассчитывают среднюю концентрацию ДМНА холостой пробы С’.л/иал! по формуле:

Сл

С +г

' ,<ш lor.i    ,(\ui    ixntl

(II)

где

Г,ви1ш * среднее значение концентрации ДМНА в холосгой пробе. мкг/см\

10.1.2 Расчет концентрации ДЭНА в хо. юс тон п/юбе

Концентрация ДЭНА в холостой пробе рассчитывается на основании измерений, проведенных в соответсшпи с п. 9.2.

'• .DH.luui

г 41 Iviil

У Ко

•V_

(12)

где

(■лашл " концентрация ДЭНА в холостой пробе по 1 хроматограмме, мкг/см’, S r<ni~.,i - площадь ника ДЭНА в холостой пробе но I хроматофамме;

Кстони - относительный градуировочный коэффициент для ДЭНА (найден по формуле (8))

С_ыст - концентрация внутреннего стандарта (2мкг/см³), мкг/см³;

^<и,сяхлл " площадь пика внутреннего стандарта (ДГТНА) в холостой пробе по I

хроматограмме.

Аналогично рассчитывают концентрацию ДЭНА по 2 хроматограмме    по

формуле (12)

Затем рассчитываю! среднюю конценфацию ДЭНА холостой пробы киш по формуле:

Т' _    ⁺ ^ JVUxat:    ,, ,_ч

V .rvom. =- (13)

где

( \rvnu». - среднее значение концентрации ДЭНА в холостой пробе, мкг/см'

10.1.3 Расчет конце ипцкщич ДМНА « пробе об/хпца

О.

AKlxfl

_ ^ -■.» ^К^1    ^К    k    с-Ч.ЛЯ/1

s

(14)

где

С’, _rfff,_rY>r, - концентрация ДМНА в анализируемом образце первой параллели no I хрома юграмме. мкг/см³;

•V,    -    площадь    пика    ДМНА    в    исследуемом    образце    первой    параллели    но    I

хроматофамме

15

I Область применения

Настоящий документ «Методика определения нитрозаминов в пищевых продуктах и продовольственном сырье методом высокоэффективной жидкостной хроматографии» устанавливает методику выполнения измерений массовой концентрации (далее -коицетрация) суммы летучих ншрозаминои (далее - НЛ) димегилшггрозамина (далее -ДМНА) и диэтилншрозамина (далее - ДЭНА) в нишевых продуктах (мясных и колбасных изделиях, в рыбе и рыбных изделиях, в детском питании на основе мясных, рыбных и мучных продуктов) и продовольственном сырье (в зерне, сыром мясе, рыбе) методом жидкостной хроматографии с флуоресцентным детектором

Методика предназначена для органов и учреждений, осуществляющих государсгвенный санитарный надзор, для научно-исследовательских и других заинтересованных организаций.

Диметилнитрозамин - маслянистая жидкость, плотность (далее - d¹⁸) 1,01, температура кипения 152- 153°С, растворим в воде, этаноле, эфире и других органических растворителях Структурная формула - (CHj)aN - N=0, молекулярная масса - 74,08.

Диэтилнитрозамин - маслянистая жидкость, d^w 0,95, температура кипения -176,9°С, растворим в воде, этаноле, эфире и других органических растворшелях Структурная формула - ((^H^N - N-0, молекулярная масса 102,13.

ДМНА и ДЭНА обладают широким спектром токсического действия и могут вызывать опухоли различной локализации

В соответствии с Санитарными нормами, правилами и гигиеническими нормативами «Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов», угвержденными Постановлением Министерства Здравоохранения от 09 июня 2009 г. № 63, предельно допустимая концешрацпя (ПДК) НА в мясе, мясных изделиях, колбасах - не более 0,002 мг/кг, в копченостях - нс более 0,004 мг/кг, в рыбе свежей и пиве - нс более 0,003 мг/кг, в продуктах для детского питания - не допускается при чувствительности метода 0,001 мг/кг, в зерне (пивной солод) - нс более 0,015 мг/кг

Ш

Метод основан на выделении НА перегонкой с водяным паром и экстракции органическим растворителем, дентрозированин НА бромистым водородом в уксусной кислоте до соответствующих аминов, получении производных аминов с 5-(диметиламнно)-нафталин-1-сульфохлоридом (далее - дансилхлоридом), хроматографическом разделении и количественном определении образовавшихся производных методом ВЭЖХ с флуоресцентным детектором.

Нижний предел измерения настоящей методики составляет 0,0005 мг/кг для ДМНА и 0,00075 мг/кг для ДЭНА.

Идентификация дансилпронзводных НА производится по временам удерживания, а количественное определение содержания ДМНА и ДЭНА - методом внутреннего стандарта 13 качестве внутреннего стандарта применяется дипропил нитрозамин (далее -ДИНА), который соответствует требованиям, предъявляемым к выбору внутреннего стандарта при количественном анализе меголом жидкостной хромаюграфии и является наиболее приемлемым для надежного результата. (2J

2 Показатели прецизионности методики

Относительные значения показателей прецизионности МВИ (повторяемости и промежуточной прецизионности) при довертел ьной вероятности Р 95% представлены в таблице I

2

Таблица I Пределы измерении и m постельные значения показателей прецизионности МВИ (доверительная вероятность Р = 95%)

НА	Диапазон измерений. чг/кг	11ижнмй предел измерений мг/кг	Оросительное стан,1артнос отклонение		Предел повторяемоети (для двух результатов параллельных определений) г.%	Предел промежуточной прецизионности (для двух результатов измерений) гпюо %
			повторяемости S„%	промежуточной прецизионности •W%
ДМНА	(>г 0.0005 до 0,5000 включ.	0,0005	6.3	6,5	17,6	18,2
ДЭНА	От 0,00075 до 0.75000 включ	0,00075	5,9	6,5	16,5	18.2

При использовании МВИ должна произволнтъея оценка показателя правильности (определение лабораторного смешения) в соответствии с СТБ ИСО 5725-4 и оценка неопределенности измерений при ее реализации в кон кретон лаборатории

3 Средства измерении, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

Agilent 1100

3.1 ('редства inuepeinni

Высокоэффективный    жидкостной    хроматофаф,

включающий:

-    насос с вакуумным дегазатором

-    термостат колонок

-    флюориметрический детектор

-    систему управления и обработки данных

Весы лабораторные    электронные с точностью

взвешивания 0,0001г. Adventurer AR2I40 Микрошприц для хроматографа, «Hamilton» 50мкл. цена деления I мкл

Пинегка 2 кл. точности 0,1 см¹, цена деления 0,002 см Пипетки 1-I-I-I 1-1-1-2 1-1-1-5 1-1-1-10

Колба мерная 2450,100,200,250,500,1000)-2 Цилиндр мерный 3-(50,1000)-!

Пробирка со шлифом П-2-(5,10) 14/23 ХС

3.2 Нспалюгательные уст/нтспта и оборудование

Кондиционер Н 07 ZF    Фирма Samsung

Водяная баня НВ4 digital    Фирма IKA

Баня песчаная

Ротационный вакуумный испаритель ИР-IM    ТУ 25-11-917-74

Баня водяная    ТУ 64-1-423-72

Воронки ВД-1-500    ГОСТ 25336-82

Воронки конические, стеклянные диаметром 30-33 мм

Колба К_г-50-14/23 ТС    ГОСТ 25336-82

Колба К-1-250-29/32 ТС    ГОСТ 25336-82

Мясорубка и измельчитель

Фарфоровые чашки для выпаривания (диаметр 55 мм, объем 20 см*)

УФ-лампа ОКН-11    ТУ 84-1-1618-77

Холодильник с морозильной камерой Система для фильтрования и дегазации элюента

Могут быть использованы другие средства измерений и вспомогательные устройства, по точности, не уступающие рекомендованным в методике.

3.3 !>сакгтшы и люте/тшы

Колонка для жидкостной хроматографии металлическая (250x4,6) liclipsc XDB-C18, 5мкм Димегилншрозамшц р-1,01 г/см*

Диэтилнитрозамин, р~0,95 г/см³

Ди пропил нитрозам ни. 100мг

Метанол для ВЭЖХ >99,9%

Ацетон для ВЭЖХ >99,8%

Ацетонитрил для ВЭЖХ >99,9%

Бензол, >99,5% для ВЭЖХ Кислота уксусная, >99%

Бромистый водород в уксусной кислоте, >33%

Хлористый метилен, для ВЭЖХ Натрии сернокислый безводный, >99.0%

Дансилхлорнд, 95%

Кислота серная, 95-98%

Натрия гидроокись. >98%

Натрий углекислый кислый. 99,7-100.3%. Сульфамнновая или сульфаниловая кислота, >99,0% Натрий хлористый, >99,5%

Вода дистиллированная Фильтры бумажные, «синяя лента»

Фильтры из регенерированной целлюлозы, диаметром 47 мм с размером пор 0,45 мкм

Могут быть использованы реактивы и материалы по техническим характеристикам не хуже указанных выше.

4 Метод измерения

В соответствии с данной МВИ измерения производятся методом ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием после следующих этапов пробоподготовкн - перегонка с водяным паром нитрозаминов.

-    экаракция in водной среды в органический растворитель, получение аминов - денитрозирование;

-    удаление органического растворителя и упаривание досуха;

-    получение дансилпро из водных аминов;

-    псрсэкстракция даненлпроизводных из водно-ацетоновой среды в органический раствори!ель;

-    удаление органического растворителя;

-    хроматографирование полученных даненлпроизводных

5    Требовании безопасное I и

Помещение, в котором производится определение НА, обязательно должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией.

Работу с НА следует проводить в вытяжном шкафу с использованием индивидуальных средств защиты (очки, перчатки и др ).

В лаборатории, где проводится работа с канцерогенными летучими НА, всегда должен быть в наличии 3,3% раствор бромистоводородной кислоты в уксусной кислоте для разрушения НА при попадании их на рабочие места и пол. По окончании работы в целях разрушения легучих НА в воздухе помещение необходимо обработать УФ-светом в течение 30 минут.

Транспортировка и хранение НА осуществляется в стеклянных запаянных ампулах, обернутых в асбестовую ткань и упакованных в металлическую тару, оплавленную парафином

НА хранят в отдельном холодильнике в озсутствие анализируемых проб.

6    Требования к квалификации оператора

К выполнению измерений и обработке результатов хроматографического анализа могут быть допущены лица, имеющие высшее специальное образование, опыт работы в области жидкостной хромаюграфии, изучившие зребования безопасности и настоящую методику, руководство по эксплуатации жидкостного хроматографа, инарукцию по использованию системы обработки хроматографических данных

7 Условия выполнения измерений

Выполнение измерений в лаборатории по настоящей методике осуществляется при следующих условиях:

-    температура воздуха при приготовлении растворов, в том числе градуировочных (20±2)°С;

-    температура воздуха при измерении (20±5)°С;

-    атмосферное давление 84,0-106.7 кПа;

-    влажность воздуха (65±15)% при земперазуре 25 °С; напряжение питающей сети (230 ± 10) В;

частота переменного тока (50 ± 0,4) Гц.

Выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводятся в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору и настоящей методикой

8 Подготовка к выполнению измерений

5

Перед выполнением измерений должны быть проведены следующие работы: подготовка измерительной аппаратуры, приготовление растворов, установление градуировочной характеристики, отбор и подготовка проб к анализу

8.1    Подготовка измерительной аппаратуры

Жидкостной хроматограф подготавливают к работе согласно инструкции по эксплуатации. Устанавливают рабочие режимы для колонки и детектора Для дегазации колбу с злюснтом помещают на водяную баню при температуре 40-50 °С, открыв при этом пробку. После охлаждения колбы до комнатной температуры подвижная фаза готова к применению. Элюент должен быть всегда закрыт пробкой и храниться в холодильнике при температ уре от 2°С до 8°С.

8.2    Приготовление растворов

Я. 2.1 Раствор дансилхлориОа с копоеит/нщией 0,5 .иг ел/.

Навеску дансилхлорида массой 26,5 мг помешают в мерную колбу вместимостью 50 см' и растворяют в 20 см' ацетона, доводят до метки ацетоном Готовый раствор хранят в холодильнике при температуре от 2°С до 8°С, тщательно предохраняя от попадания влаги Срок хранения - нс более 3 месяцев

Я. 2.2 3.3 %-пыи /метеор б/юмистоеоОо/юОиой киаоты в уксусной кислоте (оенит/юзирующий /метеор)

В коническую колбу вместительностью 50 см³ вносят 5 см' 33%-ного бромистого водорода в уксусной кислоте и добавляют 45 см' ледяной уксусной кислоты Смесь хранят в холодильнике при температуре от 2°С до 8°С в посуде из темного стекла Срок хранения - не более 1 месяца Признаком непригодности для использования раствора является появление же.>по-коричневой окраски

Я. 2.3 буферный /метеор е pH 10,5

В мерную колбу вместимостью 500 см' помещают 3,2 г NaOH и вливают 200 см' дистиллированной воды, перемешивают до полного растворения щелочи, добавляют 20,0 г NaHCOv Тщательно перемешиваю! раствор до полного paci Борения соли, доводяз объем раствора до метки дистиллированной водой Хранят раствор в полиэтиленовой посуде Срок хранения - 3 месяца

Я. 2.) / и раствор серной кислоты

В мерную колбу вместимостью 250 см' помещают 200 см' дистиллированной воды Добавляют 6,7 см' концентрированной серной кислоты (плотностью 1,08 г/см'), перемешивают, охлаждают до комнатной температуры Доводят объем до метки дистиллированной водой Срок хранения неограничен

Я. 2.5 Рабочий /метеор ЯМ НА с концент/моией 10. / .иг см*

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 20 см³ метилового спирта Добавляют I см³ ДМНА (кат № 7756) пипеткой вместимостью I см' и доводят объем до

6

межи метиловым спиртом. Смесь перемешивают и хранят в посуле из темного стекла в холодильнике при температуре от 2°С до 8°С не более 1 года.

Я. 2.5.1 Рабочий раствор ДМНА с концентрацией 101 .икг с\г

В мерную колбу вместимостью 10 см' помещают 20 см' метилового спирта Добавляют I см' ДМНЛ (п. 8.2.5.) пипеткой вместимостью I см и доводят объем до межи Meiиловым спиртом. Смесь перемешивают и хранят в посуде из темного аекла в холодильнике при температуре от 2°С до 8°С не более I года

Я. 2.6 Рабочий раствор ДЭНА с концентрацией 9,5 .иг cV*

В мерную колбу вмесгимостью 100 см' помешают 20 см' метилового спирта Добавляют 1 см' ДЭНА (каг № 0756) пипеткой вместимосгью I см' и доводят объем до метки метиловым спиртом Раствор перемешивают и хранят в посуде из темного стекла в холодильнике при температу ре от 2°С до 8°С не более I года

Я. 2.6.1 Рабочий раствор ДЭНА с Komfcumpatpieii 95 икг c.w'

В мерную колбу вместимостью 100 см' помешают 20 см' метилового спирта Добавляют 1 см' рабочего раствора ДЭНА (п. 8.2.6) пипеткой вместимостью 1 см' и доводят объем до метки метиловым спиртом. Смесь перемешивают и хранят в посуде из темного стекла в холодильнике при температуре от 2°С до 8 °С нс более 1 года

Л. 2.7 Рабочий /метеор ДНИ А с коицеит/хгцией 400 л/кг с.и

В мерную колбу вместимостью 250 см' количественно переносят образец ДПНА массой 100 мг (кат. № 48554), растворяя его в метиловом спирте, и доводят объем до метки метиловым спиртом Смесь перемешивают и хранят в посуде из темного стекла в холодильнике при температуре от 2°С до 8°С нс более 1 года

Я. 2.7. / Рабочий /метеор ДПНА с концентрацией 2 икг см' (внутренний стандарт)

В мерную колбу вместимостью 200 см' вносят I см' рабочего раствора ДПНА с концентрацией 400 мкг/см' пипеткой вместимостью 1 см\ затем добавляют 20 см' метилового спирта, тщательно перемешивают и доводят объем до метки метиловым спиртом. Смесь перемешивают и хранят в посуде из земного сгекла в холодильнике при температуре от 2°С до 8°С не более 6 месяцев.

Я.2.Я ПоОенжная </кна Они жнокоетшк'о х/юматог/Mtfm смесь ацетоннт/ни : eotki

(7:3)

В случае отсутствия дегазазора в составе жидкостного хроматографа приготовление элюента производят следующим образом В коническую колбу вмеешмоаыо 1000 см' наливают 700 см' ацетонитрила Добавляют 300 см' дистиллированной воды, тщательно перемешивают и дегазируют Для дегазации колбу с элюентом помещают на водяную баню при температуре 40-50 С. открыв при этом пробку' После охлаждения колбы с элюентом до комнатной температуры, элюент фильтруют через систему для фильтрования и дегазации, после чего подвижная фаза гозова к применению Элюент хранизься в холодильнике при земперазуре от 2°С до 8°С в закрьпой посуле ('рок хранения не ограничен.

7

8.2.9 I Ipusomoa leuue градуировочных растворов

8.2.9.1 П/тгопимиенне основного /шство/ю смеси ДМНА и ДЭНА с конце нт/шцняин 0,303 .икг CW и 0,456 .укг си' соответственно

В мерно»! колбе вместимостью 1000 см' с нр1ггертой пробкой смешивают 3,0 см' раствора ДМНЛ (по п. 8.2.5.1), 4,8см' ДЭНА (по п. 8.2.6.1) отмеренные пмие1ками вместимостью 5 см' и доводят объем до метки метиловым спиртом. Раствор перемешивают и хранят в посуде из темного стекла в холодильнике при температуре от 2 °С до 4 °С нс более 6 месяцев

8.2.9.2 НыОетше НА путем отгонки с воОяным па/ю.и

В колбу для перегонки вместимостью 500 см³, соединенную с паровиком и прямым холодильником в соответствии с рисунком, приведенным в приложении А, помешают 250 см' дистиллированной воды, добавляют основной раствор смеси ДМ11А и ДЭНА (п. 8.2.9.1). атаюкс рабочий раствор Д1II1А(п. 8.2.7.1) в количествах, указанных втаблицс 2. К смеси добавляют 10 г сульфата мафия, 1 г сульфаминовой кислоты, 10 г хлорида натрия, 10 см I н расгвора серной кислоты Смесь перемешиваю!, подсоединяют колбу к системе и отгоняют НА с водяным паром, собирая 250 см' дистиллята в колбу вместимостью 250 см'.

Данную процедуру проводят для каждого градуировочного раствора, добавляя основной раствор смеси ДМНА и ДЭНА (п 8 2 9 1) и рабочий раствор Д1111А (п 8 2 7 1) в соответствии с таблицей 2.

Таблица 2 - Приготовление градуировочных растворов.

№ градуиро вочного раствора Объем смеси ДМНА и ДЭНА, см' Объем рабочего раствора ДГТНА, см3 1 0,17 1 2 0,83 1 3 3,30 1 4 6,60 1 5 10,00 1

8.2.9.3    Экстракция НА т дистиллята

Каждые 250 см³ дистиллята, полученного по п. 8.2.92 помешают в дел»гтельную воронку вместимостью 500 см', колбу ополаскивают 20 см' хлористого метилена, который затем сливают в делительную воронку с дистиллятом, смесь интенсивно встряхивают в течении 5 мин и осгавляют до чегкого расслаивания фаз Экаракцию хлористым метиленом повторяю! еше дважды порциями но 20 см'. Каждую порцию экс i рам а в хлористом метилене сливают через воронку с бумажным фильтром, заполненную 5 г безводного сульфата натрия или сульфата магния в колбу для отгонки на 100 см³ Фильтр с сульфатом натрия промывают 10 см' экстрагента

8.2.9.4    Получение даиси.тротвооиых НА.

В осушенный экстракт добавляют 2 см³ 3,3 %-ного раствора бромистого водорода в уксусной кислоте, приготовленного по п 8.2.2., перемешивают и оставляют для процесса

8

лептрошрованпя не менее чем на 30 минуг при комнатной температуре. Упаривают хлористый метилен на ротационном испарителе при температуре водяной бани не более 30*С приблизительно до 2 см⁵. Полученный экстракт количественно переносят в фарфоровую чашку, колбу для упаривания омывают 0,5 см⁴ уксусной кислоты и присоединяют к содержимому фарфоровой чашки Экстракт осторожно упаривают на песчаной бане при температуре не более 120°С досуха.

Чашку с сухим остатком охлаждают до комнатой температуры. После охлаждения в фарфоровую чашку пипеткой вместимостью I см’ добавляют 0,6 см' буферного раствора (п. 8.2.3.) и круговыми движениями растворяют сухой остаток. К полученному экстракту при помощи пипетки вместимостью 1 см добавляют 0.8 см¹ раствора даненлхлорида. приготовленного по п. 8.2.1., перемешивают и немедленно переносят смесь в пробирку с притертой пробкой вместимосгью 5 см Плотно закрыгую пробирку помешают в водяную баню с температурой 55°0 не менее чем на 40 мин для прохождения процесса получения дансмл-производных.

Затем пробирку извлекают из водяной бани и охлаждают до комнатной температуры К полученному раствору добавляют 1 см' бензола, интенсивно встряхивают в течении 5 мин и оставляют до момента четкого разделения фаз Из верхнего прозрачного бензольно-анегонового слоя пипегкой вместимоаью 2,0 см' отбирают прозрачный эксгракт и переносят в сухую пробирку вмесгимостью 5 см' с пришлифованной пробкой После этого экстракцию бензолом повторяют еще раз и снова отбирают прозрачный бензольно-ацетоновый экстракт, объединяя его с первой порцией Суммарный объем растворителей из экстракта отдувают в токе азота досуха строго в вытяжном шкафу К полученному сухому остатку добавляют I см' подвижной фазы, плотно закрывают и растворяют сухой остаюк пугем ишенсивного варяхивания.

Вышеизложенным способом гоювит пя1ь серий paci воров в сооэвегС1Вии с заблицей X" 2 в трех повторностях для каждой концентрации.

В таблице 3 приведена концентрация НА, присутствующих в виде лансил-производных, в полученных градуировочных растворах

Полученные растворы даненл-производных ДМ11А, ДЭНА и ДПНА хранятся в холодильнике в зечении 20 дней при темнерагуре 4-5 °С После истечения 20 дней, если растворы имеют отклонения от первоначальных показателей в соогветсгвии с п 8.3.2 и п. 9 1. то они не подлежат дальнейшему использованию и их готовят заново

Таблица 3 - Концентрация НА в градуировочных растворах

№ Концентрация НА, мкг/см* градуиро- вочного раствора ДМНА ДЭНА ДПНА 1 0,05 0,08 2,00 2 0,25 0,38 2,00 3 1,00 1,50 2,00 4 2,00 3,01 2,00 5 3,03 4,56 2,00

Я. 2.9.5 П/нмерка используемых /тактиков па чпспи>ту (холостая п\нюа).

Перед проведением расчетов необходимо провести проверку используемых реактивов на чистоту (проводится для одной пробы) Для этого в колбу для перегонки вмесгимостью 500 см . соединенную с паровиком и прямым холодильником в соогветсгвии с рисунком, приведенным в приложении Д. помещаю! 250 см'

1