ид	ШВШКНМГ.Л* 1		ОКОШАЧКННК ДОКУМКНТЛ МНИ.МН 2642-2015
Д»|» выпуск»			С|ЮК ММ1СНСММЯ			Л ист 2	Лисит 2
ИР11Ч1И1Л			И iMi'Hciiiir облает применения			Код
« 1АДМЕ
VKAIAIIIIK И НИИДИ-ИИИ
итмшм|лкх1к
Р\ КИДАТЬ			Нссм лчжешам
иткшлш:			На 31 аистах
HIM.			ГОДКРЖЛНПЕ IIIMFJIKIIIM
1

ДлцдшАдма

I laiiMCiKMtaiiHC методики и июжить и попой редакции:

«Мсюликп ныполмсния шмерспии содержания стрептомицина it продукции жпношош происхождения с испод 1.иншиием тсст-спсгсм Ridascrecn(S>Slrvp(omyciu и 111»( >Д( К.:К1*И1 1<№С греи i ом ици 11»

Jltici i.i 2-29 lUMcnii гь.

Нм пущены лис гм 30-31.

При отсутствии инкубатора микротитрональные планшеты могут инкубироваться в помещении при выполнении следующих условий:

•    температура окружающей) воздуха должна быть от плюс 20 ^НС до плюс 25 °С;

•    не должно происходить попадание прямых солнечных лучей на планшет;

•    планшет не должен подвергаться воздействию сильных естественных или искусственных потоков воздуха, вызванных, например, принудительной вентиляцией;

•    с целью устранения воздействия холодной поверхности стола, на котором находится планшет, рекомендуется помещать под пего теплоизоляционный материал, например, сложенное в несколько слоев бумажное полотенце.

•    при низкой относительной влажности воздуха и наличии воздушных потоков е целью устранения возможности испарения содержимою лунок рекомендуется покрывать планшет пленкой «парафильм» или заклеивать скотчем.

•    н особых случаях, которые оговорены по тсксгу МВИ, требуется помещать планшет в защищенное от света место, например, в ящик стола.

8    Условия хранения тест-систем

Хранение тест-систем осуществляется в холодильнике при темпера!урс от плюс 2 °С до плюс 8 °С в оригинальных флаконах и упаковке. Не допускается замораживание реагентов с целью увеличения их срока храпения и использование тест-систем или их отдельных компонентов но истечении срока хранения, установленного изготовителем.

Хранение неиспользованных стрипов (лунок) осущесгнляется и холодильнике при температуре от плюс 2 °С до плюс 8 °С в плато закрытом оригиналыюм фильтрованном пакете нмссгс с имеющимся зам осушителем.

Необходимо исключить прямое попадание солнечных лучей на свеючувсшитсльный раствор хромогена.

9    Подготовка к выполнению измерений

9.1    Отбор образцов

Oi6op образцов для анализа проводят по СТБ 1036. Отобранные образны могут храниться в защищенном от света мссас при температуре от плюс 2 °С до плюс 8 °С н течение 2-х дней или в замороженном виде при температуре не выше минус 20 °С в геченне 14 дней. Перед проведением подгаговки проб по II. 9.5 замороженные образцы должны быть разморожены при температуре от плюс 2 °С до плюс 8 °С.

9.2    Подготовка лабораторной посуды

Сильнозагрязпениую лабораторную посуду предварительно обрабатываю! хромовой смссмо. Лабораторную посулу после мойки в растворе специализированного моющего средства промывают водопроводной, ополаскивают дистиллированной водой 2 раза и высушивают.

Запрещается:

•    многократное использование одноразовой

•    использование бытовых моющих средств

I Там

9.3 Приготовление растворов

93.1 Приготовление реактива Карреза 1 с молярной концентрацией

К₄ [f>(CW)₆] 0,36 моль/дм³

В стакан вместимостью 100 см³ вносят навеску 7,6 г калия железистосинсродис’гого 3-водиого, взвешенного с точностью до 0,1 г, затем добавляют 13 см³ - 18 см³ дистиллированной воды. После растворения навески раствор из стакана количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 см³, доводят обзлм до метки дистиллированной водой. 11олу чеппый раегвор хранят при темпе разу ре от плюс 2 °С до плюс 8 °С не более 7 дней.

9.3.2    Приготовление реактива Карреза 11 с молярной концентрацией ZnS()₄

1,04 моль/дм³

В стакан вместимостью 100 см³ вносят навеску 15,0 г цинка сернокислого 7-водного, взвешенную с точностью до 0,1 г, затем добавляют 26 см³ - 36 см³ дистиллированной воды. После растворения навески раствор из стакана количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 см³, доводят объем до mcikm дистиллированной водой. Полу чеш!ый раствор хранят при темперагуре от плюс 2 °С до плюс 8 °С не более 7 дней.

9.3.3    Приготовление фосфатного буфера с тинном

Навески натрия фосфата одноосновного моногидрата массой 0,55 г (или назрия фосфорнокислого однозамещепного 2-водного массой 0,62 г), натрия фосфата лнуосновпого дигидрата массой 2,85 г (или натрия фосфорнокислого дву замещенного 12-водного массой 5,73 г), хлористого натрия массой 9,00 г, взвешенные с точностью до 0,01 г, помещают в стакан вместимостью 150 см³ и добавляют 50 см³ - 70 см³ дистиллированной воды. После растворения солей раствор количеезвенио перенося! н мерную колбу вместимостью 1000 см³, добавляют в колбу такое количество дистиллированной воды, чтобы колба заполнилась примерно до половины своей вместимости, приливают отмеренные пипеткой 1 см³ твина-20, перемешивают до растворения и доводят до метки дистиллированной водой. Раствор хранят при температуре or плюс 2 °С до плюс 8 °С не более одного месяца.

9.3.4    Приготовление 30 % раствора гидроокиси натрия

Навеску гидроокиси натрия массой 15,0 г, взвешенную с точностью до 0,1 г. помещают в коническую колбу вместимостью 250 см³. В колбу приливают 35 см³ дистиллированной воды, отмеренной цилиндром. После растворения гидроокиси натрия раствор охлаждаю i до комнатной температуры (от плюс 20 °С до плюс 25 °С).

После приготовления раствора его переносят в полиэтиленовую или фторопластовую посуду и хранят при комнатной температуре (от плюс 20 °С до плюс 25 °С) не более трех месяцев.

9.3.5 Приготовление раствора метанола (2:8 по объему)

В коническую колбу вместимостью 500 см³.,^|^ДИ'ва1оз _;^0(1см³ дистиллированной воды, отмеренные цилиндром,    .!,озмереннцс

цилиндром 50 см³ метанола и перемешивают. Храйжг puciBepsJm ^.комнатной

а**/    <3*^'    ч'    /

температуре (от плюс 20 °С до плюс 25 °С) в плотно закрытой посуде из темного стекла не более одного месяца в соответствии с установленными правилами хранения метанола и его растворов.

9.4 Подготовка тест-систем

9.4.1 Предварительная подготовка и правила обращения с тест-системами

Тест-систему извлекают из холодильника, не открывая упаковку микротитровального планшета, выдерживают при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 °С от 0,5 до 1 ч, доводят температуру остальных реагентов от плюс 20 °С до плюс 25 °С.

Растворы из тест-системы следует готовить непосредственно перед проведением ИФА. Перед использованием реагенты необходимо аккуратно перемешать круговыми движениями флаконов.

Замена отдельных реагентов на peareirrbi из тест-систем других партий не допускается.

Не допускается использование реагентов, имеющих следующие признаки распада:

•    голубая окраска раствора хромогена до внесения его в лунки;

•    оптическая плотность градуировочного раствора X® 1 с концагтрацией 0,0 мкг/дм³ меньше 0,6.

9.4.2 Подготовка мвкротитровального планшета

Количество лунок микротитровальпого планшета, необходимых для проведения измерений . рассчитывается по формуле

Х„ = 12 + 2Л^,

где f^suf ~ количество образцов;

12 - количество лунок для градуировочных растворов.

Микротитровальный планшет со стрипами, предварительно подготовленными в соответствии с п. 9.4.1, вынимают из упаковки. В микротитровальный планшет помещают необходимое количество стрииов, рассчитанное исходя из требуемого для проведения измерений количества лунок N_w. Оставшиеся стрипы сразу же помещают

в упаковку, закрывают и хранят в соответствии с разделом 8. Размечают положения лунок, предназначенные для градуировочных растворов и растворов проб, согласно рисунку 1.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 А С-1 С-1 п-з П-З П-11 П-11 В С-2 С-2 11-4 11-4 П-12 11-12 — — С С-3 С-3 П-5 П-5 П-13 П-13 ^они. D С-4 С-4 П-4 П-6 П-14 П-14 Ш I.U.7 Н«у koN'v Е С-5 С-5 П-7 П-7 П-15 П-15 ||*Х 1СХМИЧСГ 1Нб<1|1<11 16И ши F С-4 С-6 П-8 П-8 П-16 П-16 У ниудиДП' кМОИ КИИ J П-1 П-1 П-9 П-9 П-17 П-17 <i-' У G П-2 П-2 П-10 П-10 П-18 П-18

Рисунок 1 - Схема расположения лунок для градуировочных J проб

где С-1, С-2,... С-6 - фадуировочпые растворы,

П -1, Я -2,... Я -18 - исследуемые пробы,

1,2,3....12 - номера стрипов в планшете,

А, В,... G - обозначения лунок в стрипах.

При необходимости одновременно использовать более 6-ти стринов рекомендуется выполнять анализ в несколько этапов.

9.4.3 Приготовление моющего буфера

При использовании тест-систем Ridascrcen ® Streptomycin в зависимости от планируемое срока использования моющий буфер готовя! двумя приведенными ниже способами.

•    Способ I.    Содержимое    пакета    для приготовления    моющего буфера

количественно переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см³. Добавляют небольшое количество дистиллированной воды, содержимое колбы перемешивают до полного расгворсния осадка, после чего доводят до метки дистиллированной водой. Полученный раствор хранят при температуре от плюс 2 °С до плюс    8 °С нс более 6    недель в    стеклянной или полиэтиленовой посуде.

•    Способ 2.    Содержимое    пакета    для приготовления    моющего буфера

количесгоешю переносят в    мерную    колбу вместимостью    100 см³. Добавляют

50 60 см³ дистиллированной воды, перемешивают до полнот расгворсния осадка и доводят до метки дистиллированной водой. Полученный концентрированный расгвор (10-кратное концентрирование) хранят при температуре от плюс 20°С до плюс 25 °С не более 12 недель. Для приготовления готового раствора моющего буфера 10 см³ концентрата переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ и доводят до метки дисгиллированной водой.

При использовании тест-сисгсм ПРОДОСК1*ИН®Стрситомиции моющий буфер

тговят следующим образом. Содержимое флакона с концентратом моющего буфера шггенсивно встряхивают в течение (10-20) с, в случае образования крисгаллов -подогревают па водяной бане при температуре 50 °С. Orмеренный мерным цилиндром необходимый объем концентрата наливают в стакан вместимостью 1000 см³, после чет в стакан наливают в 9 раз больший объем дистиллированной воды и перемешивают. Полученный раствор хранят при температуре от плюс 2 °С до плюс 8 °С не более месяца в стеклянной или полиэтиленовой посуде.

9.4.4 Приготовление раствора субсграта/хромогсна (только при использовании тест-систем ПРОДОСКРИНФСтрсптомицин)

Расгвор субсграта/хромогсна готовят непосредсгвенно перед выполнением ИФА из растворов субстрата и хромогена, подготовленных но и. 9.4.1. Посуда, используемая при приготовлении раствора субстрата/хромогена, моется без применения синтетических моющих средств.

В чистый флакон из темной пластмассы вместимостью 20 см³ приливают необходимое количество субстрата, отмеренного дозатором, и добавляют в 20 раз меньшее по объему количество раствора хромогена, интенсивно перемешивают в течение (30-40) с. Приготовленный раствор необходимо предохранять от воздействия

.млирхиц _    !

аими /. /

• /

21

где V_x - объем раствора субсграта/хромогена, приготавливаемою в запас, см³ (нс менее 0,1 см³).

9.4.5 Приготовление рабочего раствора конъюгата

Концентрат конъюгата стрептомицина подготавливают по п. 9.4.1 и перемешиваю! непосредственно перед приготовлением рабочего раствора коиыогага.

В пробирку вместимостью 5 см³ или 10 см³ добавляю! отмеренные дозатором буфер для разбавления концентрата конъюгата, антител и растворов проб объемом V₆, мм³, и аликвоту концентрата конъюгата стрептомицина объемом К_Л, мм³. Содержимое пробирки тщательно перемешивают. Концентрат конъюгата сразу же убирают в холодильник и хранят в соответствии с п. 8.

Требуемый объем концентрата конъюгата и буфере для разбавления рассчитывают по формулам

Y_e=5N_w+0,\A У. = \0У_т

где N_v - количество лунок, используемых в апализе, определяется согласно п. 9.4.2;

А - объем рабочего раствора конъюгата, приготавливаемого в запас, мм³ (не менее 100 мм³).

Примечание: рабочий раствор конъюгат готовится не более чем за 15 мин до выполнения ИФА.

9.4.6 Приютовлснис рабочего раствора антител

Концентрат антител к стрептомицину подготавливают но п. 9.4.1 и перемешивают непосредственно перед приготовлением рабочего раствора антител.

В пробирку вместимостью 5 см³ или 10 см³ добавляют отмеренные дозатором буфер для разбавления копцешрата конъюгата, антител и растворов проб объемом У₆, мм³, и аликвоту концентрата антител к стрептомицину объемом мм³. Содержимое пробирки тщательно перемешивают. Концентрат антител сразу же убирают в холодильник и хранят в соответствии с п. 8.

Требуемый объем концентрата антител и буфера для разбанления рассчитывают по формулам (3).

Примечание: рабочий раствор антител готовится не более чем за 15 мин до выполнения ИФА.

$У Ч-А

th д о научив-    - '

TCXI'M'WC |И|фО,»!*».ЦИН

(.•кужеитаг.им

9.5.1    Подготовка проб молока, мороженого, восстановленных сухих молочных

смесей для детского питания

9.5.1.1    Предварительная подготовка образцов

Для подготовки проб используют образец, отобранный в соответствии с п. 9.1. Доводят температуру образца от плюс 20 °С до плюс 25 °С, выдерживая его при комнатной температуре.

Образец сырого, пастеризованного, стерилизованного молока перемешивают путем вефмхивания и переворачивания представленной упаковки. Сухое молоко гшагельно перемешивают и восстанавливают в соответствии с п.9.5.1.2. Из образца мороженою удаляют немолочные компоненты и тщательно перемешивают.

9.5.1.2    Восстановление сухого молока, сухих молочных смесей для детского питания

В стаканы вместимостью 100 см³ или 150 см³ помещают 2 параллельные навески образца сухого молока, подготовленного но п. 9.5.1.1, взвешенные с погрешностью не более 0,1 г. Массы навесок в зависимости от содержания жира составляют:

•    9,0    г    сухого    обезжиренного молока;

•    12,0 г сухою молока с содержанием жира 20 %;

•    12,5 г сухого молока с содержанием жира 25 %;

•    10,0    г    сухого    молока    с    содержанием    жира,    отличным    от    перечисленного

выше.

Затем в стаканы с навесками порциями по 5-10 см³ приливают дистиллированную, воду, перемешивая содержимое стеклянной палочкой до полного растворения образца. После растворения сухого молока растворы из стаканов количественно переносят в мерные колбы вместимостью 100 см³, доводят до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают.

Восстановление проб сухих молочных смесей для детского питания производят по приведенной выше схеме, используя отношение массы смеси к объему волы, указанное в инструкции производителя.

Далее пробы подвергают процедуре обезжиривания, описанной в п. 9.5.1.3.

9.5.1.3 Получение проб обезжиренного молока, восстановленных сухих молочных смесей для детского питания, мороженого

От образцов молока, восстановленных сухих молочных смесей для детского питания или мороженого, подготовленных по п. 9.5.1.1, п. 9.5.1.2,с помощью дозатора отбирают но две параллельные пробы объемом 10 см³ и помещают в пробирки для центрифугирования вместимостью 15 см³. Центрифугируют пробы в следующем режиме: 15 °С, 3000 g, 10 мин.

При отсутствии центрифуги с охлаждением огобрашплй для анализа объем молока перед центрифугированием выдерживают в морозильной камере холодильника в течение 10-15 мин, охлаждая пробы молока до температуры от^умо&®С до плюс 10 °С, контролируя температуру термометром.

жировой¹', слой,

с< паи    \

И|И«

wpa не

производят.

9.5.1.4 Получение растворов проб молока, восстановленных сухих молочных смесей для детского питания, морожепого

Из каждой пробы, подготовленной по и. 9.5.1.3, отбирают дозатором аликвоты объемом по 50 мм³ и помещают их в стеклянные пробирки вместимостью 5 см³ или 10 см³ или микроцентрифужные пробирки, предварительно очистив наконечник дозатора фильтровальной бумагой от следов жира. В каждую пробирку добавляют отмеренные дозатором 950 мм³ буфера для разбавления образцов. Содержимое пробирок тщательно перемешивают на вортексс в течение 1 мин.

Полученные растворы проб используются для проведения ИФА. Допускается хранение подготовленных проб при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 *С не более одною часа.

Перед отбором аликвот для проведения ИФЛ растворы перемешивают.

9.5.2 Подготовка проб мяса (кроме мяса кролика), сыра

9.5.2.1    Получение экстракта проб мяса, сыра

Доводят температуру образца, отобранного в соответствии с п. 9.1, от плюс 20 °С до плюс 25 °С, выдерживая его при комнатной температуре. Образцы мяса гомогенизируют с помощью гомогенизатора или блепдера. При подготовке проб сыра отделяют тесто от корки, полимерно-парафинового или воскового сплава, измельчают тесто с помощью терки и перемешивают.

От гомогенизированного образца отбирают две параллельные навески массой

5,00 г, ВЗВСШС1П1ЫС с точностью до 0,01г. Навески помещают в пробирки для центрифугирования вместимостью 50 см³ и в каждую пробирку добавляют отмеренные пинеткой или дозатором 20 см³ фосфатного буфера с твином, приготовленного по н. 9.3.3. Содержимое пробирок интенсивно перемешивают на шейкере 30 мин, после чего центрифугируют при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 °С, 4000 g, в течение 10 мин.

9.5.2.2    Обезжириваете экстракта проб мяса с высоким содержанием жира и сыра

Отбирают дозатором по 5 см³ палосадочной жидкости, полученной по п. 9.5.2.1, и переносят в пробирки для центрифугирования вместимостью 15 см³, содержащие 3 см⁵ н-гексала, отмеренного пинеткой или дозатором. Пробирки интенсивно встряхивают в течение 5 мин, после чего центрифугируют при температуре от плюс 20 °С до шпос 25 °С, 4000 g, в течение 10 мин. После центрифугирования из пробирок полностью удаляют пипеткой Пастера или дозатором верхний органический слой.

9.5.2.3    Получение растворов проб мяса, сыра

Отбирают дозатором аликвоты экстрактов, полученных по п. 9.5.2.1 или п. 9.5.2.2, объемом по 50 мм³ и помещают их в стеклянные пробирки вместимостью 5 см³ или 10 см³ или микроцентрифужные пробирки. В каждую пробирку добавляют

одного часа.

Перед отбором аликвот для проведения ИФА растворы перемешивают.

9.S.3 Подготовка проб печени, мяса кролика

9.5.3.1 Получение экстракта проб печени, мяса кролика

Доводят температуру образца, отобранного в соответствии с н. 9.1, от плюс 20 °С до плюс 25 °С, выдерживая его при комнатной температуре. Образцы гомшеиизируют с помощью гомогенизатора или блендера.

От гомогенизированного образца отбирают две параллельные навески массой

5,00 г, взвешенные с точностью до 0,01г. Навески помещаю! в пробирки для центрифугирования вместимостью 50 см³ и в каждую пробирку добавляют отмеренные пипеткой или дозатором 20 см³ фосфатного буфера с твииом, приготовленного по и. 9.3.3. Содержимое пробирок интенсивно перемешивают на шейкере 30 мин, после чего цс»пгрифугируют при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 °С, 4000 g, в течение 10 мин.

9.53.2 Осаждение белков при помощи реактивов Карреза

Опирают дозатором по 4 см³ надосадочной жидкости, полученной но п. 9.5.3.1, и переносят в пробирки для центрифугирования вместимостью 15 см³. В пробирки добавляют отобранные дозатором по 100мм³ реактива Карреза!, 100мм¹ реактива Карреза II, приготовленных но пп. 9.3.1,9.3.2, и 800 мм³ дистиллированной воды, после чего встряхивают пробирки в течение 10 с. Пробирки центрифушруют при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 °С, 4000 g, в течение 10 мин.

9.5.3.3 Обезжиривание экстраста проб печени, мяса кролика

Огбирают дозатором по 2 см³ надосадочной жидкости, полученной по п. 9.5.3.2, и переносят в пробирки для центрифугирования вместимостью 15 см³, содержащие 3 сhr н-гсксана, отмеренного пипеткой или дозатором. Пробирки шггенсивно встряхивают в течение 5 мин, после чего центрифугируют при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 °С, 4000 g, в течение 10 мин. После центрифугирования из пробирок полностью удаляюз пипеткой Пастера или дозатором верхний органический слой.

9.53.4    Получение растворов проб печени, мяса кролика

Избирают дозатором аликвоты водного раствора, полученного по u. 9.5.3.3, объемом по 100 мм³ и помешают их в стеклянные пробирки вместимостью 5 см³ или 10 см³ или микроцентрифужшле пробирки. В каждую пробирку добавляют отмеренные дозатором 700 мм³ буфера для разбавления образцов или фосфатного буфера с твином, приготовленного по п. 9.3.3. Содержимое пробирок тщательно перемешивают на вортсксе в течение 1 мин.

Полученные расгворы проб используются для проведения ИФА. Допускается хранение подготовленных проб при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 °С не более одного часа.

Перед отбором аликвот для проведения ИФА растворы гюремешшй^л^-^

9.5.4    Подготовка проб творога, кисломолочных продуктов

9.5.4.1 Получение экстрактов проб творога, кисломолоч

Доводят температуру образца, отобранного в о

20 °С до плюс 25 °С, выдерживая его при комнатной температуре. При наличии в образцах кисломолочных продуктов частиц твердой консистенции их отбрасывают. Образцы творога гомогенизируют с помощью гомогенизатора или блендера, другие образцы кисломолочной продукции тщательно перемешивают.

От гомогенизированного образца отбирают две параллельные навески массой

5,00 г, взвешенные с точностью до 0,01 г. Навески помещают в пробирки для центрифугирования вместимостью 15 см³ и выдерживают на водяной бане при температуре (50 ± 5) °С. Содержимое пробирок интенсивно перемешивают на вортексе, после чего центрифугируют в следующем режиме: 10 °С, 4000 g, в течение 10 мин.

9.S.4.2 Получение растворов проб творога, кисломолочных продуктов

Отбирают дозатором по 50 мм³ надосадочной жидкости, полученной по п. 9.5.4.1, и переносят в стеклянные пробирки вместимостью 5 см³ или 10 см³ или микроцентрифужные пробирки. В каждую пробирку добавляет отмеренные дозатором 950 мм³ буфера для разбавления образцов. Содержимое пробирок тщательно перемешивают на вортексе в течение 1 мин.

Полученные растворы проб используются для проведения ИФЛ. Допускается хранение подготовленных проб при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 °С нс более одного часа.

Перед отбором аликвот для проведения ИФЛ растворы перемешивают.

9.5.5 Подготовка проб молочной сыворотки, восстановленной сухой молочной сыворотки

9.5.5.1 Восстановление сухой молочной сыворотки

Для подготовки проб используют образец, отобранный в соответствии с и. 9.1. Доводят температуру образца от плюс 20 °С до плюс 25 °С, выдерживая его при комнатной температуре.

В стаканы вместимостью 100 см³ или 150 см³ помещают 2 параллельные навески образца массой 12,5 г, взвешенные с точностью до 0,1 г.

Затем приливают небольшими порциями по 10-20 см³ дистиллированную воду, кагряую до температуры (40 ± 5) °С, перемешивая содержимое стеклянной палочкой до полного растворения образца. После растворения навески растворы из стаканов количествсшю перенося! в мерные колбы вместимостью 100 см³, доводят до метки дистиллированном водой, тщательно перемешивают и выдерживают 15 мии при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 °С.

9.5.5.2 Предварительная подготовка проб молочпой сыво восстановленной сухой молочной сыворотки

Для получения растворов проб используют образец молоч' отобранный в соответствии с п. 9.1, температуру которого доводят плюс 25 °С, выдерживая при комнатной температуре, или проб молочной сыворотки, приготовленных по п. 9.5.5.1.

В стаканы вместимостью 150 см³ наливают по 70 - 90 см³ ni как описано выше, и доводят их pH до 7,0, добавляя по

i идроокиси натрия, приготовленный по п. 9.3.4.

9.5.53 Получение экстрактов проб молочной сыворотки и восстановленной сухой молочной сыворотки

Получение экстрактов проб молочной сыворотки и восстановленной сухой молочной сыворотки проводят в соответствии с и. 9.5.4.1, используя при этом предварительно подготовленные пробы по п. 9.5.5.2.

9.S.5.4 Получение растворов проб молочной сыворотки и восстановленной сухой молочной сыворотки

Получение растворов проб молочной сыворотки и восстановленной сухой молочной сыворотки проводят в соответствии с п. 9.5.4.2, используя при этом экстракты проб, приготовленные по п. 9.5.5.3.

9.5.6 Подготовка проб сгушенпого молока

9.5.6.1    Получепне восстановленного сгущенного молока

Доводят темперазуру образца, отобранного в соответствии с п. 9.1, от плюс 20 °С до плюс 25 ^вС, выдерживая его при комнатой температуре и тщательно перемешивают.

В стаканы вместимостью 100 см³ или 150 см³ помещают 2 параллельные навески образца массой 25,0 г, взвешенные с точностью до 0,1 г.

Затем в стаканы с навесками порциями по 5-10 см³ приливают дистиллированную воду, нагретую до температуры (30 ± 2) °С, перемешивая содержимое стеклянной палочкой до полного растворения образца. 11осле растворения образца содержимое стаканов количественно переносят в мерные колбы вместимостью 100 см³, доводят до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают.

Далее пробы восстановленного сгущенного молока подвергают процедуре обезжиривания по и. 9.5.6.2, для проб восстановлешюго обезжиренного сгущенного молока эту процедуру не производят.

9.5.6.2    Получение обезжиренного восстановленного сгущенного молока Получение проб обезжиренного восстановленного сгущенного молока проводя!

в соответствии с п. 9.5.1.3, используя при этом пробы восстановленного сгущенного молока, приготовленные по п. 9.5.6.1.

9.5.63 Получение растворов проб сгущенного молока

Получение растворов проб сгущенного молока проводят в соответствии с п. 9.5.1.4, используя при этом пробы обезжиренного восстановленного сгущенного молока, приготовленные по п. 9.S.6.2 или восстановленного обезжиренного сгущенного молока, приготовленные по п. 9.5.6.1.    ~~^v-

9.5.7 Подготовка проб масла

9.5.7.1 Получение экстрактов проб масла

Образец масла, отобранный в соответствии температуры пе выше минус 10 °С, измельчают с поме

СОДЕРЖА! 1ИЕ

1    Область применении.......................................................................................3

2    Точность измерений........................................................................................3

3    Средства измерений, испытательное и вспомогательное оборудование,

материалы, реактивы...............................................................................................5

3.1    Средства измерений, испытательное н вспомогательное оборудование,

материалы..................................................................................................................5

3.2    Реактивы...........................................................................................................7

4    Метод измерений.............................................................................................Я

5    Требования безопасности и требовании к квалификации операторов........9

5.1    Общие требования безопасноеги.......................................................................9

5.2    I реновация безопасности при работе с метанолом...........................................9

5.3    Требования к квалификации онсразорон...........................................................9

6    Условия выполнения измерений....................................................................9

7    Условии инкубации микротигровальных планшетов в помещении..........10

Я    Условия хранения тест-сист ем.....................................................................10

9    Подготовка к выполнению измерений.........................................................10

9.1    Отбор образцов...............................................................................................10

9.2    Подготовка лабораторной посулы...................................................................К)

9.3    I (рнготонление растворов...............................................................................11

9.4    11олготовка тсст-сисзсм..................................................................................12

9.5    11одготовка проб.............................................................................................15

10    Выполнение измерений....................... 20

11    Обработка результатов измерения...............................................................21

11.1    Расчет массовой концентрации.......................................................................21

12    Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в >с.юанях

повторяемое ill........................................................................................................23

13    Оформление резулыатов измерений...........................................................23

13.1    Форма представления результатов измерения с использованием расширенной

неопределенности.....................................................................................................23

13.2    Форма представления результатов в виде одноезоронней оценки массовой

KOIIHCIIIрации стрептомицина с использованием предела измерения.......................24

13.3    Форма представления результатов в виде односторонней опенки массовой

концентрации стрептомицина с использованием значения нер.чней фамицы диапазона измерений................................................................................................24

14    Коигроль томности результатов измерений................................................24

14.1    Оперативный контроль резулмазон, полученных в условиях повторяемости. 25

14.2    Проверка приемлемости результатов измерений, полученных н условиях

промежуточной прецизионности..............................................................................25

14.3    Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях

воспроизводимое! и..................................................................................................25

14.4    Контроль правильноеIи..................................................................................26

14.5    Кон фоль с табильное hi результатов измерений с применением кош рольных

карт Шухарта (КК)...................................................................................................27

15    Нормативные ссылки....................................................................................30

Библиография.........................................................................................................31

I Зам.

Доводят температуру образца масла от плюс 20 °С до плюс 25 °С, выдерживая его при комнатной температуре.

От образца масла отбирают две параллельные навески массой 1,00 г, взвешенные с точностью до 0,01 г, и помещают их в пробирки дня центрифугирования вместимостью 15 см³. Выдерживают пробирки на водяной бане при температуре (40 ± 5) °С до полного расплавления навески масла.

Сразу же после расплавления масла в пробирки с пробами добавляют 1 см³ гексана, отмеренного дозатором, и интенсивно перемешивают на вортексе в течение 1 мин. Добавляют в пробирки отмеренный дозатором 1 см³ раствора метанола (2:8 по объему), ириютовленного по п. 9.3.5. Содержимое пробирок интенсивно перемешивают на вортексе в течение 10 с, после чего продолжают перемешивание при переворачивании на ротаторе в течение 10 мин.

Центрифугируют пробирки при 4 °С, 2000 g, в течение 10 мин. Осторожно удаляют верхний гексановый слой с помощью пипетки Пастера.

В пробирки с пробами снова добавляют 1 см³ гексана, отмеренного дозатором, и интенсивно перемешивают на вортексе в течение 1 мин. Повторяют центрифугирование при 4 °С, 2000 g, в течение 10 мин, после чего осторожно удаляют верхний гексановый слой пинеткой Пастера.

1 см³ водного слоя переносят дозатором в пробирки для центрифугирования вместимостью 1,5 см³ или 2 см³. Пробирки помещают на лед и выдерживают в течение 15 мин. После этого проводят цеигрифугирование при температуре от 20 °С до 25 °С, 20000 g, в течение 10 мин. При отсутствии центрифуги, обеспечивающей вышеуказанный режим, вместо центрифугирования проводят фильтрование через шприц-фильтр.

9.5.7.2 Получение растворов проб масла

Отбирают дозатором 50 мм³ водной фазы по п. 9.5.7.1 и переносят в стеклянные пробирки вместимостью 5 см³ или 10 см³ или микроцентрифужные пробирки. Затем в пробирку дозатором добавляют 800 мм³ буфера для разбавления растворов образцов, и тщательно перемешивают содержимое пробирок на вортексе.

Полученные растворы проб используются для проведения ИФА. Допускается храпение подготовленных растворов проб при температуре от плюс 20 °С до плюс 25 °С в течение одного часа.

10 Выполнение измерений

Для проведения измерений используют пробы, подготовленные в соответствии с п. 9.5. Компоненты тест-систем подготавливают в соответствии с п. 9.4.

10.1    В лунки микротитровального планшета, размеченного согласно п. 9.4.2, вносят

отобранные дозатором но две аликвоты объемом 50 мм³ каждого |радуировочного раствора. Каждую аликвоту вносят в отдельную лунку, внесение производится в порядке возрастания концентраций градуировочных растворов (т.с.    ,

13,5, 40,5 мкг/дм³).    «>-«?

10.2    В соответствующие лунки микротитровального планшета    иные

дозатором аликвоты объемом 50 мм³ двух параллельных проб ]

103 В каждую лунку микротитровального планшета вносят от 50 мм³ рабочего pact вора кошлогата, приготовленного по п. 9.4Й

1    Область применения

Частящая методика распространяется на сырое. пасгсри'кжаннос. стерилизованное. сухое восстановленное и сгущенное молоко, восстановленные сухие молочные смеси для детского питания, молочную сыворотку, восстановленную сухую молочную сыворотку, творог, коктейли молочные, кисломолочные продукты (йогурт, сметана, кефир, пахта и г.п.), сыр (мягкий, полутвердый, твердый, сверхтвердый), масло сливочное, мороженое на молочной основе, мясо (мышцы), печень и устанавливает метол конкурентного иммунофермен i ного а налита (ИФА) для определения содержания стрептомицина.

Методика преднатначена для проведения измерений массовой копает ранни стрептомицина с использованием гсет-сиетем Kidascreen ® Streptomycin производства R-Hiophunn АС*. Германия, или тест-систем И 1Ч)Д(КЖ РИН* Стрептомицин, проитводсгва Инсиггута биоортничсской химии ИАН Беларуси.

Диаиатоп итмерений методики составляет:

• ;1ля молока сырот. пастеризованного. стерилизованного, молока сухого восстановленного, носетиновлснных сухих молочных смесей для детского шггапия. молочной сыворотки, восстановленной сухой мешочной сыворотки, творога, коктейлей молочных, кисломолочных продуктов, мороженой) на молочной основе - от 10 мкг/кг до 810 мкг/кг.

•    ;шя сгущенного молока - от 40 мкг/кг до 3240 мкг/кг:

•    для масла сливочного -от 10 мкг/кг до 1013 мкг/кг':

•    для мяса, печени, сыра - от 25 мкг/кг до 2025 mki/кг.

Предел измерения ,ши данной методики составляет:

• для молока сырого, пастеризованного, стерилизованного, молока сухого восстановленного. носсгановлснных сухих молочных смесей для детского питания, молочной сыворотки, восстановленной сухой маточной сыворотки, творога, кокгейлей молочных, кисломолочных продукта мороженого на молочной основе - 10 мкг/кг:

•    для сгущенного молока - 40 мкг/кг:

•    для масла сливочного - 10 мкг/кг;

•    для мяса, печени, сыра - 25 мкг/кг.

11летящая методика разработка в соответствии с требованиями ГОСТ 8.010.

2    Точность измерений

Настоящая методика обеспечивает измерение массовой KOiiuciirpaiiiin стрсмгомицина в соответствии с областью применения и в диапазоне, приведенными н и. I. с показателями точности согласно таблице I.

¹ Предел тмсрспнй и 1'рашты лиана юна щмерсниП .vie мосла c.hibomiioi о завися но тсксгу укатаны минимальное значение предела измерения н максим ■шипаюна измерения

Таблица 1 - Относительные значении показателей повторяемое! и промежуточной прецизионности

Виды продукции Диапазон измерений, мкгЛег Относительное стандартное отклонение повторяемое™ <т,. % Относительное стандарт ное отклонение промежуточной прецизионности <т(|й1|. % Молоко сырое, пастеризованное, стерилизованное, молоко сухое восстановлен вое. восстановленные сухие молочные смеси для детскою питания, мороженое на молочной основе от 10 до 810 включ. 3.9 6.0 Стушенное молоко от 40 до 3240 включ. 5*2 8.1 .Молочная сыворотки, восстановленная, коктейли молочные, сухая молочная сыворотка, творог, кисломолочные продукты от 10 до 810 включ. 5,8 7.9 Масло сливочное от 10 до 101.3 включ. 6.3 8.2 Мясо (кроме мяса кролика), сыр от 25 до 2025 включ. 5.0 7.1 1 (очень, мясо кролика от 25 до 2025 включ. 4.5 7.4

Для всех видов продукции в диапазоне измерений методики смещение методики незначимо.

Значения оценок относительной суммарной стандартной неопределенности и относительной расширенной неопределенности приведены в таблице 2.

I Зам.

Германия.

Термометр лабораторный частичного пофужения класса точности I с ценой деления 1 “С по ГОСТ 28498.

pi 1-метр с диапазоном измерений от 0 pH до 14 pH и погрешностью *0.1 pH в комплекте с электродами.

Центрифуга лабораторная, обеспечивающая относительное центробежное ускорение нс менее 4000 g (пробирки вместимостью 15 ем*. 50 см’) и не менее 20000 g (пробирки вместимостью 1.5 ем’ или 2 см'), а также охлаждение до плюс 4 °С.

Холодильник бытовой, позволяющий поддерживать температуру m плюс 2 °С до плюс 8 °С в холодильной камере и не выше минус 20 °С в морозильной камере.

Лабораторный портскс. обеспечивающий скорость вращения нс менее 1800 об/мин.

Лабораторный шейкер, обеспечивающий скорость до 200 об/\ши.

Ваня водяная, обеспечивающая поддержание температуры (40т. 5)^ИС. (50 ± 5)°С.

Гомогенизатор лабораторный или бытовой блендер.

Дозаторы нинсточныс с комплектом одноразовых наконечников:

•    с диапазоном объемов дозирования от 20 мм³ до 200 мм³ и относительным отклонением фактического объема дозы от номинального ± 3,0 %;

•    с диапазоном объемов дозирования от 100 мм³ до 1000 мм’ и относительным отклонением фактического объема дозы от номинального ± 1,5 %;

•    с диапазоном объемов дозирования от 1см’до 5 ем*' и относительным отклонением фактического объема дозы от номинального ± 1.5 %;

•    с диапазоном объемов дозирования от 2 см’до 10см’ и относительным отклонением фактического объема лозы от номинального ± 1.0 %:

•    многоканальный с диапазоном объемов дозирования от 50 мм³ до 350 мм' и относительным отклонением фактического объема дозы от номинального * 4.6 %.

Пленка «парафильм» или скотч.

Бумага фильтровальная но ГОС Т 12026.

Шпатели пластиковые.

Штатив для пробирок.

Пинетки Пастера.

Палочки стеклянные оплавленные.

11робирки мик(кщснтрифужныс с крышкой (типа Эплеидорф) из полипропилена вместимостью 1.5 см или 2 см .

Пробирки полипропиленовые для центрифугирования вместимостмо 15 см'. 50 см³.

Пробирки стеклянные вместимостью 5 см³ или 10 см³ по ГОСГ 1770.

Колбы мерные вместимостью 100 см³, 1000 см³ типа 2 100-2. 2-1000-2 но ГОСТ 1770.

Колбы конические вместимостью 100 см³. 250 см³, 500 см³ типа Кн-1-100-29/32 ТС. Кн-1-250-29/32 ТС. Ки-1 -500-29/32 ТС но ГОСТ 25336.

Шприц-фильтр или шприц и фильтрующая насадка на шприц диамсгром 15 мм и диаметром пор 0.45 мкм на основе целлюлозы.

Использование следующего оборудования не является обязательным, но рекомендуется для увеличения производи! ел ыюсти и повышения точности измерений:

•    инкубатор для микротигровальных планшетов. обеспечивающий поддержание температуры oi шнек 20 °С до плюс 25 °С е точностью не более ± I °С:

•    устройство отмывки иммунологических планшетов автоматическое е диапазоном объемов моющего раствора, заливаемого в каждую микрокювезу oi 100 мм' до 350 мм'.

3.2 Реактивы

Метанол ч.д.а по ГОСТ 6995.

п-Гексан ч. но [ 4 ].

Вода дистиллированная но ГОСТ 6709.

Лабораторный jicrcprcirr. например Triton Х-100.

Гвнн-20, каталожный номер SIGMA PI379. степень чистоты в пересчете на лауршювую кислоту не менее 40 %.

Стрептомицина сульфате массовой долей основного вещее!ва не менее 90 %.

Натрия фосфат двуосновной дигидрат (NaiHPO^HjO), каталожный номер Пика 71645 или натрий фосфорнокислый двузамещеппый, 12-волный (Na2llP0₄-I2II;O) ч.д.а по ГОСТ 4172.

Иагрия фосфат одноосновной моногидрат (NaH₂P0.rH»O). каталожный номер Signia-Aldrich 71504 или натрий фосфорнокислый однозамешенный. 2-ноднмй (Nall₂P0₄-2II₂O) ч.д.а тю ГОСТ 245.

1 Катрин хлористый ч.д.а. по ГОСТ 4233.

Цинк сернокислый семиводный х.ч. по ГОСТ 4174.

Калий железистосинеродистый 3-водный ч.д.а. по ГОСТ 4207.

Натрия гидроокись х.ч. но ГОСТ 4328.

Тест-системы Ridascrecn ^гк> Streptomycin (артикульный № КЗ 103) произволе!ва фирмы R-Biophann AG. Германия или тест-системы 11РОДОСКРИ11^Стрептомицин, производства Института биоорганичсской химии НАН Беларуси, apt. № 148 но ( 3 | набор реактивов и мнкротмтрональный планшег. необходимые для выполнения измерений но определению содержания стрептомицина методом иммуноферментно! о анализа в cociase (таблицы 3. 4 ).

Компонент набора	Количество в комплекте
Микрогигровальный планшет (12 стринов по Я лунок, покрытых антителами захвата)	1 IIIT
1 'ралу ироничные растворы стрептомицина с концентрацией 0.0 мкг/дм3,0,5 мкг /дм3, 1,5 мкг /дм3.4.5 мкг /дм3. 13.5 мкг/дм3. 40,5 мкг/дм3	6 игг. * 1.3 см3
Концентрат кошлогата стрептомицина с пероксидазой	1 шт. х 0.7 см3
Концешрат антител к стрептомицину	1 шт. х 0.7 см'
Субстрат/хромогсн. раствор, окрашенный в красный цвет, содержит гетрамегилбензилип	1 шт. х 10 см3
Сгон-реагент, содержит 1 и серную кислоту	1 птт. х 14 см3
Буфер, готовый к применению, используется для разбавления концентратов коныогата. антител и растворов проб	1 ШТ. X 100 см3
Моющий буфер, соль для нриштовления 10 мМ фосфатного буфера (pi 1 7,4). содержит 0.05 % твина-20	1 уи.

Таблица 4 - Состав гсст-системы ПРОДОСКРИНФСтрентомицин

Компонент набора Количество 1 в комплекте Ммкротитровальиый планшет (12 стрннон по Я лупок, покрытых антителами) 1 шт Градуировочные растворы стрептомицина с концентрацией 0.0 мкг/дм3,0,5 мкг/дм3. 1.5 мкг/дм3,4.5 мкг/дм3. 13,5 мкг/дм3. 40.5 мкг/дм3 6 шт. х 1,3 ем3 Концентрат конъюгата стрептомицина с пероксидазой 1 шт. х 0.7 см‘ Концентрат антител к стрептомицину 1 шт. х ().7 см’ Субстрат 1 ЦП. х 14 см3 Хромоген, раствор 3,3\5,5*-тлримстнлбснзилина (1МБ) 1 шт. х 0,7 см3 Стон-реагент, содержит 1 и серную кислоту 1 шт. х 14 см’ Буфер, ютовый к применению, используется для разбавления концентратов конъюгата, антител и растворов проб 1 шт. х 100 см3 Моющий буфер. 10-кратный концентрат 1 IIIT. X 100 см3

4 Метол измерений

Используемый метод основан на взаимодействии антиг| антителами. В лунки микротитровального нланшега. покр; (антивидовыми антителами), добавляются градуировочный или растворы проб вместе с коныогатом стрептомицина

I Зам.

стрептомицину. Стрептомицин, присутствующий в градуировочных растворах или пробах, и стрептомицин, коньки ированимй с ферментом, конкурируют- та центры связывания антител к сгрентомииину. Одновременно антитела к стрептомицину |акже связываются с антителами захвата на стенках лунки. Несвязанный коньки от фермента удаляется на стадии промывки. Мосле добавления раствора(ов) субсграта/хромогена связанный коныогат фермента прекращает xpoMomi в голубой продукт. Реакция окрашивания останавливается после добавления стон-реагента, который меняем цвет раствора на желтый.

Измеренная при 450 им оптическая нлотнос1Ь обратно пропорциональна массовой концентрации стрептомицина в растворе. Массовая копией фация стрептомицина в пробе определяется но градуировочной зависимости, ноет роенной по Ь градуировочным растворам.

5 Требования безопасности и требования к квалификации операторов

5.1    Общие требования безопасности

11ри выполнении работ по определению массовой концентрации стрептомицина обслуживающий персонал должен знать и строго соблюдать на рабочем месте гребования:

•    злсктробезопаспости по ГОСТ 12.2.003;

•    пожарной безопасности но ГОС Т 12.1.004;

•    техники бсзоиасности при работе в химической лаборатории в соответствии с инструкциями, угвержденными в установленном порядке;

•    техники безопасности, изложенные в инструкции но зкенлуатацпи средств измерений и оборудования, применяемых при проведении измерений.

5.2    Требования безопасности при работе с метанолом

1 (сражал, работающий с метанолом и его растворами, должен знать и строго соблюдать на рабочем месте требования инструкции но технике безопасности нри работе с мсганолом, утвержденной в установленном порядке.

Все работы с мсганолом и его расгнорами должны проводиться строго в вытяжном шкафу с использованием средств индивидуальной защиты (фартуки, перчатки, очки). Запрещается работать с мсганолом при выключенной приточно-вытяжной вентиляции и без применения средств индивидуальной защиты.

5.3    Требования к квалификации операторов

К проведению работ но данной методике допускаются липа, имеющие высшее специальное или среднее специальное образование по профилю выполняемых работ, прошедшие обучение приемам работы на оборудовании, освоившие выполнение всех операций, предусмотренных методикой, владеющие техникой'.~ "Постановки иммуноферментиого анализа.    ⁴

6 Условие выполнения измерений

у*    %‘Й^,Г    '    ф

При выполнении измерений в лаборатории должны быть соблюдены следующие

температура окружающего воздуха от плюс 20 °С до илю относительная влажность воздуха не более 80 % нри темп