ГОСТ Р ИСО 10993.4-99

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Изделия медицинские Оценка биологического действия медицинских изделий

Часть 4

ИССЛЕДОВАНИЕ ИЗДЕЛИЙ, ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩИХ С КРОВЬЮ

Издание официальное

ГОССТАНДАРТ РОССИИ Москва

Предисловие

1    РАЗРАБОТАН Всероссийским научно-исследовательским и испытательным институтом медицинской техники (ВНИИИМТ)

ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 422 «Оценка биологического действия медицинских изделий»

2    ПРИНЯТ И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Госстандарта России от 29 декабря 1999 г. № 862-ст

3    Настоящий стандарт содержит полный аутентичный текст международного стандарта ИСО 10993.4—92 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 4. Исследование изделий, взаимодействующих с кровью», а также дополнения, отражающие потребности национальной политики, направленной на обеспечение безопасности применения медицинских изделий»

4    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

© ИПК Издательство стандартов, 2000

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Госстандарта России

ГОСТ Р ИСО 10993.4-99

6.2.1 А Неконтактирующие изделия

Неконтактирующие изделия не подвергают исследованию их взаимодействия с кровью. Одноразовые наборы для теста проверяют с целью исключения влияния материалов, из которых они изготовлены, на результаты исследований.

6.2.1.2    Изделия, контактирующие извне

Изделия, контактирующие извне, и методы их исследования приведены в таблицах 2—4. Эти методы рекомендуют для изделий, предназначенных для кратковременного (менее 24 ч), длительного или многократного (от 24 ч до 30 сут) контакта с кровью. См. также 6.1.6.

6.2.1.3    Имплантируемые изделия

Методы, предназначенные для исследования имплантируемых изделий, приведены в таблицах 5 и 6. Эти методы рекомендуют для изделий, имеющих длительный или многократный контакт (от 24 ч до 30 сут) или постоянный контакт (более 30 сут).

6.2.2 Указания и ограничения

В таблице 7 перечислены имеющиеся в продаже наборы, предназначенные для изучения человеческой крови, а в таблицах 2—6 приведен перечень методов исследований. Методы уровня 1 (относительно простые) являются основными, при оценке взаимодействия материалов и изделий с кровью. Методы уровня 2 (более сложные) считают дополнительными. Они требуют специального опыта от исполнителей при проведении исследования и интерпретации результатов. Проведение исследований обоих уровней требуют повышенного внимания к техническим деталям.

Таблица 7 — Имеющиеся в продаже наборы для исследования тромбоцитов, коагуляции, фибринолиза и компонентов комплемента

Фактор Метод исследования Плазминоген Колориметрия, флюоресцентный Антитромбин III Хромогенный, флюоресцентный Протеин С Хромогенный Протеин S Хромогенный Антиплазмин Хромогенный Прекалликреин Хромогенный Калликреин Флюоресцентный ТФ-4 РИА, ELISA, хромогенный P-TG РИА, ELISA Тромбоксан В2 РИА, ELISA Фактор VIII-ФВ Хромогенный, время образования сгустка Фактор IX Хромогенный, время образования сгустка Фактор 1Ха Флюоресцентный Фактор X Хромогенный, время образования сгустка Фактор Ха Флюоресцентный Фактор XII Хромогенный, время образования сгустка Фактор ХПа Флюоресцентный ФПА РИА, ELISA СЗ, С5 РИА Bb, iC3b, C4d, SC5b-9 ELISA ТСС ELISA TAT РИА, ELISA ИЛ-1 РИА, ELISA f1+2 РИА, ELISA D-димер РИА, ELISA Примечание — Эти методы проверены в клинико-диагностических лабораториях на человеке. Прежде чем использовать их в исследованиях на животных, необходимо проверить значимость получаемых показателей и их сопоставимость.

РИА используют для изучения взаимодействия изделия с кровью человека, но, как правило, он не пригоден для крови животных. Наборы, предназначенные для исследований с использованием человеческой крови, обычно не дают реакции с кровью животных, за исключением крови некоторых приматов. При разработке тест-систем следует убедиться в том, что тест-система действительно изме-

4-1839

ГОСТ Р ИСО 10993.4-99

ряет активацию, вызванную исследуемым материалом, а не является артефактом, присущим тест-системе.

При исследовании взаимодействия изделия с кровью может возникнуть разброс в полученных результатах из-за неправильного обращения с кровью либо неадекватно прогнозируемого воздействия материала до начала исследования. Например, когда исследование ограничивают лишь одним типом тестов или допускают попадание постороннего материала, не относящегося к испытуемому материалу или изделию. Материалы, которые предполагают применять в условиях медленного (венозного) потока крови, могут взаимодействовать с потоком совсем иначе, когда их используют с потоком с высокой скоростью (артериальная кровь). Изменение конструкции и (или) условий потока могут изменять гемосовместимость материала in vivo.

6.3 Типы тестов

6.3.1    Тесты in vitro

При рассмотрении результатов, полученных в тестах in vitro, учитывают следующие показатели: гематокрит, антикоагулянты, условия хранения пробы, срок хранения пробы, наличие контакта с воздухом и pH, температуру, последовательность проведения исследований изучаемого материала и контроля, соотношение площади поверхности и объема, условия динамики жидкости (особенно скорость кровотока либо скорость вымывания стенки). Исследования следует проводить, по возможности, в пределах не более 4 ч, так как многие свойства крови изменяются сразу же после отбора образца.

6.3.1.1    Исследования тромбоцитов

Методика забора крови должна быть воспроизводима. Тромбоциты могут стать гиперреактивными в различных условиях, включая неправильный забор крови. Измерения, предназначенные для подтверждения нормальной реактивности тромбоцитов, проводят с помощью агрегометра. Этим методом определяют пробы тромбоцитов со сниженной реактивностью. Гиперреактивные тромбоциты на агре-гометре в нормальных условиях испытаний не выявляются. Для того чтобы определить, становятся ли тромбоциты гиперреактивными в результате воздействия материала или изделия с кровью, тесты на агрегацию тромбоцитов модифицируют (уменьшая соответствующим образом концентрацию тромбоцитов и агрегирующих агентов).

6.3.1.2    Исследование коагуляции

Методы исследования коагуляции основаны на использовании нативной (свежей, без антикоагулянтов) цельной крови, цельной крови с антикоагулянтом (цитратной), богатой тромбоцитами плазмы крови или плазмы крови, обедненной тромбоцитами. Большинство стандартизованных методов исследований коагуляции разработаны с целью определения клинических значимых нарушений свертываемости крови, приводящих к задержке тромбообразования или к сильным кровотечениям. Поэтому чтобы оценить коагуляцию, ускоренную под действием биоматериалов, соответствующим образом изменяют программу изучения взаимодействия изделия с кровью. Для определения АЧТВ рекомендуют применять такие активаторы, как коалин, целит, эллаговая кислота. Избегают употребления реактивов с такими активаторами, поскольку они способны маскировать ускорение коагуляции, вызванное материалами и изделиями. Исследуемый материал является активатором. Необходимо включать контроль без материала.

Кровь подвергают воздействию исследуемого материала либо в неподвижной камере с параллельными плоскими ячейками, либо в замкнутой системе, где внутренняя поверхность трубки является исследуемым материалом. По истечении заданного заранее времени контакта с исследуемой поверхностью проводят исследование поверхности соприкосновения изделия и крови.

6.3.2    Методы ex vivo

Методы ex vivo предназначены для изделий, которые предполагают использовать ex vivo, например изделия, присоединяющиеся извне. Исследования ex vivo также пригодны для изделий; ex vivo не заменяет имплантацию. Существуют готовые тест-системы для мониторинга адгезии тромбоцитов, возникновения эмболии, осаждения фибриногена, массы тромбов, адгезия лейкоцитов, убыли тромбоцитов в крови и активации тромбоцитов [17], [27], [43]. Скорость кровотока измеряют либо прибором с эффектом Доплера, либо электромагнитным методом. Изменение скорости кровотока может служить индикатором возникновения тромбов, их размеров, мест отложения, а также развивающейся эмболии. Для мониторинга взаимодействия изделий с кровью ex vivo используют компоненты крови с радиоактивными метками. Чаще всего метят тромбоциты и фибриноген. Изменение реактивности тромбоцитов при нанесении метки будет минимизировано при более тщательном соблюдении всех деталей этой процедуры [20], [21], [32].

ГОСТ Р ИСО 10993.4-99

Преимущества тестов ex vivo по сравнению с тестами in vitro заключаются в том, что при исследованиях ex vivo используют поток нативной крови, что исключает артефакты, вызванные антикоагулянтами, и создают физиологические условия кровотока. Ex vivo можно исследовать несколько материалов, так как появляется возможность менять камеры, а также наблюдать отдельные события в реальном времени. Среди недостатков исследований ex vivo — различие скорости кровотока в разных экспериментах, у разных животных, и, как правило, относительно короткие периоды времени для оценки. В связи с этим рекомендуется использовать одно и то же животное для положительного и отрицательного контроля.

6.3.3 Методы in vivo

Исследование in vivo предусматривает имплантацию материала или изделия животным. Лоскуты для реконструирования сосудов, протезы сосудов из биологического материала, кольцевые протезы, сердечные клапаны — примеры изделий, для исследования которых пригодны методы in vivo. Тесты in vivo обычно проводят для изучения гемосовместимости изделий, контактирующих с кровью более 24 ч.

В большинстве случаев успех экспериментов in vivo определяется временем свободного кровотока. Процентное выражение окклюзии и массы тромбов определяют после удаления изделия. Тенденция тромбов, образовавшихся на стенках изделия, к эмболизации дистальных органах должна быть изучена путем макро- и микроскопических исследований органов, лежащих ниже по течению от изделия. Тромбы чаще всего скапливаются в почках, попадая туда по кровотоку почечных артерий от изделий, имплантированных выше по течению, на которых и происходила эмболизация (например, системы вспомогательного кровообращения, искусственное сердце, протезы аорты) [16].

Существуют методы оценки in vivo, которые не ограничивают продолжительность эксперимента. Для определения проходимости трансплантанта или места образования тромба используют артериог-рамму. Для наблюдения за осаждением тромбоцитов в различные периоды времени используют рентгеновские снимки. Выживание тромбоцитов и их убыль в крови используют в качестве индикаторов взаимодействия между кровью и изделием и пассивации вследствие образования неоинтимы или адсорбции белка.

В некоторых тест-системах in vivo свойства материала не являются определяющими при взаимодействии между кровью и изделием. Параметры потока, соответствие, пористость и конструкция трансплантата могут иметь большее значение, чем биосовместимость самого материала. Например, системы с низкой скоростью кровотока могут давать результаты исследования, в значительной степени отличающиеся от результатов исследования того же материала в условиях системы с высокой скоростью кровотока. В таких случаях результаты, полученные в тест-системе in vivo, должны иметь более важное значение в сравнении с результатами исследований in vitro.

4*

ПРИЛОЖЕНИЕ А (справочное)

Исследования изделий и протезов для сердечно-сосудистой системы, проводимые в ходе их применения in vivo

А1 Общие вопросы

АЛЛ В настоящем приложении представлена информация по выбору тестов для оценки взаимодействия с кровью изделий, предназначенных для сердечно-сосудистой хирургии. Пункт 6.2.1 содержит полный набор основных (уровень 1) и дополнительных (уровень 2) методов оценки взаимодействия изделий с кровью трех категорий: не контактирующие с кровью, контактирующие с кровью извне и имплантаты.

А.1.2 Классификация результатов взаимодействия изделия с кровью, приведенная ниже, дана для информации.

А.1.2.1 Взаимодействие, в результате которого воздействию подвергают, главным образом изделие и которое может иметь или не иметь нежелательные последствия, подразделяют на следующие группы:

-    адсорбция белков плазмы, липидов, кальция или других веществ из крови на поверхности изделий или абсорбция таких веществ в изделие;

-    агрегация тромбоцитов, лейкоцитов или эритроцитов на поверхности изделия, или абсорбция внутриклеточных компонентов в изделие;

-    образование псевдоинтимы или тканевой капсулы на поверхности изделия;

-    изменение механических и других свойств изделия.

А. 1.2.2 Взаимодействие, обладающее потенциальным нежелательным воздействием на животное или человека:

-    активация тромбоцитов, лейкоцитов или других клеток, активация коагуляции, активация фибриноли-за, активация комплемента, активация других путей иммунотоксичности (иммуносупрессия, повышение иммунитета, иммуномодуляция);

-    образование тромбов на поверхности изделия;

-    движение сгустка крови (тромба) или другого вещества с внутренней поверхности изделия по просвету системы кровообращения (эмболизация);

-    повреждение клеток, циркулирующей крови, приводящее к анемии, гемолизу, лейкопении, тробоци-топении или изменению функции клеток крови;

-    повреждение клеток и тканей, контактирующих с изделием;

-    гиперплазия интимы или скопление (аккумуляция) другой ткани на изделии либо вблизи него, что приводит к снижению кровотока или изменению других функций изделия;

-    адгезия и (или) рост бактерий и других возбудителей инфекции на поверхности изделия.

А. 1.3 Процедуры, используемые для оценки изделий, предназначенных для сердечно-сосудистой хирургии на животных, почти те же, что в клинической практике. Однако модели с использованием экспериментальных животных позволяют осуществлять постоянный мониторинг и исследование важных переменных при систематическом контроле.

А. 1.4 Рекомендуется соблюдать определенные общие требования.

Тромбоз, тромбоэмболия, кровотечение и инфекция — эти явления свидетельствуют о недопустимости использования и дальнейшей разработки уже имеющихся протезов сердечно-сосудистой системы. Для изделий с кратковременным воздействием на кровь (менее 24 ч), важными являются точные определения степени различий гематологических, гемодинамических переменных, а также переменных, характеризующих функционирование изделия, образование массы тромбов и возможно эмболия. При длительном, многократном или постоянном контакте (более 24 ч) внимание уделяют методике серии измерений, которые смогут дать информацию относительно времени тромбообразования и тромбоэмболии, потребление компонентов циркулирующей крови, возникновения гиперплазии внутренней поверхности сосудов и инфекции. В обоих типах воздействия и категориях контакта исследование гемолиза имеет важное значение. На образование тромбов может оказывать значительное влияние хирургическая техника, разнообразные, зависящие от времени, тромболитические и эмболитические эффекты, инфекции, вызванные изделием, и возможные изменения поверхности применяемых изделий, например гиперплазия интимы и лизис эндотелия.

Последствия взаимодействия чужеродных поверхностей с кровью могут быть различными: от множественного тромбоза и эмболии до неуловимых эффектов, таких как ускорение потребления гемостатических элементов; последнее может компенсироваться или привести к снижению численности тромбоцитов и факторов свертывания крови.

А. 1.5 При взаимодействии изделия с кровью может происходить нарушение функции органов. Например, функции почек и легких подвергаются действию со стороны свернувшейся крови и комплекса тромбоциты (лейкоциты) комплемент.

10

ГОСТ Р ИСО 10993.4-99

Такие показатели, как выживание тромбоцитов, (3-TG и специфический белок ТФ-4 в плазме крови могут отражать степень активации тромбоцитов (и, возможно, риск тромбоэмболии) даже при отсутствии значительного повышения показателей первичного гемостаза Стандартное время кровотечения является показателем функции тромбоцитов in vivo Удлинение этого показателя предполагает наличие тромбоцитопении или других качественных изменений в свертывающей системе, которые возникают при применении АИК [28] Измерение ФПА дают информацию о внутрисосудистом свертывания крови

В исследовании сосудистых трансплантатов из биологических тканей, клапанов сердца и других изделий, имплантированных или контактирующих извне, для определения локализации тромбов используют радионук-леотидныи метод [20], [21], [36] Кроме того, важную информацию может дать двумерное сканирование и тщательное исследование извлеченного изделия [37], [38]

А 1 6 Выбор модели с использованием животных может быть ограничен требованиями, связанными с размером, доступностью определенных видов и их ценой Очень важно, чтобы исследователи внимательно относились к различиям и сходству физиологии выбранных видов животных и человека, особенно связанных с коагуляцией, функцией тромбоцитов и лизисом фибрина, а также с реакцией на фармакологические агенты, такие как анестетики, антикоагулянты, агенты, растворяющие тромбы и тромбоциты, и, наконец, антибиотики

Так как реактивность различных видов животных неодинакова, и реакция на различные изделия также различна, данные, полученные лишь на животных одного вида, необходимо интерпретировать с осторожностью Приматы, такие как бабуины, обладают большим сходством гематологических показателей, механизма свертывания крови и сердечно-сосудистой системы с человеческими [27] Еще одно преимущество заключается в том, что можно использовать большинство иммунологических методов, разработанных для человека, для других приматов Среди них ТФ-4, (3-TG, ФПА, TAT, F_l+2 Часто используют собак, что позволяет получить ценную информацию, так как тромбоз, зависящий от примененного изделия, у них возникает быстрее, чем у человека Это различие можно рассматривать как преимущество использования собак в исследовательских целях Свинью считают подходящей моделью благодаря сходству сердечно-сосудистой системы и гематологических показателей этого вида и человека А.2 Канюли

Канюли обычно вводят в один или более основных кровеносных сосудов для обеспечения непрерывного поступления крови Их также используют в АИК и других устройствах Канюли можно исследовать в остром или хроническом эксперименте и, как правило, их исследуют как артериовенозные (AV) шунты Использование канюль незначительно изменяет уровни клеток в циркулирующей крови или факторы свертывания крови Канюли, как и другие устройства, имеющие контакт с кровью вне организма согласно 5 2 1, обычно в меньшей степени подвергают исследованию (см 6 2 12)

А.З Катетеры и зонды

Большинство тестов, используемых для исследования канюль, подходят и для исследования катетеров и зондов Положение катетеров в артериальной или венозной системе может значительно повлиять на взаимодействие изделия с кровью Рекомендуется осуществлять одновременное контрольное исследование, используя противоположную артерию или вену При удалении катетера необходима осторожность, чтобы не сдвинуть тромб Исследование in situ дает возможность оценить степень участия повреждении интимы или мест ввода катетеров и зондов в процессе образования тромба Исследование кинетики с применением меченых компонентов крови рекомендуется только для катетеров, которые вводят на длительное время, но может быть полезным для прогнозирования накопления тромбов in vivo Антиграфия и измерение скорости кровотока по Доплеру могут быть также полезны

А.4 Экстракорпоральные оксигенаторы, гемодиализаторы, оборудование для лечебного афереза и устройства для абсорбции специфических компонентов крови

Гемостатическая реакция на АИК может быть весьма значительной и острой Многие факторы, такие как использование отсосов крови, состав подаваемой насосом жидкой части крови, гипотермия, контакт крови с воздухом и время контакта, влияют на результаты исследования Эмболы в отводящих магистралях можно определять, периодически помещая ex vivo фильтры для крови, или используя ультразвук, или применяя другие неинвазивные приемы Накопление тромбов можно оценивать непосредственно во время работы устройства, отмечая такие функциональные показатели изделия, как падение давления в оксигенаторе и скорость переноса кислорода Приобретенная временная дисфункция тромбоцитов, ассоциирующаяся с выборочным высвобождением альфа-гранул, наблюдалась у пациентов с подключенным АИК [28], время кровотечения и другие методы исследования тромбоцитарного гемостаза особенно результативны

АИК и гемодиализаторы могут стать причиной активации комплемента В результате может возникнуть значительный легочный леикостаз, повреждение легких и их функций Поэтому количественная оценка гемолитической активности комплемента весьма значима и зависит от применяемого изделия

Оборудование для терапевтического афереза и устройства для абсорбции специфических субстанции из крови благодаря высокому показателю соотношения между площадью поверхности и объемом могут быть потенциальной причиной активации комплемента, коагуляции, тромбоцитов и лейкоцитов Исследование взаимодействия крови с подобными изделиями следует проводить по тем же принципам, как и испытание экстракорпоральных оксигенаторов и гемодиализаторов

А.5 Изделия, поддерживающие работу желудочков сердца (системы вспомогательного кровообращения)

Эти изделия могут вызывать значительные изменения различных компонентов крови. Среди факторов, приводящих к такому эффекту, можно указать на значительные площади инородных поверхностей, воздействующих на кровь, высокий режим кровотока и участки, нарушающие кровоток, либо закручивая его, либо разделяя. Исследование таких изделий может включать измерение гемолиза, концентрации тромбоцитов и фибриногена, жизнеспособности тромбоцитов, активности комплемента. Необходим мониторинг функционирования печени, легких, центральной нервной системы. Важным компонентом оценки изделия является детальное исследование патологических изменений с помощью хирургического катетера.

А. 6 Протезы сердечного клапана

При проведении оценки сердечных клапанов играют важную роль инвазивное, неинвазивное и гидродинамическое исследования.

Эхокардиография типов 2D и М позволяет получить при помощи ультразвука изображение сердца. Отражение от тканей с различной степенью акустического поглощения воспринимается и передается в форме изображения. При этом может быть изучена структура поверхности клапанов. Работающие протезы клапанов формируют эхо-сигналы высокого уровня, что дает возможность получать довольно четкое изображение движущегося препятствия (тромба, эмбола). Однако качество изображения зависит от того, какой клапан исследуют. Эхокардиография может оказаться весьма ценной в исследовании работы протезов клапанов, изготовленных из биологических тканей. При помощи этого метода можно выявить разрастания и утолщения стенки клапана, сгустки крови. Используя черно-белую и цветовую визуализацию отраженного эхо-сигнала при проведении эхокардиографии, можно идентифицировать и приблизительно оценить обратный ток крови.

Рекомендуют также определить выживание и агрегацию тромбоцитов, провести исследования свертывания крови и гемолиза, измерить давление кровяного русла и скорость кровоток, а также сделать аутопсию клапана и прилегающих тканей.

А.7 Протезы сосудов

В различные участки венозной и артериальной системы могут быть имплантированы пористые и непористые материалы. Выбор участка определяется, главным образом, предполагаемым применением протеза. Чем меньше длина протеза сосуда и чем больше его диаметр, тем выше вероятность того, что протез не закупорится. Правило большого пальца для протезов сосудов, внутренний диаметр которых менее 4 мм, можно сформулировать следующим образом: длина протеза сосуда должна составлять величину, равную диаметру, умноженному на 10 (например, 40 мм для протеза диаметром 4 мм). Наличие просвета в протезе сосуда определяется с помощью пальпирования пульса в дистальном участке протеза, а также периодической проводимой ангиографией. Ультразвуковое исследование, ЯМР и ПЭТ могут быть весьма полезны. Результаты серии исследований меченых тромбоцитов коррелируют с площадью поверхности неэндотелизированных трансплантатов у бабуинов [27]. Применение метода меченых тромбоцитов облегчает выявление места образования тромбов на стенках. Рекомендуют проводить серию подсчетов тромбоцитов, высвобождающихся компонентов клеток крови, продуктов деградации фибриногена/фибрина и активированных продуктов коагуляции. Аутопсия такого протеза и прилегающих к нему сегментов сосуда для морфологических исследований целостности эндотелия и реакции пролиферации может дать ценную информацию.

А.8 Ловушки тромбов и стенты

Эти изделия исследуют путем ангиографии и ультразвукового метода. Допускается применение методик для оценки протезов в соответствии с А.7.

12

ГОСТ Р ИСО 10993.4-99

ПРИЛОЖЕНИЕ Б (справочное)

Лабораторные методы: принципы и научное обоснование

Б.1 Основные положения

Б. 1.1 В настоящем приложении рассматривают принципы и научное обоснование методов исследования, изложенных в 6.2.1. Подробное описание этих методов можно найти в стандартах по лабораторной медицинской практике и клинической патологии. В ссылках [14]—[39], [41]—[44] рассматривают методы исследования, которые могут быть полезны для оценки изделий, взаимодействующих с кровью. Из-за биологического разнообразия и технических ограничений точность многих из этих методов недостаточно высока. По возможности, чтобы определить значимость результатов, исследования повторяют несколько раз.

Б. 1.2 Для того, чтобы исследования достигали цели и оценка взаимодействия изделия с кровью была адекватной, сначала подвергают воздействию материала или изделия кровь или плазму здорового человека, обработанную антикаогулянтом. Воздействие должно происходить в условиях, моделирующих условия применения в медицинской практике, в том числе длительность взаимодействия, температуру и характеристики кровотока. Известное количество крови, подвергнутой воздействию, или плазмы исследуют сразу после контакта с материалом или изделием. Условия воздействия должны учитывать предполагаемое использование изделия. Обеспечивают следующие условия:

-    длительность воздействия не менее 15 мин,

-    температура 37 °С;

-    кровоток моделирует предполагаемое применение изделия;

-    начало тестирования — в течение 15 мин, следующих за воздействием.

Выбор условий зависит от того, какое изделие или материал исследуют, а также от назначения данного изделия.

Б. 1.3 Во время исследования изделий, контактирующих извне, и имплантируемых изделий в условиях, в которых их применяют, кровь собирают в антикоагулянт, а исследование проводят, как описано, без предварительной стадии воздействия. Тесты разделены на пять категорий согласно 6.2.1 в соответствии с процессом или системой, которые исследуют: тромбоз, коагуляция, клетки крови и их функции, гематология и иммунология.

Б.2 Тромбоз

Б.2.1 Процентное выражение окклюзии

После того как изделие использовали и извлекли, оценку окклюзии осуществляют визуально и оценивают в процентах. Определяют степень тромбообразования в проводящем пути. Отсутствие видимой окклюзии необязательно означает отсутствие процесса тромбообразования, поскольку тромб со времени его образования может изменить свое местонахождение к тому моменту, когда оценивают процент окклюзии. Причиной закупорки сосуда может быть не только тромбоз, но и гиперплазия интимы, особенно в местах соединения протеза с сосудом. Для определения природы окклюзии проводят микроскопическое исследование.

Б.2.2 Уменьшение кровотока

Параметры кровотока (скорость или объем) измеряют после одного применения. Измерение можно проводить во время, перед или после применения. Пояснение и интерпретацию результатов проводят в соответствии с Б.2.1.

Б.2.3 Гравиметрический анализ (определение массы тромбов)

Массу тромбов измеряют после удаления изделия. Пояснение и интерпретацию результатов проводят в соответствии с Б.2.1.

Б.2.4 Световая микроскопия

При помощи этой методики можно получить информацию о плотности клеток, клеточной агрегации, фибрине, отложившемся на материале, а также о месте расположения этих отложений на материалах или изделии. Метод является приблизительным.

Б.2.5 Перепад давления в изделии

Этот показатель измеряют до и после применения. Пояснение и интерпретацию результатов проводят в соответствии с Б.2.1.

Б.2.6 Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ)

Пояснение и интерпретацию проводят в соответствии с Б.2.4. Этот метод имеет преимущество перед световой микроскопией (см. Б.2.4), так как дает более подробную информацию относительно тонкой структуры изучаемых компонентов. Выводы о количественных характеристиках требуют достаточного количества повторных определений, что позволило бы установить степень воспроизводимости результатов.

Б.2.7 Исследование трансплантированного изделия при аутопсии

Метод имеет важное значение для оценки биологической реакции организма на имплантированное изделие. Распределение, размер и микроскопическую природу клеточных отложений можно наилучшим образом

13

определить при патолого-анатомическом исследовании. Некоторые предлагаемые процедуры опубликованы [37], [38].

Б.2.8 И с с л е д о в а н и е дистальных органов при аутопсии

Цель исследования — изучение влияния имплантированных изделий на дистальные органы. Среди возможных эффектов — тромбоэмболия, инфекция и закупорка изделия.

Б.2.9 Ангиография

Метод используют для определения наличия просвета или степени сужения сосудистого протеза или другого канала, а также для определения тромбообразования на стенках изделия во время их функционирования in vivo.

Б.З Коагуляция

Б.3.1 Ч а с т и ч н о е тромбопластиновое время (ЧТВ)

Частичное тромбопластиновое время [35] — это время образования сгустка в рекальцифицированной цитратной плазме при добавлении частичного тромбопластина. Частичный тромбопластин — фосфолипидная взвесь, которую обычно экстрагируют из тканевого тромбопластина, гомогената мозга или легкого млекопитающих. Сокращение ЧТВ, возникающее при контакте с материалами в условиях применения в медицинской практике, указывает на гиперкоагуляцию и рассматривают как фактор риска тромбозов. Удлинение ЧТВ предполагает дефицит каких-либо факторов свертывания крови (за исключением факторов VII и XIII): I (фибриноген), II (протромбин), V, VIII, IX, X, XI или XII.

Гепарин и другие антикоагулянты также удлиняют ЧТВ.

В продаже имеется набор реактивов для определения частичного тромбопластинового времени, в который входят различные активные вещества такие как коалин или целит. Тест-набор, в котором используют эти реактивы, называется «Тест активированного парциального (частичного) тромбопластинового времени» (АЧТВ). Тест не применим для оценки взаимодействия между кровью и изделием in vitro, поскольку активирующие вещества маскируют активацию, вызванную изделием или входящими в его состав материалами.

Б.3.2 Протромбиновое время (ПВ)

Кровь смешивают с необходимым количеством цитрата натрия, плазму получают центрифугированием [35]. Этот тест основан на том, что в тщательно измеренном объеме плазмы имеется оптимальная концентрация ионов кальция и избыток тромбопластина, а переменные величины — концентрация протромбина и дополнительные факторы. Не рекомендуется использовать оксалат в качестве антикоагулянта, поскольку фактор V менее стабилен в этом растворе, что приводит к увеличению протромбинового времени. Этот тест позволяет определять протромбин и дополнительные факторы. В присутствии тканевого тромбопластина время образования сгустка зависит от концентрации протромбина, факторов V, VII и X (при условии, что фибриноген, фибринолитическая и антикоагулирующая активность в норме). Увеличение протромбинового времени обычно указывает на дефицит протромбина или факторов V, VII, X или фибриногена.

Этот тест имеет значение только для оценки имплантируемых изделий.

Б.3.3 Тромбиновое время (ТВ)

Тромбиновое время [35] — время свертывания плазмы при добавлении раствора тромбина со стандартной активностью. Тромбиновое время удлиняется при дефиците фибриногена (ниже 100 мг/дл), при аномалиях в молекуле фибриногена и при повышении уровней продуктов деструкции фибриногена и фибрина (ПДФ) или гепарина. Обычно тест проводят для оценки имплантируемых изделий.

Б.3.4 Фибриноген

Дисфибриногенемия, афибриногенемия и гипофибриногенемия вызывают увеличение ЧТВ, ПВ и ТВ [18]. Скрининговый тест ТВ наиболее чувствителен к дефициту фибриногена. Если требуется точный показатель фибриногена, рекомендуется модифицированный тест ТВ «Рептилазовое время», тест-набор которого также имеется в продаже.

Тест имеет значение лишь для оценки имплантируемых изделий.

Б.3.5 Продукты деструкции фибриногена и фибрина (ПДФ)

В продаже имеется несколько наборов для иммунологического исследования продуктов деструкции фибриногена и фибрина [18]. Очищенные Д и Е фрагменты вводят лабораторным животным, у которых образуются специфические иммуноглобулины. Иммуноглобулины собирают, экстрагируют и очищают, чтобы получить специфическую антисыворотку в контролируемых концентрациях. Суспензию латекса покрывают анти-ПДФ-глобулином, чувствительным к ПДФ при концентрации 2 мкг/мл. При этом имеют в виду, что иммунологические исследования могут не иметь значения, когда используют кровь некоторых животных.

Нормальное растворение фибрина происходит с образованием X, Y, С, D и Е фрагментов в концентрации менее 2 мкг/мл плазмы. Нормальный низкий уровень ПДФ достигается при низкой скорости реакции расщепления и высокой скорости выхода ПДФ в кровь. Патологическая деструкция фибриногена и фибрина, результат повышенной активности плазминогена, дает ПДФ в концентрации от 2 до 40 мкг/мл и более. Тест имеет значение лишь для оценки имплантируемых изделий.

Б.3.6 Исследование специфических факторов свертывания крови

Значительное снижение содержания факторов свертывания крови (например, менее 50 % нормального или контрольного уровня), возникающее в результате воздействия материала или изделия в условиях приме-

ГОСТ Р ИСО 10993.4-99

нения в медицинской практике, предполагает ускоренный расход этих факторов в процессе абсорбции, коагуляции или в процессе других механизмов.

Б.3.7 FPA, D-д и м е р, F₁₊₂, TAT

Повышение уровня ФПА, D-димеров или F_|+2 является показателем активности механизмов свертывания крови. Увеличение концентрации ТАТ указывает на усиление процесса свертывания крови и формирование комплекса между генерируемым тромбином и циркулирующим антитромбином.

Б.4 Тромбоциты и их функции

5.4.1 Подсчет тромбоцитов

Подсчет тромбоцитов является очень важным из-за их ключевой роли в возможном кровотечении. Значительное снижение количества тромбоцитов в крови, подверженной воздействию изделия, может быть вызвано процессами объемной и поверхностной агрегации клеток, их депонированием (например, в селезенку) или коагуляцией крови на материалах или изделиях. Уменьшение количества тромбоцитов во время функционирования имплантируемого изделия может быть вызвано ускоренным разрушением или удалением тромбоцитов из системы кровообращения.

Б.4.1.1 Подсчет тромбоцитов вручную

В некоторых клинических лабораториях подсчет тромбоцитов проводят вручную, несмотря на доступность приборов для подсчета тромбоцитов, обладающих высокой точностью (Б.4.1.2).

Б.4.1.2 Автоматизированный счет тромбоцитов в цельной крови и в тромбоцитарной плазме

Автоматизированный подсчет тромбоцитов можно проводить либо в хорошо перемешанной цельной крови, либо в тромбоцитарной плазме. Использование цельной крови предпочтительнее, так как использование тромбоцитарной плазмы дает менее точные результаты. Автоматизированный подсчет тромбоцитов проводят на большем количестве клеток, чем при ручном счете. Следовательно, разброс для автоматизированного счета может составлять всего 4 %, в то время как наилучший достижимый показатель для ручного счета составляет 11 %. Большинство приборов обладает способностью отличать тромбоциты от мелких частиц небиологического происхождения, что исключает необходимость визуально распознавать и дифференцировать осколки тромбоцитов.

Б.4.2 Агрегация тромбоцитов

Агрегацию тромбоцитов [35] вызывает добавление к тромбоцитарной плазме при постоянном перемешивании агрегирующих агентов (например, АДФ, эпинефрин, коллаген, тромбин и др.). По мере того, как происходит агрегация тромбоцитов, плазма становится все светлее. Оптическую систему используют для определения изменения трансмиссии света, а регистрирующее устройство графически изображает изменение трансмиссии света, начиная с базовой установки (на «0»), Замедленная или слабая агрегация тромбоцитов может быть вызвана активацией тромбоцитов и высвобождением содержащихся гранул, увеличением показателя ПДФ или определенными лекарственными препаратами (например, аспирином, нестероидными противовоспалительными средствами). Важно иметь в виду, что у некоторых животных агрегация тромбоцитов может варьировать или отсутствовать, когда используют отдельные агенты. Спонтанная агрегация тромбоцитов, происходящая в отсутствие ее индукторов, является патологическим процессом, указывающим на активацию тромбоцитов.

Б.4.3 Адгезивность клеток крови

Адгезивность клеток крови [31] — один из показателей совместимости материала с кровью. Чем меньше адгезированных клеток крови, тем более совместимы поверхность материала и кровь.

Разработаны различные методы измерения адгезивности клеток на поверхности. Большинство этих методов основаны на следующем наблюдении: определенная часть тромбоцитов удаляется из нормальной цельной крови в результате прохождения через колонку со стеклянными шариками в условиях контролируемого потока и давления. Этот принцип был использован для качественной оценки адгезии других клеток крови на полимеры, которыми покрыты стеклянные шарики. Благодаря использованию этого метода, был сделан вывод [31], что адгезия периферических лимфоцитов и полиморфонуклеарных лейкоцитов (PMNs) собак на стеклянные шарики, покрытые полигидроксиэтилметакрилатом (РНЕМА) ниже, чем на стеклянные шарики, покрытые полистиролом и некоторыми другими полимерами. В этом исследовании использовали изолированные лимфоциты и PMNs.

В качестве альтернативного метода можно предложить подсчет тромбоцитов, адгезированных на исследуемую поверхность. Вслед за воздействием крови в условиях применения в медицинской практике исследуемую поверхность промывают, чтобы удалить неадгезированные клетки, высушивают и готовят к световой или к сканирующей электронной микроскопии. Подсчитывают число адгезированных тромбоцитов на единицу площади и отмечают их морфологические особенности (общее число тромбоцитов и число агрегатов тромбоцитов). Можно также использовать тромбоциты, меченые изотопами хрома ^5|Сг и индия ^П11п.

Б.4.4 Стандартное время кровотечения

Благодаря доступности стерильных одноразовых приспособлений для осуществления надрезов кожи стандартной глубины и длины в стандартных условиях значительно повысилась воспроизводимость данного теста и его ценность. Увеличение времени кровотечения указывает на снижение функции тромбоцитов или уменьшение их числа в крови, последнее можно определить отдельно (Б.4.1). Увеличенное время кровотечения в сочетании с нормальным числом тромбоцитов наблюдалось при использовании некоторых изделий, контакти-

15

рующих извне и имеющих ограниченное воздействие (например, кардиопульмонарный шунт) [28]. Тест следует использовать с экспериментальными животными определенных видов.

Б.4.5 Гамм a-и злучение тромбоцитов, меченых радиоизотопами

Высокая эмиссия гамма-излучения, свойственная ¹¹'In, позволяет использовать его для этой цели [20], [27]. Этот метод дает возможность определения локализации тромбоцитов на поверхности изделия и проведения их количественной оценки. Метод используют для оценки изделий, контактирующих извне так же хорошо, как и имплантируемые изделия.

Б.4.6 Период жизни тромбоцитов (выживание тромбоцитов)

Тромбоциты получают из крови пациентов и метят ⁵¹Сг или ^ш1п [20], [21], [32]. Оба эти изотопа метят тромбоциты всех возрастов, присутствующие в образце, не вымываются в больших количествах из тромбоцитов, не захватываются другими клетками и не используются вновь во время тромбопоэза. "'In обладают преимуществом, поскольку является хорошим источником гамма-излучения. При этом требуется меньшее число меченых тромбоцитов, и появляется возможность одновременного определения локализации тромбоцитов на поверхности и изучения их выживаемости. Снижение выживаемости тромбоцитов указывает на ускоренное удаление тромбоцитов из системы кровообращения в результате иммунного, тромбообразовательного и других процессов.

Б.4.7 РАС-1 и S-12

Это моноклональные антитела, распознающие различные эпитопы активированных тромбоцитов.

Б.5 Гематология

Б.5.1 Число лейкоцитов и дифференциальный подсчет лейкоцитов

Использование определенных изделий может вызвать лейкопению, лейкоцитоз либо агрегацию лейкоцитов; увеличение числа лейкоцитов может указывать на наличие бактериальной инфекции. Сдвиг лейкоцитарной формулы (например, увеличение числа гранулоцитов, лимфоцитов, моноцитов) может также предполагать инфекцию.

Б.5.2 Гемолиз

Гемолиз является наиболее важным скриннинг-тестом, потому что высокий уровень гемоглобина в плазме, являющегося показателем гемолиза, отражает реакцию лизиса эритроцитов при контакте с материалами и изделиями.

Б.5.3 Подсчет ретикулоцитов

Повышенное количество ретикулоцитов — показатель усиленного образования эритроцитов в костном мозге. Это может быть реакцией на уменьшение количества эритроцитов в крови в результате хронической кровопотери (скрытого кровотечения), гемолиза и ряда других причин.

Б.б Иммунология

Б.6.1 СЗа, С5а, ТСС, Bb, СЗЬ, C4d, SC5b-9

Повышение уровня любого из этих активных компонентов комплемента является показателем активации системы комплемента. Некоторые материалы активируют комплемент, и активные компоненты комплемента в свою очередь активируют лейкоциты, вызывая их агрегацию и депонирование в легких.

Б.6.2 ИЛ-1 и другие цитокинины

Повышенные уровни отдельных цитокининов наблюдаются при контакте с кровью и тканями отдельных материалов. Цитокинины играют важную роль в регулировании воспалительной реакции, контролируя рост фибропластов, клеток гладкой мускулатуры и клеток эндотелия.

16

ГОСТ Р ИСО 10993.4-99

Содержание

1    Область применения.......................1

2    Нормативные ссылки.......................1

3    Определения.........................1

4    Сокращения.........................2

5    Изделия, контактирующие с кровью..................2

5.1    Изделия, не контактирующие с кровью.................2

5.2    Изделия, контактирующие с кровью вне организма.............2

5.3    Имплантируемые изделия.....................3

6    Методы...........................3

6.1    Общие рекомендации......................3

6.2    Методы исследования......................4

6.3    Типы тестов ........................8

Приложение А Исследования изделий и протезов для сердечно-сосудистой системы, проводимые в ходе их применения in vivo..............10

Приложение Б Лабораторные методы: принципы и научное обоснование.......13

Приложение В Методы in vitro оценки гемолитического действия изделий.......17

Приложение Г Библиография....................22

2-1839

ГОСТ Р ИСО 10993.4-99

ПРИЛОЖЕНИЕ В (справочное)

Методы in vitro оценки гемолитического действия изделий

В.1 Определение степени гемолиза

В.1.1 Принцип метода

Метод основан на сравнении оптической плотности суспензии вытяжки с кровью с оптической плотностью крови при 100 % гемолизе.

Для исследования используют эритроцитарную массу или цитратную кровь человека или кролика. Для обеспечения статистической достоверности отбирают пять образцов крови.

В. 1.2 Средства контроля

Реактивы:

-    спирт этиловый 96 %-ный;

-    физиологический раствор (0,85 %-ный водный раствор натрия хлорида);

-    натрий лимонно-кислый 5,5-водный для приготовления 3,8 %-ного водного раствора натрия цитрата;

-    натрия хлорид, ч.д.а. или х.ч.;

-    вода дистилированная.

Оборудование:

-    центрифуга с частотой вращения 2000 об/мин;

-    фотометр;

-    пробирки химические объемом 1—5 мл;

-    пипетки объемом 1—2 мл;

-    шприцы объемом 1—5 мл;

-    вата медицинская;

-    штатив для пробирок;

-    ножницы;

-    термостат;

-    холодильник.

В. 1.3 Приготовление вытяжек

Вытяжки из изделий и материалов готовят в соответствии с ГОСТ Р 51148 и ГОСТ Р ИСО 10993.12.

В.1.4 П р и г о т о в л е н и е 10 %-н о й взвеси эритроцитов

Для приготовления взвеси эритроцитов используют эритроцитарную массу или цитратную кровь, приготовленную на 3,8 %-ном растворе натрия цитрата в соотношении 1:9.

Примечание — Срок хранения цитратной крови (эритроцитарной массы) — 72 ч в холодильнике при температуре от плюс 4 до плюс 6 °С.

В. 1.4.1 Отмывание эритроцитов

Цитратную кровь (эритроцитарную массу) в количестве 5 мл центрифугируют при частоте вращения 900 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость отделяют. К осадку добавляют 8 мл физиологического раствора. Содержимое осторожно перемешивают и центрифугируют еще 10 мин. Надосадочную жидкость отделяют. Она должна быть прозрачной, бесцветной, не иметь следов гемолиза. Если надосадочная жидкость не отвечает указанным требованиям, то операцию по отмыванию осадка эритроцитов физиологическим раствором повторяют.

В. 1.4.2 Для получения 10 %-ной взвеси эритроцитов 1 мл осадка клеток смешивают с 9 мл физиологического раствора.

Примечание — Полученную взвесь эритроцитов хранят не более 24 ч в холодильнике при температуре от плюс 4 до плюс 6 °С.

В. 1.5 Приготовление опытной пробы

К вытяжке из изделия, приготовленной на дистиллированной воде, добавляют натрия хлорид из расчета 9 мл на 1 мл вытяжки. Если вытяжку готовили на физиологическом растворе, то хлорид натрия не добавляют.

В пробирки с 0,5 мл 10 %-ной взвеси эритроцитов всех образцов крови вносят по 5 мл вытяжки из изделия.

В. 1.6 Приготовление контрольной пробы

0,5 мл 10 %-ной взвеси эритроцитов разводят в 5 мл физиологического раствора.

В. 1.7 Приготовление пробы со 100 %-н ы м гемолизом

0,5 мл 10 %-ной взвеси эритроцитов разводят в 5 мл дистиллированной воды. При этом происходит полное разрушение эритроцитов, что соответствует 100 %-ному гемолизу.

Примечание — Контрольную и со 100 %-ным гемолизом пробы готовят для каждого образца эритроцитарной взвеси.

17

Введение

Соблюдение положений стандартов серии ГОСТ Р 10993 «Оценка биологического действия медицинских изделий» позволит обеспечить системный подход к исследованию биологического действия медицинских изделий.

Целью этих стандартов не является безусловное закрепление конкретных методов исследований и испытаний за группами однородных медицинских изделий в соответствии с принятой классификацией по виду и длительности контакта с организмом человека. Поэтому планирование и проведение исследований и испытаний должны осуществлять специалисты, имеющие специальную подготовку и опыт в области санитарно-химической, токсикологической и биологической оценок медицинских изделий.

Стандарты этой серии являются руководящими документами для прогнозирования и исследования биологического действия медицинских изделий на стадии выбора материалов, предназначенных для их изготовления, а также для исследований готовых образцов.

В серию ГОСТ Р ИСО 10993, имеющую групповой заголовок «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий» входят следующие части:

-    ГОСТ Р ИСО 10993.1 — оценка и исследования;

-    ГОСТ Р ИСО 10993.3 — исследование генотоксичности, канцерогенное™ и токсического действия на репропродуктивную функцию;

-    ГОСТ Р ИСО 10993.4 — исследование изделий, взаимодействующих с кровью;

-    ГОСТ Р ИСО 10993.5 — исследование на цитотоксичность: методы in vitro;

-    ГОСТ Р ИСО 10993.6 — исследование местного действия после имплантации;

-    ГОСТ Р ИСО 10993.7 — остаточное содержание окиси этилена после стерилизации;

-    ГОСТ Р ИСО 10993.9 — основные принципы идентификации и количественного определения потенциальных продуктов деструкции;

-    ГОСТ Р ИСО 10993.10 — исследование раздражающего и сенсибилизирующего действия;

-    ГОСТ Р ИСО 10993.11 — исследование общетоксического действия;

-    ГОСТ Р ИСО 10993.12 — приготовление проб и стандартные образцы;

-    ГОСТ Р ИСО 10993.13 — идентификация и количественное определение продуктов деструкции полимерных медицинских изделий;

-    ГОСТ Р ИСО 10993.16 — моделирование и исследование токсикокинетики продуктов деструкции и вымывания.

Объектом стандартизации настоящего стандарта являются методы исследования взаимодействия изделий с кровью в зависимости от вида и длительности контакта в процессе предполагаемого применения изделия в медицинской практике.

Методы исследования, изложенные в стандарте, взяты из международных, национальных стандартов, директив и нормативов.

Допускается применение других методов, обеспечивающих оценку биологического действия медицинских изделий в соответствии с требованиями международных стандартов.

В приложении В изложены некоторые методы исследования гемолитического действия медицинских изделий in vitro, применяемые в России при оценке биологического действия медицинских изделий.

Приложения А, Б, В и Г носят информационный характер.

IV

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Изделия медицинские Оценка биологического действия медицинских изделий

Часть 4

ИССЛЕДОВАНИЕ ИЗДЕЛИЙ, ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩИХ С КРОВЬЮ

Medical devices. Biological evaluation of medical devices.

Part 4. Selection of tests for interactions with blood

Дата введения 2002—01—01

1    Область применения

Настоящий стандарт распространяется на методы оценки взаимодействия медицинских изделий (далее — изделий) с кровью.

В стандарте приведена классификация изделий, в том числе стоматологического назначения, контактирующих с кровью, в зависимости от вида и длительности контакта в соответствии с ГОСТ Р ИСО 10993.1.

В стандарте изложены:

-    фундаментальные принципы, лежащие в основе оценки взаимодействия изделий с кровью;

-    пояснения к системному выбору методов исследования, а также принципы и научная основа этих методов.

Требования настоящего стандарта являются рекомендуемыми.

2    Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты, которые могут рассматриваться как разделы настоящего стандарта:

ГОСТ Р ИСО 10993.1-99 Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 1. Оценка и исследования

ГОСТ Р ИСО 10993.12-99 Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 12. Приготовление проб и стандартные образцы

ГОСТ Р 51148-98 Изделия медицинские. Требования к образцам и документации, представляемым на токсикологические, санитарно-химические испытания, испытания на стерильность и пироген-ность

3 Определения

В настоящем стандарте применяют термины, приведенные в ГОСТ Р ИСО 10993.1, а также следующие определения:

3.1    взаимодействие изделий с кровью: Взаимодействие изделий с кровью или любым из ее компонентов, вызывающее изменения в крови, органах, тканях, либо влияющее на само изделие. Эти изменения могут приводить или не приводить к клинически значимым или нежелательным последствиям.

3.2    ex vivo: Термин, относящийся к тест-системам взятия крови непосредственно от человека или подопытного животного в камеру для исследований. В модели с использованием животных кровь

Издание официальное

2*

можно сразу же вводить животному (рециркуляция) или собирать в пробирки для дальнейшего ее исследования (один путь). В любом случае камера для испытаний расположена вне тела.

4 Сокращения

В таблице 1 представлен перечень сокращений, которые применяют в настоящем стандарте.

Таблица 1— Сокращения

Сокращения и краткие обозначения Полное название ВЬ Продукт альтернативного пути активации комплемента P-TG Бета-тромбоглобулин C4d Фрагмент активированного С4 компонента системы комплемента СЗа, С5а Продукты расщепления компонентов СЗ и С5 комплемента при его активации D-димер (D-Dimer) Специфические продукты распада фибрина (F XIII перекрестно связанный фрагмент распада фибрина) ЭКМО (ЕСМО) Экстракорпоральный мембранный оксигенатор СЭМ Сканирующая электронная микроскопия ПДФ (FDP) Продукты деградации фибрина/фиброногена ФПА (FPA) Фибринопептид А f,+2 Активирующий протромбин фрагмент 1+2 iC3b Продукт активации центрального компонента системы комплемента ИЛ-1 (IL-1) Интерлейкин-1 IVC Нижняя полая вена ЯМР (MRI) Ядерный магнитный резонанс РАС-1 Моноклональное антитело к активированной форме гликопротеина 11Ь/ 111а на поверхности тромбоцита ПЭТ (РЕТ) Позитрон-эмиссионная томография ТФ-4 (PF-4) Фактор тромбоцитов ПВ (РТ) Протромбиновое время ЧТВ (РТТ) Частичное (парциальное) тромбопластиновое время АЧТВ (АРТТ) Активированное частичное тромбопластиновое время РИА (RIA) Радиоиммунологический анализ S-12 Моноклональное антитело к альфа-гранулам мембраны компонента GMP 140, которые подвергаются воздействию во время реакции высвобождения тромбоцитов Продукт терминального пути активации комплемента SC5b-9 TAT Тромбин-антитромбиновый комплекс ТСС Терминальный комплекс комплемента ТВ (ТТ) Тромбиновое время ФВ (VWF) Фактор фон Виллебранда АИК (СРВ) Аппарат искусственного кровообращения ELSA Фермент-связанное иммуносорбентное исследование

5 Изделия, контактирующие с кровью

Изделия, контактирующие с кровью, подразделены на категории в соответствии с ГОСТ Р ИСО 10993.1.

5.1    Изделия, не контактирующие с кровью

См. ГОСТ Р ИСО 10993.1. Например, устройства для диагностики in vitro.

5.2    Изделия, контактирующие с кровью вне организма

К данной категории согласно ГОСТ Р ИСО 10993.1 относят изделия, контактирующие с циркулирующей кровью и служащие в качестве магистралей и устройств для переливания крови. Отдельные примеры вошли в 5.2.1 и 5.2.2 настоящего стандарта.

5.2.1 К категории изделий, контактирующих с кровью вне организма и не имеющих прямого контакта с кровеносным руслом, относят, например, канюли, удлинители, изделия для сбора крови, хранения и введения крови и ее продуктов (трубки, иглы, мешки и др).

ГОСТ Р ИСО 10993.4-99

5.2.2 К категории изделий, контактирующих с кровью вне организма и имеющих прямой контакт с циркулирующей кровью, относят, например, аппараты искусственного кровообращения, экстракорпоральные мембранные оксигенаторы, оборудование для гемодиализа, оборудование для донорского и терапевтического афереза, устройства для абсорбции специфических веществ крови, изделия, вводимые в сердце и сосуды, экстракорпоральные системы вспомогательного кровообращения, временные электроды кардиостимулятора (водителя ритма).

5.3 Имплантируемые изделия

К данной категории согласно ГОСТ Р ИСО 10993.1 относят изделия, частично или полностью имплантируемые внутрь сосудистой системы. Например, механические протезы или биопротезы клапанов сердца, протезы или биотрансплантаты сосудов, вспомогательные устройства для системы кровообращения (искусственный желудочек сердца, искусственное сердце, интрааортальные баллонные насосы), фильтры для нижней полой вены, стенты, артериовенозные шунты, мониторы крови, катетеры для введения лекарств, постоянные электроды водителя ритма (кардиостимулятора), интраваскулярные мембранные оксигенаторы (искусственные легкие).

6 Методы

6.1    Общие рекомендации

6.1.1    При возможности для исследований применяют соответствующую модель или систему, которая моделирует геометрию и условия контакта изделия с кровью при применении по назначению, включая продолжительность контакта, температуру, условия стерильности и состояние кровотока. Для изделий, геометрия которых известна, например протезы сосудов различной длины, необходимо оценить зависимость результатов исследования от площади поверхности (длины) изделия.

Следует выбирать методы исследования, соответствующие последним достижениям науки в данной области.

Примечание — Исследуют лишь части изделия, контактирующие с кровью.

6.1.2    Если отсутствие контроля в эксперименте нельзя обосновать, контроль обязателен. При возможности в качестве контроля используют изделия, применяемые в медицинской практике, или хорошо изученные материалы, характеристики которых известны согласно ГОСТ Р ИСО 10993.12.

Стандартные образцы материалов в качестве отрицательного и положительного контроля, а также все исследуемые материалы должны соответствовать требованиям контроля качества и всем процедурам, гарантирующим качество материалов предприятием-изготовителем и испытательной лабораторией. Материалы и изделия должны иметь маркировку с информацией о производителе, классе и типе материала.

6.1.3    Исследование материалов, предполагаемых для изготовления отдельных частей и деталей изделия, следует проводить методом скрининга. Проведение этих исследований не заменяет изучение изделия в целом в условиях, моделирующих условия применения в медицинской практике.

6.1.4    Исследования, которые не моделируют условия применения, могут не совсем точно воспроизводить природу взаимодействия изделия с кровью во время клинического применения. Например, отдельные экспресс—тесты in vitro или ex vivo недостаточны для прогнозирования отдаленного результата взаимодействия крови и изделия in vivo [22], [23].

6.1.5    Изделия, предполагаемые к применению ex vivo (контактирующие извне), исследуют ex vivo. Изделия, предполагаемые к применению in vivo (имплантаты), исследуют in vivo на модели с использованием животных в условиях, где это возможно, моделирующих условия клинического применения.

6.1.6    Методы исследования in vitro пригодны для скрининга изделий, контактирующих извне, или имплантатов, но они могут неточно прогнозировать результаты взаимодействия изделия с кровью при длительном, многократном или постоянном контакте.

Изделия, предназначенные для бесконтактного применения, на взаимодействие с кровью не исследуют.

Изделия, имеющие кратковременный контакт с кровью (например, ланцеты, гиподермические иглы, капиллярные трубки и др.), как правило, на взаимодействие с кровью не исследуют.

6.1.7    Положения раздела 5, пунктов 6.1.5 и 6.1.6 служат руководством в выборе методов исследований, приведенных в 6.2.1.

6.1.8    Одноразовое лабораторное оборудование, предназначенное для забора крови и проведения исследования крови in vitro, проверяют, чтобы убедиться в отсутствии влияния на результаты прово

з-1839

ГОСТ Р ИСО 10993.4-99

димого исследования. Проверку можно осуществить, проводя исследование на стандартных образцах и сравнивая результаты при помощи методик, проверенных клинической практикой.

6.1.9    Если методы выбраны в соответствии с 6.1.1—6.1.8 и исследование проводят в условиях, моделирующих условия клинического применения, результаты исследования будут с наибольшей вероятностью прогнозировать воздействие изделия в клинической практике. Индивидуальные реакции животных различных видов и другие факторы могут ограничить возможности прогнозирования при любом методе исследования.

6.1.10    Из-за индивидуального характера реактивности крови у животных различных видов, при возможности, используют кровь человека. При необходимости использования животных, например если осуществляют оценку изделий, предназначенных для длительного или многократного, или постоянного контакта с кровью, необходимо учитывать, что каждый вид обладает индивидуальной реактивностью крови. Реактивность и другие показатели крови у человека и у приматов очень близки [23].

Примечание — Использование приматов в исследованиях совместимости крови и изделий запрещено законом государств Европейского Сообщества (86/906/ЕЕС) и законами других стран.

Исследования с использованием таких животных, как свинья, теленок, овца, могут давать удовлетворительные результаты. Для доклинической оценки протезов сосудов из биоматериалов пригодны собаки [43]. Поскольку индивидуальные различия могут быть значительными (например, адгезия тромбоцитов, тромбоз [17] и гемолиз у собак происходит быстрее, чем у человека), все результаты исследований на животных следует интерпретировать с осторожностью.

6.1.11    Антикоагулянты не используют, за исключением случаев, когда изделие должно функционировать в их присутствии. Выбор и концентрация антикоагулянта влияют на взаимодействие крови с изделием. Изделия, которые применяют с антикоагулянтами, исследуют в присутствии антикоагулянтов. Концентрации антикоагулянтов должны соответствовать используемым в клинических условиях.

6.1.12    Даже незначительные модификации изделий, допущенных к применению в медицинской практике, могут привести к значительным изменениям клинических функций. Примеры модификаций: изменения конструкции изменения, в той или иной степени химического состава поверхности или всего объема материала, из которого изготовлено изделие, изменение текстуры, пористости или других свойств искусственных сосудов. Поэтому необходимо учитывать влияние всевозможных модификаций на взаимодействие изделий с кровью при оценке их клинического значения.

6.1.13    Для получения статистически достоверных результатов проводят достаточное количество исследований, в том числе подходящий контроль. Вариабельность некоторых методов требует многократного повторения исследований для определения значимости этих методов. Проведение исследования взаимодействия изделия с кровью в течение длительного времени дает информацию о зависимости результатов взаимодействия от продолжительности контакта. При планировании эксперимента необходима консультация со специалистом по статистике.

6.2 Методы исследования

6.2.1 Методы, рекомендуемые для изучения взаимодействия изделий и материалов с кровью

Рекомендуемые методы исследования сгруппированы на основе категорий изделий. Перечни методов приведены в таблицах 2—6.

Рекомендуют два уровня исследований. Уровня подразделяют на пять классов. В основе разделения лежит изучаемый процесс или система:

-    тромбоз,

-    коагуляция,

-    тромбоциты и их функции,

-    гематология,

-    иммунология.

Для получения максимальной информации о спектре реакций, возникающих в результате контакта изделия с кровью, выбирают из каждого класса один или несколько тестов уровня 1 (таблицы 2, 3 и 5).

Дополнительные исследования в соответствии с уровнем 2 являются необязательными (таблицы 4 и 6).

Принципы и научная основа методов исследования уровней 1 и 2 изложены в приложении В.

ГОСТ Р ИСО 10993.4-99

Таблица 2 — Изделия, контактирующие с кровью извне Уровень 1 — Кровоток, непрямой (см 5 2 1)

Тест Метод Комментарии Тромбоз Световая микроскопия (адгезия тромбоцитов, лейкоциты, агрегаты, эритроциты, фибрин и др) Световую микроскопию можно заменить на СЭМ, если какие-либо свойства материала осложняют световую микроскопию Коагуляция НТВ (неактивированное) — Тромбоциты Подсчет тромбоцитов — Гематология Количество лейкоцитов, дифференциальный подсчет лейкоцитов, гемолиз (гемоглобин плазмы) Гемолиз — наиболее важный тест этой категории, который регистрирует степень разрушения клеточной стенки эритроцитов при контакте материалов и изделии с кровью Этот метод должен быть одним из нормативных стандартных методов определения гемолиза Иммунология СЗа, С5а, ТСС, C4d, Bb, iC3b, SC5b-9 Перечень, включая четыре последние теста, отражает различные стадии активации комплемента

Таблица 3 — Изделия, контактирующие с кровью извне Уровень 1 — Циркулирующая кровь (см 5 2 2)

Тест Метод Комментарии Тромбоз Процент окклюзии, сокращение потока, гравиметрический анализ (масса тромбов), световая микроскопия (адгезия тромбоцитов, лейкоциты, скопления клеток, эритроциты, фибрин и т д ), снижение давления через устройство Световую микроскопию можно заменить на СЭМ, если свойства материала затрудняют осуществление световой микроскопии Для изделий, имеющих длительный или многократный контакт (см 6 2 1 2), снижать давление не рекомендуется Коагуляция ЧТВ (неактивированное) — Тромбоциты Подсчет тромбоцитов, агрегация тромбоцитов, время кровотечения — Гематология Количество лейкоцитов, дифференциальный анализ лейкоцитов, гемолиз(количество свободного гемоглобина в плазме) Гемолиз — наиболее важный тест этой категории, который регистрирует степень разрушения клеточной стенки эритроцитов при контакте материалов и изделий с кровью Этот метод должен быть одним из нормативных стандартных методов определения гемолиза Иммунология СЗа, С5а, ТСС, C4d, Bb, iC3b, SC5b-9 Перечень, включая четыре последние теста, отражает различные стадии активации комплемента

Таблица 4 — Изделия, контактирующие с кровью извне Уровень 2 — Дополнительный

Тест Метод Комментарии Тромбоз СЭМ (адгезия и агрегация тромбоцитов, морфология тромбоцитов и лейкоцитов, фибрин) — Коагуляция Исследование специфических коагуляционных факторов, ФПА, D-димер, Fl+2, РАС-1, S-12, ТАТ "

3* 5

ГОСТ Р ИСО 10993.4-99

Продолжение таблицы 4

Тест Метод Комментарии Тромбоциты ТФ-4, (3-TG, тромбоксан В2; гамма-изображение меченых индием ‘"In тромбоцитов (выживание тромбоцитов) Маркировка индием "'In рекомендуется только для изделий, имеющих длительный или многократный контакт с кровью (см. 6.2.1.2) Г ематология Подсчет ретикулоцитов; активация высвобождения специфических продуктов из клеток периферической крови (гранулоциты) Рекомендуется только для изделий, имеющих длительный или многократный контакт с кровью (см. 6.2.1.2) Иммунология ИЛ-1 и другие цитокинины; определение i-PHK, специфической для цитокининов —

Таблица 5 — Имплантируемые изделия. Уровень 1 (см. 6.3)

Тест Метод Комментарии Тромбоз Процент окклюзии; сокращение потока; вскрытие изделия (макро- и микроскопия); аутопсия дистальных органов (макро- и микроскопия) — Коагуляция ЧТВ (неактивированное), ПВ; ТВ; плазменный фибриноген, ПДФ — Тромбоциты Подсчет тромбоцитов; агрегация тромбоцитов — Гематология Количество лейкоцитов, дифференциальный подсчет лейкоцитов; гемолиз (количество свободного гемоглобина в плазме) Гемолиз — наиболее важный тест этой категории, который регистрирует степень разрушения клеточной стенки эритроцитов при контакте материалов и изделий с кровью. Этот метод должен быть одним из нормативных стандартных методов определения гемолиза Иммунология СЗа, С5а, ТСС, C4d, Bb, iC3b, SC5b-9 Перечень, включая четыре последние теста, отражает различные стадии активации комплемента

Таблица 6 — Имплантируемые изделия. Уровень 2 — Дополнительный

Тест Метод Комментарии Тромбоз СЭМ, ангиография — Коагуляция Исследование специфических факторов свертывания крови; ФПА, D-димер, Fl+,, РАС-1, S-12, ТАТ Тромбоциты Исследование меченых '"In индием-111 тромбоцитов, ТФ-4 (фактор IV), (3-TG, тромбоксан В2; гамма-излучение меченых изотопами тромбоцитов Гематология Подсчет ретикулоцитов; активация высвобождения специфических продуктов из клеток периферической крови (гранулоциты) Иммунология ИЛ-1 и другие цитокинины; определение i-PHK, специфичной для цитокининов —