«УТВЕРЖДАЮ» Директор ООО «ЛЮМЭКС»

МЕТОДИКА ВЫПОЛНЕНИЯ ИЗМЕРЕНИЙ МАССОВЫХ ДОЛЕЙ ВИТАМИНОВ А (В ФОРМЕ РЕТИНОЛАЦЕТАТА), Е (В ФОРМЕ а-ТОКОФЕРОЛАЦЕТАТА) И D (В ФОРМЕ ХОЛЕКАЛЬЦИФЕРОЛА) В ПРЕМИКСАХ И ВИТАМИННЫХ КОНЦЕНТРАТАХ МЕТОДОМ ОБРАЩЕННОФАЗОВОЙ ВЭЖХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЖИДКОСТНОГО ХРОМАТОГРАФА «ЛЮМАХРОМ»

Методика М 04-44-2006

Санкт-Петербург

2006

Информационные данные:

Методика разработана ООО -Люмэкс-Введена впервые

Аттестована Уральским НИИ Метрологии, свидетельство Ns 223.1.16.07.441/2006 от 15.12.2006

© ООО -Люмэкс*, 2006

Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать допустимых значений по ГОСТ 12.1.005-88. Организация обучения работников безопасности труда по ГОСТ 12.0.004-90.

6    ТРЕБОВАНИЯ К КВАЛИФИКАЦИИ ОПЕРАТОРА

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают специалиста, имеющего высшее или среднее специальное химическое образование или опыт работы в химической лаборатории, прошедшего соответствующий инструктаж, освоившего метод в процессе тренировки и уложившегося в нормативы при выполнении процедур контроля точности.

7    УСЛОВИЯ ВЫПОЛНЕНИЯ ИЗМЕРЕНИЙ

При выполнении измерений в лаборатории должны быть соблюдены следующие условия:

•    температура воздуха    20±5°С;

•    атмосферное давление 84,0-106.7 кПа (630-800мм рт. ст ),

•    влажность воздуха    не более 80% при 25°С;

•    напряжение в сети    220±22 В;

•    частота переменного тока    50±1 Гц.

8    ПОДГОТОВКА К ВЫПОЛНЕНИЮ ИЗМЕРЕНИЙ

Перед выполнением измерений должны быть проведены следующие работы: отбор проб, подготовка стеклянной посуды, приготовление растворов, проверка и градуировка хроматографической системы, подготовка пробы к анализу.

8.1 Отбор проб

Отбор и подготовка лабораторной пробы производится в соответствии с нормативно-технической документацией на данный вид продукта (сырья)

9

8.2    Подготовка стеклянной посуды

Посуду для приготовления и хранения элюента моют только серной кислотой (без применения других моющих средств), ополаскивают дистиллированной водой и высушивают.

Остальную стеклянную посуду моют горячей водой с моющим средством, тщательно ополаскивают дистиллированной водой и сушат при температуре 105°С.

8.3    Условия проведения хроматографического анализа

Подготовку жидкостного хроматографа к работе проводят в соответствии с Руководством по эксплуатации хроматографа и его блоков.

Условия проведения хроматографического анализа следующие:

•    колонка для 8ЭЖХ указанной эффективности внутренним диаметром 2 мм, заполненная обращенно-фазовым сорбентом (Кромасил С18, зернением 5 мкм);

•    предколонка внутренним диаметром 2 мм, заполненная аналогичным обращенно-фазовым сорбентом;

•    подвижная фаза - смесь ацетонитрил - изолропанол (90:10) для витаминных концентратов или

ацетонитрил - изопропанол - вода (96:2:2) для премиксов или ацетонитрил - изопропанол - вода (85:9:6) для сложных премиксов;

•    объем петли крана-дозатора 10 мм³;

•    объемная скорость подвижной фазы - 200 мм³/мин.

8.4    Краткий алгоритм проведения хроматографических

измерений

При подготовке и проведении измерений необходимо:

•    проверить правильность сборки хроматографической системы в соответствии с руководством по эксплуатации;

Ю

M 04-44-2006

•    подготовить к работе фотометрический детектор и насос в соответствии с руководствами по эксплуатации;

•    установить требуемую объемную скорость подвижной фазы (ПФ) 200 мм³/мин;

•    запустить насос и дождаться прекращения роста давления в хроматографической системе;

•    настроить ПО «МультиХром» на прием хроматографических данных;

•    перевести детектор в режим «Измерение» и дождаться стабилизации базовой линии, после чего перевести детектор в режим «Ожидание»;

•    промыть шприц и петлю крана-дозатора ПФ или ацетонитрилом;

•    заполнить петлю крана-дозатора анализируемым раствором (избегая попадания в нее пузырьков воздуха), вводя приблизительно 50 мм³, при этом кран-дозатор должен находиться в положении «ПЕТЛЯ» (перед вводом в кран-дозатор при наличии капли на конце иглы шприца ее следует удалить фильтровальной бумагой);

•    ввести пробу, для чего, не вынимая шприц, переключить кран-дозатор в положение «КОЛОНКА». Одновременно перевести детектор в режим «Измерение»;

•    по окончании анализа детектор перевести в режим «Ожидание», переключить кран-дозатор в положение «ПЕТЛЯ» и вынуть шприц, после чего промыть шприц и петлю крана-дозатооа ПФ или ацетонитрилом.

Ф Запрещается переключать кран-дозатор в положение «ПЕТЛЯ» во время записи хроматограммы.

Для перехода с одной ПФ на ПФ другого состава (п.3.4.1) следует удалить из камеры насоса остатки предыдущей ПФ; промыть камеру 2-3 см³ новой ПФ; заполнить камеру новой ПФ и кондиционировать колонку в течение 10-15 мин

и

Рекомендуется в конце рабочего дня и/или перед началом работы дополнительно промывать колонку иэолропанолом. Для этого следует 2-3 раза подряд произвести дозирование изопропанола в хроматограф, после чего дождаться стабилизации базовой линии.

8.5    Градуировка хроматографической системы

В качестве образцов для градуировки анализатора используют растворы витаминов, приготовленные по п.3.4.4.

Регистрируют не менее двух хроматограмм каждого раствора и по окончании регистрации проверяют стабильность времен удерживания витаминов, используя неравенство:

|рДО'*.    (2)

где 11 и f₂ - время удерживания витамина на первой и второй хроматограммах соответственно, мин;

Г- среднее арифметичесюе значений f_f и t₂. мин.

При удовлетворительной стабильности времен удерживания выполняют процедуру градуировки согласно Кратким практическим указаниям по использованию ПО «МультиХром» для проведения анализа проб в режиме ВЭЖХ и определяют параметры градуировочной зависимости и коэффициент корреляции. Градуировку следует считать приемлемой, если величина коэффициента корреляции превышает 0,99. а СКО не более 5%.

Если хотя бы одно из указанных условий (стабильность времен удерживания, значение коэффициента корреляции и СКО) не выполняется, заново регистрируют хроматограммы растворов

8.6    Контроль стабильности градуировочной характеристики

Контроль стабильности градуировочной зависимости проводят не реже одного раза в неделю.

Концентрацию раствора для проведения контроля выбирают исходя из предполагаемого содержания витаминов в анализируемых пробах; рекомендуется использовать градуировочный раствор Na 2, приготовленный по п.3.4.4.2.

12

M 04-44-2006

Регистрируют не менее двух хроматограмм раствора и проверяют сходимость времен удерживания и значений концентраций в растворе по формулам (2) и (5) соответственно

Вычисляют концентрацию в образце для контроля как среднее арифметическое значение для двух вводов ( мкг/см^э). Градуировочная зависимость признается стабильной, если для каждого витамина выполняется условие:

\X'~C&0J$-C,    (3)

где С- действительное значение массовой концентрации витамина в растворе, используемом для контроля стабильности градуировочной характеристики, шг/см³.

Если условие (3) не выполняется, то процедуру контроля повторяют и при получении неудовлетворительного результата контроля градуировку системы проводят заново. Перед тем, как принять решение о пере градуировке, следует убедиться, что результат контроля не был случайным (неудачный ввод, разрушение витамина в растворе¹ и т.д.) и может быть воспроизведен.

9 ВЫПОЛНЕНИЕ ИЗМЕРЕНИЙ

9.1    Подготовка пробы к анализу

Важно: Анализ экстрактов проб необходимо провести в течение 1 часа, поэтому навески проб премиксов анализируют последовательно.

9.1.1    Подготовка пробы с использованием перемешивающего устройства

Навеску пробы соответствующей массы (табл.З), измеренную с точностью 0,0005 г, помещают в коническую колбу с пришлифованной пробкой вместимостью 50 см³. Добавляют необходимый объем метанола (табл.З) и плотно укупоривают. Смесь тщательно перемешивают, не оставляя частиц пробы на стенках колбы, и вы-

M 04-44-2006

держивают 1 час в защищенном от света месте при комнатной температуре.

Затем суспензию перемешивают в течение 1 ч на устройстве для перемешивания проб, отбирают 1-1,5 см³ экстракта в пробирку для центрифугирования и центрифугируют экстракт 3-5 мин со скоростью 4-5 тыс. об/мин. Аликвотную порцию экстракта после центрифугирования разбавляют ацетонитрилом (табл.З) и используют для хроматографического анализа. Для проб с низким содержанием витаминов (менее 1 г/кг витамина Е) для разбавления используют раствор БОТ в ацетонитриле по п.3.4.2.

Т аблица3

Содержание витамина А, млн МЕ/кг Навеска, г Объем метанола, см3 Коэффициент разбавления экстракта ацетонитрилом Премиксы 0,1-1 5 25 3-5(ацетонитрил с 0.2% БОТ) 1-5 5-2,5 25 10 5-10 1 25 10 10-50 0,75-1 25 20 Витаминные концентраты 40-50 0,25 го сл о

Коэффициент разбавления экстракта (Q) вычисляют по формуле:

Q=~^-    №

где Удел! - объем разбавленного ацетонитрилом экстракта пробы, см³;

Vt* - объем аликвотной порции метанольного экстракта пробы, взятый для разбавления, см³.

1 ВВЕДЕНИЕ

Настоящий документ устанавливает методику выполнения измерений (МВИ) массовой доли витаминов А {в форме ретинолаце-тата), D (в форме холекальциферола. или Оз) и Е (в форме а-токофе-ролацетата) в премиксах и витаминных концентратах методом обращенно-фззовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ) с использованием жидкостного хроматографа «Люмахром».

Диапазон измеряемых массовых долей витаминов приведен в таблице 1. Масса анализируемой навески пробы составляет 0,05 - 5 г в зависимости от содержания витамина и способа пробоподготов-ки.

Таблица 1 - Диапазоны измерений

Витамин Единицы массовой доли млн МЕ/кг г/кг А 0,1-50 0.0344 - 17.2 Е 0.0005 - 0.2 0.5 - 200 D 0,04 -20 0,001-0 4

Примечание - ME - международные единицы

2 ПРИПИСАННЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОГРЕШНОСТИ

ИЗМЕРЕНИЙ И ЕЕ СОСТАВЛЯЮЩИХ

Методика обеспечивает получение результатов измерений с погрешностью, не превышающей значений, приведенных в табл 2, во всем диапазоне измерений, приведенных в табл.1.

Значения показателя точности методики используют при

•    оформлении результатов измерений, выдаваемых лабораторией;

•    оценке деятельности лабораторий на качество проведения испытаний.

•    оценке возможности использования результатов измерений при реализации методики в конкретной лаборатории

1

Таблица 2 - Значения показателя повторяемости, воспроизводимости и точности методики

Диапазон измерений О/, % Or, % ±6. % Витамин А. млн МЕУкг От 0.1 до 2.5 вкл. 10 16 32 Свыше 2.5 до 50 вкл. 5 10 20 Витамин 0. млн МЕУкг От 0,04 до 0.5 вкл. 10 16 32 Свыше 0.5 до 20,0 вкл. 5 8 18 Витамин Е. млн МЕ/кг От 0.00005 до 0,005 вкл. 9 14 28 Свыше 0,005 до 0.2 вкл. 5 8 16

Примечание В таблице использованы следующие обозначения :ar - показатель повторяемости (относительное среднее квадратическое отклонение повторяемости), а«- показатель воспроизводимости (относительное среднее квадратическое отклонение воспроизводимости). ±6 - показатель точности (границы относительной погрешности при вероятности Р - 0,95)

3 СРЕДСТВА ИЗМЕРЕНИЙ, ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ

УСТРОЙСТВА, РЕАКТИВЫ И МАТЕРИАЛЫ

3.1 Средства измерений

Жидкостный хроматограф «Люмахром» с фотометрическим детектором «Люмахром ФД 3110» или «Люмахром ФД 3120» по ТУ 4215-329-20506233-2005

Хроматографическая колонка должна быть заполнена обращен-но-фазовым сорбентом и в условиях выполнения анализа' должна иметь эффективность не менее 4500 теоретических тарелок по лику витамина Е (1000 - витамина А, 4500 - витамина О). Минимально определяемые концентрации витаминов (при соотношении сигнал/шум равном трем, составляют для витамина А - ^{2 3}

0,02 мкг/см⁴, для витамина D - 0,02 мкг/см⁴ и для витамина Е -1 мкг/см⁴. Колонку снабжают пред колонкой, заполненной аналогичным обращенно-фазовым сорбентом.

Весы лабораторные специального или ГОСТ 24104-2001 высокого класса точности с ценой деления не более 0,1 мг, наибольшим пределом взвешивания не более 200 г, например ВЛР-200

Весы лабораторные среднего класса ГОСТ 24104-2001 точности с ценой деления не более 0,01 г, наибольшим пределом взвешивания не более 200 г

Пипетки градуированные 2-го класса ГОСТ 29227-91 точности, вместимостью 1. 2. 5 см⁴ и/или дозаторы пипеточные любой марки с переменным объемом 50-200 мм⁴ и 200-1000 мм⁴ с пределом допускаемой погрешности измерений не более ± 2%

Колбы мерные 2-го класса точности вме- ГОСТ 1770-74 стимостъю 25. 50, 500 см⁴

Цилиндры лабораторные 2-го класса ГОСТ 1770-74

точности вместимостью 25, 50 и 500 см⁴

Система сбора и обработки данных Гос реестр СИ РФ

«Мультихром» на основе персонального № 13473-98

компьютера или другие аппаратно-

программные средства, внесенные в

Госреестр СИ

Стандартный образец состава раствора а-токоферол ацетата в гексане

Стандартный образец состава раствора ретинолаэцетата в гексане

Стандартный образец состава раствора холекальциферола в ацетонитриле

Спектрофотометр типа СФ-26 или СФ-46⁵

Средства измерения должны быть поверены в установленные сроки. Допускается использование других средств измерения и стандартных образцов, имеющих аналогичные или лучшие характеристики.

3.2    Вспомогательные устройства

Пробирки с притертой пробкой вмести- ГОСТ 25336-62 мостью 5 и 10 см³

Колбы конические вместимостью 50 см³ ГОСТ 25336-82 Пробирки полимерные центрифужные вместимостью 1.5 см³

Микровстряхиватель типа Вортекс или устройство для перемешивания проб (например, типа ПЭ-6300, 6410. 6500 или аналогичное)

Лабораторная центрифуга любого типа (не менее 4000 об/мин)

Холодильник бытовой любого типа

Таймер

3.3    Реактивы

Вода дистиллированная    ГОСТ 6709-72

Ацетонитрил для жидкостной хромато- ТУ 6-09-5449-89 графин, ос.ч. (например, предприятия «Криохром» сорт 1-2)

Метанол (карбинол), х.ч.

2-Пропанол (изопропанол), х.ч.    ТУ 6-09-402-87

Бутилокситолуол (имп.)

Кислота серная, ч.    ГОСТ 4204-77

Допускается использование химических реактивов других производителей, имеющих аналогичные или лучшие характеристики.

M 04-44-2006

3.4 Приготовление растворов

3.4.1    Элюент для хроматографии

Перед употреблением элюенты выдерживают для дегазации не менее 4 часов. Для быстрой дегазации готовой смеси проводят вакуумирование емкости с элюентом, подключая ее к водоструйному насосу, либо поместив на ультразвуковую баню. Срок хранения в условиях, исключающих испарение компонентов смеси, не ограничен¹. Недопустимо использование резиновых и корковых пробок.

3.4.1.1    Подвижная фаза (элюент: далее - ПФ) для анализа витаминных концентратов: смесь ацетонитрил - изопропанол в объемном соотношении 90:10

В мерный цилиндр вместимостью 500 см³ помещают 400 см³ ацетонитрила и добавляют 50 см³ изопропанола. Доводят объем смеси до 500 см³ ацетонитрилом и тщательно перемешивают. Раствор переливают в заранее подготовленную стеклянную плотно закрывающуюся емкость.

3.4.J.2 Подвижная фаза (элюент) для анализа премиксов: смесь ацетонитрил - изопропанол - вода в объемном соотношении

96:2:2

В мерную колбу вместимостью 500 см³ помещают 400 см³ ацетонитрила и добавляют 10 см³ изопропанола и 10 см³ дистиллированной воды. Доводят объем смеси до 500 см³ ацетонитрилом и тщательно перемешивают. Раствор переливают в заранее подготовленную стеклянную плотно закрывающуюся емкость.

Примечание. Элюент также пригоден для анализа витаминных концентратов.

3.4.1.3 Подвижная фаза (элюент) для сложных премиксов: смесь ацетонитрил - изопропанол - вода в объемном соотношении 85:9:6

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 50 см³ ацетонитрила и добавляют 9 см³ изопропанола и 6 см³ дистиллирован-

¹ Для хранения целесообразно использовать предварительно высушенные емкости из-под ацетонитрила или гексана производства фиомы «Криохром*

5

ной воды Доводят объём смеси до 100 см³ ацетонитрилом и тщательно перемешивают. Хранят смесь в плотно укупоренной емкости.

3.4.2    Раствор бутилокситолуола (БОТ) в ацетонитриле,

массовая доля 0,2%

0,05 г БОТ растворяют в ацетонитриле в мерной колбе вместимостью 25 см³. Срок хранения в условиях, исключающих испарение растворителя, не ограничен.

3.4.3    Приготовление растворов витаминов А, Е и D

Поскольку витамины, особенно витамин А, легко разрушаются при повышенной температуре, под действием света и кислорода воздуха, а также в присутствии следов кислот, необходимо соблюдать специальные меры предосторожности, защищающие соединения от воздействия этих факторов:

•    избегать попадания прямых солнечных лучей;

•    использовать посуду, тщательно отмытую от следов кислот;

•    хранить растворы и экстракты в холодильнике;

•    свести до минимума контакт с кислородом воздуха (перемешивать осторожно, хранить в подходящей по объему посуде).

Возможно приготовление растворов витамина А и витамина Е из масляных фармакопейных препаратов (см. Приложение А).

3.4.3.1 Приготовление исходного pucnutopa витамина А

1 см³ стандартного образца состава раствора витамина А переносят в мерную колбу вместимостью 25 см³ и доводят до метки изопропанолом. Действительное значение массовой концентрации витамина А в приготовленном растворе (С,**) рассчитывают по формуле

С со ' V со 25

где Ссо - концентрация стандартного образца состава раствора ретинол-ацетата. указанная в свидетельстве на СО (мг/см³).

Va- объем стандартного образца состава раствора ретинол ацетата, взятый для приготовления раствора (1 см³)

Номинальное значение массовой концентрации полученного раствора 400 мкг/см³.

Срок хранения раствора 1 месяц при температуре 4 - 6 °С.

3.4.3.2    Приготовление исходного раствора витамина Е

5 см³ стандартного образца состава раствора а-токоферол-ацетата переносят в мерную колбу вместимостью 25 см³ и доводят до метки изопропанолом. Действительное значение массовой концентрации витамина Е в приготовленном растворе рассчитывают по формуле (1). в которую в качестве Ссо. мг/см³. подставляют концентрацию стандартного образца состава раствора а-токоферолацетата. указанную в свидетельстве на СО (мг/см³), и V^, - 5 см³. Номинальное значение массовой концентрации полученного раствора 4 мг/см³.

Срок хранения раствора 6 месяцев при температуре 4 ± 2 °С.

3.4.3.3    Приготовление исходного раствора витамина D

5 см³ стандартного образца состава раствора холекальцифе-рола переносят в мерную колбу вместимостью 25 см³ и доводят до метки ацетонитрилом. Действительное значение массовой концентрации витамина D в приготовленном растворе рассчитывают по формуле (1), в которую в качестве С», мг/см², подставляют концентрацию стандартного образца состава раствора холекальциферола. указанную в свидетельстве на СО (мг/см³). Номинальное значение массовой концентрации полученного раствора 200 мкг/см³.

Срок хранения раствора 6 месяцев при температуре 4 ± 2 °С.

3.4.4 Приготовление градуировочных растворов смеси витаминов

3.4.4.1 Приготовление градуировочного раствора № / (номинальные значения массовых концентраций витамина А - 32 мкг/см³,

витамина D-4 мкг/см¹, витамина Е - 320 мкг/см³)

2.0 см³ витамина А (п.3.4.3.1), 0.5 см³ витамина D (п.3.4.3.3) и 2.0 см³ витамина Е (п.3.4.3.2) помещают в мерную колбу вместимостью 25 см³, доводят до метки ацетонитрилом и тщательно пере-

7

мешивают. Срок хранения раствора 3 месяца при температуре 4 ± 2 °С.

3.4.4.2 Приготовление градуировочного раствора М 2 (номинальные значения массовых концентрации витамина А - 3,2 мкг/см³, витамина D - 0,4 мкг/см³, витамина Е- 32 мкг/см³)

2,5 см³ раствора (п.3.4.4.1) помещают в мерную колбу вместимостью 25 см³, доводят до метки ацетонитрилом и тщательно перемешивают. Срок хранения раствора 1 месяц при температуре 4 ± 2 °С.

3.4.4.3 Приготовление градуировочного раствора /6 3 (номинальные значения массовых концентраций витамина А - 0,32 мкг/см³,

витамина D - 0,04 мкг/см³, витамина Е - 3,2 мкг/см³)

2,5 см³ раствора (п.3.4.4.2) помещают в мерную колбу вместимостью 25 см³, доводят до метки ацетонитрилом и тщательно перемешивают. Срок хранения раствора 1 неделя при температуре

4 ± 2 °С.

При необходимости градуировочные растворы с иными концентрациями витаминов готовят аналогично.

4    МЕТОД ИЗМЕРЕНИЙ

Определение внесенных форм витаминов проводится прямой экстракцией без разрушения матрицы.

Сущность метода заключается в экстракции витаминов А , D и Е из пробы метанолом и последующем анализе содержания витаминов с использованием жидкостного хроматографа «ЛЮМАХРОМ» с фотометрическим детектированием.

5    ТРЕБОВАНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ

При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76. требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф «Люмахром».

8

1

Рекомендуется уточнять концентрации витамжов по индивидуальным растворам с использованием спектрофотометра (Приложение Б)

13

2

   При использовании подвижной фазы состава ацетонитрил I изопропанол в соотношении 90:10.

3

4

5

Для проверки концентрации растворов витаминов, а также при использовании фармакопейных препаратов для приготовления стандартных растворов витаминов.