УТВЕРЖДАЮ

Начальник Главного санитарно-эпидемиологического управления Министерства здравоохранения

А.Павлов

25 октября 1968 г.

№ 760а - 68

х)

ИНСТРУКЦИЯ по применению реакции непрямой гемагглютинации (РИГА) для обнаружения столбнячного микроба в объектах внешней среды

Метод обнаружения столбнячного микроба с помощью реакции непрямой гемагглютинации является высоко специфичным и может быть применен в лабораториях санэпидстанций, больниц, научно-исследовательских институтах, как вспомогательный метод исследования с целью установления обсемененности предметов внешней среды, при проверке запыленности больничных помещений, проверке на стерильность перевязочного материала и др.

I. Объекты и цели исследования

Исследование на наличие столбнячного микроба производиться в следующих случаях:

а)    при изучении краевой эпидемиологии столбняка с целью установления степени обсемененности ZltetaAlr почвы, пыли, растений и других объектов внешней среды;

б)    при проведении плановых санитарно-гигиенических ана-

^х^Инструкция подготовлена сотрудниками ордена Трудового Красного Знамени Института эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи АМН СССР Т.И.Сергеевой, К.И.Матвеевым и Т.И.Булатовой.

2

лизов на запыленность больничных помещений: палат, перевязочных, предоперационных, операционных, родильных и детских отделений, а также при проверке на стерильность перевязочных материалов, кетгута, шелка, лекарственных средств и т.п.;

в) при анализе материалов от больных с целью подтверждения диагноза и от трупов - для постмортального заключения.

П. Взятие проб для исследования

1,    Пробы почвы берутся в стерильные бактериологические пробирки с резиновыми пробками. Пробы почвы следует брать на расстоянии трех-пяти метров друг от друга в населенных пунктах (дворы, скотные дворы, огороды, сады, дороги, улицы, детские и спортивные площадки и т.д.), а также в лугах, полях, пастбищах, лесах, на берегах рек.

Для взятия почвы пробирка извлекается из стерильного бумажного пакета, нижней частью пробирки сдвигается поверхностный слой почвы в 3-5 см, затем открытым концом пробирки путем винтообразного движения вглубь набирается почва, после чего плотно закрывается^. На пробирке делают надпись: место взятия почвы, номер пробы, дата. Листья, растения и другие объекты помещаются в стерильную посуду,

2.    Для взятия пыли в помещениях необходимо заготовить тампоны из ваты на палочке, смочить тампоны физиологическим раствором, вложить их в пробирки, закрыть пробирки резиновыми пробками и простерилизовать в автоклаве. Взятие пыли производится следующим образом: тампоны извлекаются за кончик палочки из пробирки и влажным тампоном собирают пыль с поверхности предметов, после чего опять помещают в пробирку, которая закрывается пробкой и надписывается.

Для анализа перевязочные средства, образцы кетгута,

^ у    ~~    "    ■

' ' Применение шпаделей для снятия поверхностного слоя лоч-Г.Ы затруднено, так как требуется на каждую пробу стерильный шпадель.

II

Мазки, приготовленные из каждого исследуемого посева, фиксируют над пламенем, окрашивают по Граму и микроскопиру-ют. Наличие в препарате грам-положительных палочковидных микробов со спорами в виде барабанной палочки при положительной РИГА с данным посевом указывает на наличие возбудителей столбняка в исследуемом материале.

При наличии в препарате микробов, похожих на Cl tetcutl и сомнительной реакции гемагглютинации, необходимо повторить РИГА на 5-6-е сутки выращивания посевов, а также поставить биологическую пробу на белых мышах.

Для этого нужно развести испытуемую культуральную жидкость в 5 раз и ввести по 0,5 мл двум белым мышам в мышцу задней лапки. Появление признаков столбняка (напряжение хвоста и конечности на стороне введения, изгибание позвоночника, судороги) у мыши свидетельствуют о наличии столбнячного микроба.

При выделении чистой культуры с целью идентидикации столбнячного микроба путем посева на высокий столбик высевы отдельных колоний на жидкую среду следует проверять также по указанной методике.

Л-93090 от 20/ХП-68 года. Тираж 500 экз. Заказ 533

ИЭЫ иы.Н.Ф.Гамалеи АМН СССР

3

шелка, лекарств направляются в заводской упаковке, или же из них делается выборочное взятие стерильными инструментами тампонов, марлевых салфеток, ваты и других материалов, которые помещаются в стерильную посуду с надписью, содержащей название материала, место взятия и дату,

3. При подозрении на столбняк от больных берут на исследование содержимое раны, отторгнутые ткани, инородные тела, извлеченные из ран, перевязочные средства (тампоны, дренажные трубки, кетгут, шелк и т.д.). При криминальных абортах следует брать тампоном выделения из шейки матки, В случае подозрения на    у    новорожденного    необходимо

взять на исследование^из пупочной ранки, тампоны, повязки, шелк, использованные для перевязки пуповины. От трупов следует брать кусочек мышечной ткани из предполагаемого места внедрения инфекции и содержимое раны. Для взятия материала на исследование применяются стерильные инструменты и посуда, Пробы этикетируются, где указывается название материала, фамилия, имя, отчество больного или трупа, дата взятия. Бее пробы до исследования должны храниться при температуре не выше 4°.

Ш. Посев исследуемых материалов

Исследование всех вышеуказанных материалов производится путем посева их на жидкую среду и дальнейшего исследования культуральной жидкости посевов с помощью реакции непрямой гемагглютинации (РИГА).

Для посевов используется бульон Глузшна или бульон Вейнберга с кусочками мяса под вазелиновым маслом при pH 7,2-7,4-, разлитые по 70 мл во флаконы емкостью 100 ил.

Перед посевом флаконы со средой прогревают на водяной бане при 100° в течение 10 минут для регенерации среды, после чего охлаждают до 45°,

В каждый флакон перед посевом добавляют по 0,5/j стерильного 40^ раствора глюкозы (I мл на флакон).

4

Посев почвы производится следующим образом: в пробирку с пробой почвы добавляют равный объем физиологического раст-, после чего почва тщательно перемешивается пастеровской пипеткой, спустя 40-60 минут выдерживания при комнатной температуре по 2-3 мл почвенной суспензии вносится во флакон со средой.

Тампон с пылью извлекают за палочку из пробирки, осторожно отделяют его пипеткой от палочки и целиком помещают в питательную среду. Листья, растения и другие предметы помещают стерильны* пинцетом во флакон со средой.

Перевязочные и другие материалы, проверяемые на стерильность, исследуют в специальных стерильных боксах и одедде с соблюдением правил асептики. Приблизительно по 2-3 гр. материала (тампоны, бинты, вата, кетгут, шелк и т.д*) извлекают стерильными инструментами и помещают в сре-ДУ*

Кусочки тканей, взятые из трупов, предварительно измельчаются, а затем вносятся в питательную среду; содержимое раны, тампоны и другие материалы от больных засеваются так же, как указано выше.

Все посевы помещают в термостат при 37°. При наличии роста исследование посевов следует начинать спустя 48 часов после посева.

Посевы материалов, подвергавшихся стерилизации (перевязочные средства, кетгут, шелк), необходимо при отсутствии видимого роста выдерживать в термостате до 2-х недель. Трех-четырех-суточные посевы испытуемых материалов исследуются методом реакции непрямой гемагглютинации (РИГА) и микроскопнрованием.

1У. Материалы и реактивы, необходимые для постановки РИГА

Для постановки РИГА необходимы следующие реактивы и материалы:

I) Реактивы для приготовления буферных растворов:

5

I/15 M j/k HP0^2H₂0 1/15 M KH₂P0₄

физиологический раствор

2)    Танин

3)    Противостолбнячная сыворотка, очищенная и концентрированная методом "Диаферм-З" активностью 1000-1500 АЕ

в I мл.

4)    Бараньи эритроциты (нативные, консервированные в растворе Олсвера или формалинизированные эритроциты).

5)    Нормальная кроличья сыворотка.

6)    Столбнячный очищенным, концентрированный, но не адсорбированный анатоксин, активностью 150-200 ЕС в I мл.

7)    Доски для гемагглютинации из плексигласа с 72 лунками. Объем лунки 2 мл.

8)    Шприц непрерывного действия на I мл.

9)    Пипетки градуированные на I, 2, 5 мл.

Приготовление буферных растворов

Для приготовления I литра I/I5 М ffа^НРС^^О раствора берется 11,88 г реактива и добавляется до I литра физиологический раствор.

Для приготовления I литра I/I5 U КН^РО^ раствора берется 9,08 г реактива и добавляется до I литра теплый (4-5°) физиологический раствор. Из этих исходных растворов готовятся буферные растворы для постановки РИГА.

Буфер с pH 6,4

I/15 М Ха₂НР0₄2Н₂0 I/I5 М    КН₂Р0₄

Буфер с pH 7,0 1/15 М jfa₂HP0₄2H₂0 I/I5 М    КН₂Р0₄

Для получения большего количества буферных растворов составные части увеличивают в нужное число раз. Буферные растворы изготовляют заранее, контролируют их pH и сохраняют при 4-10°.

Приготовление раствора танина

Для танизирования эритроцитов используется медицинский порошкообразный, танин. Рабочим разведением танина является разведение его в физиологическом растворе в соотношении 1:20000.

Сначала готовят исходный раствор танина, который можно сохранять в холодильнике при 4-10° в течение 2-3-х недель и использовать для работы.

Для приготовления исходного раствора взвешивают на торсионных или аналитических весах 10-12 мг танина и помещают в пробирку, куда добавляют физиологический раствор до концентрации I мг/ыл, в результате чего получают разведение танина 1:1000. Для получения разведения 1:20000 исходный раствор разводят в 20 раз (I мл исходного раствора + 19 мл физиологического раствора).

Противостолбнячная сыворстка ^пДиаферм-3" должна быть первоначально апробирована в РИГА со столбнячным анатоксином или токсином, так как не всякая серия сыворотки бывает пригодна для сенсибилизации эритроцитов. Методика проверки сыворотки изложена ниже.

Бараньи эритроциты

Для РИГА лучше использовать эритроциты, консервированные в растворе Олсвера, которые при хранении в холодильнике могут быть применены для РИГА в течение 3-4-х недель. Раствор Олсвера для консервации эритроцитов:

1)    Глюкоза - 2,05 г

2)    Лимоннокислый Ла - 0,8 г

3)    Хлористый jfа - 0,42 г

7

4) Дистиллированная вода - до 100 мл

Установить pH - 6,1-6,2 , стерилизовать 2 раза по 30 минут текучим паром. Кровь из барана берется в стерильную посуду с раствором Олсвера в соотношении 1:1.

Для РНГА можно использовать также формалинизированные эритроциты и танизированные по методу М.И.Леви (1962,1967), которые в течение нескольких месяцев сохраняют свои свойства.

У. Методика постановки реакции Приготовление танизированных эритроцитов

По 3-5 мл нативных и консервированных эритроцитов барана отмывают 4-5 раз физиологическим раствором в центрифуге при 2500-3000 об/мин по 5-7 минут. Прозрачную бесцветную надосадочную жидкость сливают, по 0,15 мл осадка отмытых эритроцитов помещают в центрифужные пробирки, куда вносят 4 мл физиологического раствора и 4 мл рабочего разведения танина (1:20000), смесь выдерживают при 37° в течение 10 минут и отмывают:

а)    Смесь центрифугируют 5-7 минут при 3000 об/мин, надосадочную жидкость сливают.

б)    Осадок отмывают физиологическим раствором 2 раза.

Сенсибилизация эритроцитов противостолбнячной сывороткой

К осадку отмытых танизированных эритроцитов добавляют 3 мл противостолбнячной сыворотки, разведенной 1:10 буферным физиологическим раствором с pH - 6,4. Смесь выдерживают при 37° в течение I часа, после чего отмывают на центрифуге :

а)    центрифугируют 5-7 минут при 3000 об/мин, надосадочную жидкость сливают;

б)    осадок отмывают 4 ми буферного физиологического

8

раствора с pH 6,4 , надосадочную жидкость сливают;

в)    осадок отмывают буферный физиологическим раствором pH 6,4 с 1% нормальной инактивированной нри 56° 30 минут кроличьей сывороткой, надосадочную жидкость сливают;

г)    осадок суспендируют в 6 мл буферного раствора pH 6,4 с 1% нормальной инактивированной кроличьей сывороткой -получается 2,5% взвесь тапизированных сенсибилизированных противостолбнячной сывороткой эритроцитов.

Сенсибилизация танизированных ш/тщтщштт формалини-зированных эритроцитов производится следующим образом: 5 мд 2,5% взвеси эритроцитов отмывают физиологическим раствором, к осадку добавляют противостолбнячную сыворотку в указанном количестве, смесь выдерживают в термостате 2 часа, после чего отмывают, как указано выше, и взвешивают в 5 мл физио-логического раствора с pH 6,4 и 1% нормальной кроличьей сывороткой (инактивированной)*

Разведение исследуемого материала

Из посевов исследуемого материала на жидкие питательные среды спустя 48 часов инкубации при 37° берут по 0,5 мл культуральной жидкости, делают мазок на предметном стекле для микроскопирования, а затем разводят в 5 раз буферным физиологическим раствором pH 7,0 и 0,4% нормальной кроличьей инактивированной сывороткой (1:250).

Во все лунки доски для гемагглютинации разливают по 0,5 мл буферный раствор pH 7,0 с 0,4% кроличьей сыворотки.

В 1-ю лунку вносят 0,5 мл разведенной в 5 раз культуральной жидкости, далее делают последовательные 2-кратные разведения исследуемого материала путем переноса из лунки в лунку по 0,5 мл смеси, из предпоследней лунки 0,5 мл выливают, последняя лунка остается для контроля. Таким образом получают разведения испытуемой культуральной жидкости от 1:10 до 1:10240 ^ (схема I).

^х) При апробации противостолбнячных сывороток таким же об-разом разводят столбнячный анатоксин или столбнячный

ТОКСИН*

Схема I

1:10    :    1:20    :    1:40    :    1:80    :    1:160:    1:320:    1:640:    1:1280:1:2500:Контр.

•    *    •    •    •    *    ■    .и    Т.Д., _ « • • • •__• ■___«_*_______

№ I 0,5 мл 0,5 мл 0,5 мл и т.д. исходного развед ния 0,5 мл № 2 0,5 мл й 3 0,5 мл й 4 0,5 мл fc 5 0,5 мл й 6 0,5 мл 0,5 мл 0,5 мл и т.д, столб.анатоксина 0,5 мл или токсина 0,5 мл

10

В первую лунку каждого из 5 горизонтальных рядов вносят исходные разведения пяти исследуемых культур (№ 1-5). В 6-й ряд вносят 0,5 мл столбнячного анатоксина или токсина и разводят также (контроль активности сенсибилизированных эритроцитов). После приготовления разведений испытуемого материала в каждую лунку, включая и контрольные, вносят по 0,1 мл взвеси танизированных сенсибилизированных сывороткой эритроцитов. Содержимое лунок тщательно перемешивают путем осторожного встряхивания и доски помещают в термостат на I час при 37°, а затем оставляют при комнатной температуре. Предварительный учет результатов реакции производят через 2-3 часа, окончательный через 18 часов.

Учет результатов

Учет результатов производится визуально по следующей схеме:

(+) - положительная реакция: равномерная агглютинация эритроцитов, лунка заполнена гомогенной розовой взвесью,

(±) - учитываемая крайняя положительная реакция: зона агглютинированных эритроцитов несколько меньше диаметра лунки и окружена красным тонким ободком эритроцитов;

(-) - отрицательная реакция: зона эритроцитов занимает

половину или менее диаметра лунки и окручена плотным красным ободком или представляет собой плотный красный диск ("пуговка"), лежащий на дне лунки.

8а положительный результат следует считать (+) или (-) реакцию в разведении 1:20 и выше испытуемого материала,

(т.е. - во 2-й и последующих лунках горизонтального ряда доски) при отрицательном контроле в вертикальном 12-м ряду и положительном - в 6-м горизонтальном ряду в разведении не менее 1:1280-1;2560 ^ХК_

Ч При контроле противостолбнячных сывороток следует отби-

рать для работы те серии сывороток, которые дают положительный результат в РИГА с анатоксином или токсином в пазведении не менее чем до 1:2560 - 1:5120.