МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ

(МГС)

INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION

(ISC)

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ

СТАНДАРТ

ПРОДУКЦИЯ ПИЩЕВАЯ

Определение витамина В₆ (включая гликозилированные формы) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

(EN 14663:2005, ЮТ)

Издание официальное

Предисловие

Цели, основные принципы и порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены»

Сведения о стандарте

1    ПОДГОТОВЛЕН Научно-производственным республиканским унитарным предприятием «Белорусский государственный институт стандартизации и сертификации» (БелГИСС) на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии стандарта, указанного в пункте 5

2    ВНЕСЕН Государственным комитетом по стандартизации Республики Беларусь

3    ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 25 июня 2014 г. № 45)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004—97 Код страны по МК(ИСО 3166) 004—97 Сокращенное наименование национального органа по стандартизации Беларусь BY Госстандарт Республики Беларусь Киргизия KG Кыргызстандарт Молдова MD Молдова-Стандарт Россия RU Росстандарт Таджикистан TJ Таджикстандарт Узбекистан UZ Узстандарт

4    Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 июня 2016 г. № 733-ст межгосударственный стандарт ГОСТ EN 14663—2014 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июня 2017 г.

5    Настоящий стандарт идентичен европейскому стандарту EN 14663:2005 «Продукты пищевые. Определение витамина В₆ (включая гликозилированные формы) с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии» [(«Foodstuffs — Determination of vitamin B₆ (including its glycosylated forms) by HPLC», IDT],

Европейский стандарт разработан Техническим комитетом по стандартизации CEN/TC 275 «Анализ пищевых продуктов. Горизонтальные методы» Европейского комитета по стандартизации (CEN).

При применении настоящего стандарта рекомендуется вместо ссылочного европейского стандарта использовать межгосударственный стандарт, сведения о котором приведены в дополнительном приложении ДА

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

rOCTEN 14663—2014

Установлено, что разделение и количественное определение является удовлетворительным при следующих условиях:

Колонка ВЭЖХ - в соответствии с 5.5;

Подвижная фаза - в соответствии с 4.16;

Расход жидкости - 1,5 см³/мин;

Вводимый объем - от 1 до 50 мм³;

Детектор - флуоресцентный: длина волны возбуждения (Е_х) - 290 нм;

длина волны эмиссии (Е_т) - 390 нм.

6.5    Идентификация

Вводят одинаковые подходящие объемы раствора анализируемой пробы (см. 6.2.2), «холостой» пробы (см. 6.3) и смешанных градуировочных растворов (см. 4.21) в систему ВЭЖХ в условиях по 6.4.

Идентифицируют пики PM, PL и PN путем сравнения времени удерживания пиков на хроматограммах раствора анализируемой пробы и стандартного раствора. Идентификацию пика допускается также проводить с помощью сдвига значения pH в сторону увеличения, например при установлении pH = 6,6 ед. pH при использовании устройства постколоночной дериватизации (см. 5.4) при скорости потока послеколоночного реагента 0,1 см³/мин (см. 4.6). Обнаружение осуществляется при возбуждении при 330 нм и регистрации при 390 нм (см. [2], [4], [5]).

Примечание — Увеличение значения pH путем использования послеколоночного реагента (см. 4.6) приводит к сдвигу длины волны возбуждения до 330 нм. Кроме того, избирательность матриц улучшается в связи с уменьшением матрицы пиков ([2], [4], [5]).

6.6    Определение

Вводят одинаковые подходящие объемы стандартного раствора, а также раствора анализируемой пробы в систему ВЭЖХ согласно условиям по 6.4. Для определения содержания методом внешней градуировки определяют среднее значение площади пиков или высоты пиков и сравнивают результаты с соответствующими значениями образца сравнения.

7 Вычисление результата

7.1 Вычисление проводят с использованием градуировочной зависимости либо соответствующих программ интегратора, либо в соответствии с нижеприведенными формулами (3) - (6).

Массовую долю пиридоксамина (РМ), пиридоксаля (PL) или пиридоксина (PN), w, мг/100 г пробы вычисляют по формуле

у. F 100

W = —---,

т 1000 ’

где yj — содержание PM, PL и PN, определенное по площади пика или высоте пика с использованием линейной регрессии или градуировочной зависимости, мкг/20 см³ раствора анализируемой пробы (см. 6.2.2); т — масса пробы, г;

F — коэффициент разбавления из формулы (6).

Значение у, вычисляют по формуле

y_i = b_ix_i + a_i,    (4)

где bj, аi — коэффициенты регрессии для PM, PL или PN, вычисленные методом линейной регрессии на основе концентрации и площади пика в градуировочных растворах;

Xj — откорректированная площадь пика раствора анализируемой пробы PM, PL или PN. Значение х₍ вычисляют по формуле

^xi=Pi-B_h    (5)

где Pi — площади пика PM, PL или PN для раствора анализируемой пробы;

Bj — площади пика PM, PL или PN для «холостой» пробы.

7

Коэффициент разбавления F вычисляют по формуле

где V — общий объем раствора кислой вытяжки пробы (см. 6.2.1.2), (см. 6.2.1.3), см³;

V₁ — общий объем раствора кислой вытяжки пробы, подвергнутый ферментативной обработке (см. 6.2.2), см³.

7.2 Массовую долю витамина В₆ в пересчете на пиридоксин w, мг/100 г пробы вычисляют по формуле

W = 1,006WpM +1,012w_P|_ + Wpng ,    (7)

коэффициент для пересчета РМ на PN; содержание пиридоксамина, мг/100 г пробы; коэффициент для пересчета PL на PN; содержание пиридоксаля, мг/100 г пробы; содержание пиридоксина, мг/100 г пробы.

7.3 Массовую долю витамина В₆ в пересчете на пиридоксин выражают в миллиграммах на 100

Примечание — Если необходимо представить результат в пересчете на гидрохлорид пиридоксина, используют коэффициент пересчета 1,216. Сведения о проведении пересчета должны быть четко указаны в протоколе испытания.

8 Прецизионность

8.1    Общие положения

Данные по прецизионности для определения витамина В₆ были установлены в ходе межлабораторных испытаний в соответствии с [8], проведенных бывшим BgVV (Bundesinstitut furgesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinarmedizin (Немецкий федеральный институт по защите прав потребителей и ветеринарной медицине).

Подробная информация о совместном испытании точности метода приведена в приложении А. Значения, полученные в ходе межлабораторных испытаний, могут быть не применимы к диапазонам концентраций и пробам, не приведенным в приложении А.

Применимость и надежность настоящего метода были подтверждены в ходе испытаний различной пищевой продукции, например мяса, рыбы, молока, овощей, фруктов и злаков (см. [2], [3]). Полученные результаты были в достаточной степени воспроизводимы, и только иногда наблюдались относительно небольшие мешающие влияния матричных пиков проб, которые могут быть легко устранены. Для градуировочных растворов наблюдается сильно выраженная корреляция и линейная регрессия между площадью пика и концентрацией PM, PL и PN соответственно. Относительные стандартные отклонения от общего содержания витамина В₆ в последовательности, включающей от трех до пяти определений в различных продуктах, варьируются от 2 % до 6 %.

Полнота извлечения PM, PL и PN варьируется от 85 % до 105 % (см. [2], [3]). Определение общего содержания витамина В₆ настоящим методом дает в результате значительно более высокие значения в пищевой продукции растительного происхождения (содержащих гликозилированный пиридоксин), чем другие методы, в которых не используется обработка (5-глюкозидазой (см. [2], [3], [7]).

8.2    Повторяемость

Абсолютное расхождение между двумя отдельными результатами испытания, которые были получены при использовании одного и того же метода на идентичном испытательном материале одним и тем же оператором на одном и том же оборудовании в течение короткого промежутка времени, не должно превышать предел повторяемости г более чем в 5 % случаев.

Значения для порошковой манной крупы с молоком:

Пиридоксамин    х = 0,065 мг/100 г    г =    0,008

Пиридоксаль    х = 0,080 мг/100 г    г =    0,022

Пиридоксин    х = 0,523 мг/100 г    г =    0,067

rOCTEN 14663—2014

Витамин В6	х = 0,667 мг/100 г	г = 0,084
Значения для порошкового картофельного пюре:
Пиридоксамин	х = 0,163 мг/100 г	г = 0,016
Пиридоксаль	х = 0,032 мг/100 г	г = 0,012
Пиридоксин	х= 1,008 мг/100 г	г = 0,080
Витамин В6	х= 1,204 мг/100 г	г = 0,089
Значения для овощей с ветчиной (детское питание)
Пиридоксамин	х = 0,043 мг/100 г	г = 0,005
Пиридоксаль	х = 0,009 мг/100 г	г = 0,004
Пиридоксин	х = 0,047 мг/100 г	г= 0,010
Витамин В6	х= 0,107 мг/100 г	г = 0,011
Значения для мультивитаминного напитка:
Пиридоксамин	х = 0,004 мг/100 г	г = 0,003
Пиридоксаль	х = 0,004 мг/100 г	г = 0,003
Пиридоксин	х = 0,374 мг/100 г	г = 0,056
Витамин В6	х = 0,380 мг/100 г	г = 0,056

8.3 Воспроизводимость

Абсолютное расхождение между результатами двух единичных испытаний, полученными на идентичном объекте испытаний двумя лабораториями, должно превышать предел воспроизводимости R не более чем в 5 % случаев.

Значения для порошковой манной крупы с молоком:

Протокол испытания должен содержать по меньшей мере следующие сведения:

a)    всю информацию, необходимую для полной идентификации пробы;

b)    ссылку на настоящий стандарт или используемый метод;

c)    дату и метод отбора пробы (если они известны);

d)    дату поступления пробы в лабораторию;

e)    дату проведения испытания;

f)    результаты и единицы, в которых выражены результаты испытания;

д) информацию о других специфичных особенностях, которые наблюдались в ходе проведения испытания;

h) информацию о других особенностях, не установленных в настоящем методе или рассматриваемых как дополнительные, которые могут повлиять на результаты испытания.

9

Приложение A (справочное)

Данные по прецизионности

Имеющиеся данные были получены с использованием методов ВЭЖХ, установленных в приложении С. Данные результатов испытаний для определения витамина В₆ были установлены в ходе межлабораторных испытаний в соответствии с [8], проведенных бывшим BgVV [Bundesinstitut fQr gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinarmedizin (Немецкий федеральный институт по защите прав потребителей и ветеринарной медицине)].

Таблица А.1 —Данные результатов испытаний для порошковой манной крупы с молоком

Проба Порошковая манная крупа с молоком Вещество, определяемое при анализе Пиридоксамин Пиридоксаль Пиридоксин Витамин В6а> Год совместного исследования 2000 Количество лабораторий 11 Количество проб 5 Количество лабораторий, оставшихся после исключения выбросов 10 Количество оставшихся результатов 53 Среднее значение х, мг/100 г 0,065 0,080 0,523 0,667 Стандартное отклонение повторяемости sp мг/100 г 0,003 0,008 0,024 0,030 Относительное стандартное отклонение повторяемости RSDP % 4,6 10,0 4,6 4,5 Значение повторяемости r(2,8 sr), мг/100 г 0,008 0,022 0,067 0,084 Стандартное отклонение воспроизводимости sR, мг/100 г 0,013 0,025 0,053 0,068 Относительное стандартное отклонение воспроизводимости RSDr, % 20,5 31,3 10,1 10,2 Значение воспроизводимости R(2,8sr), мг/100 г 0,035 0,071 0,151 0,193 Среднее значение коэффициента извлечения компонента, % 97,2 94,7 93,9 — Стандартное отклонение коэффициента извлечения компонента, % 9 8,2 9,7 — Количество результатов, использованных для расчета 23 20 23 — а) См. формулу (7).

Т а б л и ц а А.2 — Данные результатов испытаний для порошкового картофельного пюре

Проба	Порошковое картофельное пюре
Вещество, определяемое при анализе	Пиридоксамин	Пиридоксаль	Пиридоксин	Витамин В6а>
Год совместного исследования	2000
Количество лабораторий	10
Количество проб	5(9)
Количество лабораторий, оставшихся после исключения выбросов	9
Количество оставшихся результатов	49
Среднее значение х, мг/100 г	0,163	0,032	1,008	1,204
Стандартное отклонение повторяемости sp мг/100 г	0,006	0,004	0,028	0,032

Окончание таблицы А 2

Проба Порошковое картофельное пюре Вещество, определяемое при анализе Пиридоксамин Пиридоксаль Пиридоксин Витамин В6 а> Относительное стандартное отклонение повторяемости RSDP % 3,7 12,3 2,8 2,7 Значение повторяемости r(2,8sp), мг/100 г 0,016 0,012 0,080 0,089 Стандартное отклонение воспроизводимости sR, мг/100 г 0,031 0,008 0,111 0,131 Относительное стандартное отклонение воспроизводимости RSDr, % 19,0 25,0 11,0 10,9 Значение воспроизводимости R (2,8 sR), мг/100 г 0,089 0,022 0,314 0,369 Среднее значение коэффициента извлечения компонента, % 97,7 85,2 90,8 - Стандартное отклонение коэффициента извлечения компонента, % 9,4 7,4 9,9 - Количество результатов, использованных для расчета 19 20 20 - а) См. формулу (7).

Таблица А.З —Данные результатов испытаний для овощей с ветчиной (детское питание)

Проба Овощи с ветчиной (детское питание) Вещество, определяемое при анализе Пиридоксамин Пиридоксаль Пиридоксин Витамин В6а> Год совместного исследования 2000 Количество лабораторий 9 Количество проб 5(2) Количество лабораторий, оставшихся после исключения выбросов 8 Количество оставшихся результатов 37 Среднее значение х, мг/100 г 0,043 0,009 0,047 0,107 Стандартное отклонение повторяемости sp мг/100 г 0,002 0,001 0,003 0,004 Относительное стандартное отклонение повторяемости RSDp % 4,4 15,4 7,2 3,6 Значение повторяемости r(2,8sp), мг/100 г 0,005 0,004 0,010 0,011 Стандартное отклонение воспроизводимости sR, мг/100 г 0,005 0,005 0,007 0,014 Относительное стандартное отклонение воспроизводимости RSDr, % 11,0 50,5 15,7 12,8 Значение воспроизводимости R(2,8sr), мг/100 г 0,013 0,013 0,021 0,039 Среднее значение коэффициента извлечения компонента, % 95,1 90,6 88,9 - Стандартное отклонение коэффициента извлечения компонента, % 4,5 12,0 10,2 - Количество результатов, использованных для расчета 18 16 19 - а) См. формулу (7).

T а б л и ц a А.4 - Данные результатов испытаний для мультивитаминного напитка

Проба Мультивитаминный напиток Вещество, определяемое при анализе Пиридоксамин Пиридоксаль Пиридоксин Витамин В6а> Год совместного исследования 2000 Количество лабораторий 11 Количество проб 5 Количество лабораторий, оставшихся после исключения выбросов 10 Количество оставшихся результатов 53 Среднее значение х, мг/100 г 0,004 0,004 0,373 0,380 Стандартное отклонение повторяемости sr мг/100 г 0,001 0,001 0,020 0,020 Относительное стандартное отклонение повторяемости RSDP % 25,0 25,0 5,4 5,3 Значение повторяемости r(2,8 sr), мг/100 г 0,003 0,003 0,056 0,056 Стандартное отклонение воспроизводимости sR, мг/100 г 0,002 0,002 0,030 0,034 Относительное стандартное отклонение воспроизводимости RSDr, % 38,6 49 8,0 8,8 Значение воспроизводимости R(2,8sr), мг/100 г 0,005 0,005 0,086 0,095 Среднее значение коэффициента извлечения компонента, % 98,1 94,5 98,2 — Стандартное отклонение коэффициента извлечения компонента, % 11,4 6,2 8,4 — Количество результатов, использованных для расчета 23 23 23 — а) См. формулу (7).

12

Приложение В (справочное)

Примеры подходящих условий проведения ВЭЖХ для определения соединений витамина В₆

Таблица В.1- Примеры подходящих условий ВЭЖХ для определения соединений витамина В6

Приложение С (справочное)

Примеры молярных коэффициентов поглощения

Таблица С.1 — Примеры молярных коэффициентов поглощения Е соединений витамина В6 (см. [3], [4])

Соединение Растворитель Т Атах’ НМ Е, ММОЛЬ"1 СМ'1 Mw, Г МОЛЬ'1 Пиридоксина гидрохлорид 0,1 моль/дм3 HCI, pH приблизительно 1 290 8,6 205,6 Пиридоксина гидрохлорид 0,1 моль/дм3 фосфатный буферный раствор, pH 7 323,8 7,3 205,6 Пиридоксаля гидрохлорид 0,1 моль/дм3 HCI, pH приблизительно 1 288 8,96 (9,0) 203,6 Пиридоксаль-5’-фосфат 0,1 моль/дм3 фосфатный буферный раствор, pH 7 388 5,02 247,1 Пиридоксамина дигидрохлорид 0,1 моль/дм3 HCI, pH приблизительно 1 292 8,2 241,1 Пиридоксамина дигидрохлорид 0,1 моль/дм3 фосфатный буферный раствор, pH 7 253 4,6 241,1 Пиридоксамин-5’-фосфат гидрохлорид 0,1 моль/дм3 фосфатный буферный раствор, pH 7 326 8,37 241,1

14

Приложение D (справочное)

Примеры хроматограмм

Обозначения:

LU — интенсивность флуоресценции

Рисунок D.1 —Хроматограммы образцов сравнения и пробы картофельного пюре

Условия хроматографического анализа: колонка ВЭЖХ — в соответствии с 5.5; подвижная фаза — в соответствии с 4.16; расход —1,5 см³/мин;

детектор — флуоресцентный: длина волны возбуждения — 290 нм; длина волны эмиссии — 390 нм.

Приложение ДА (справочное)

Сведения о соответствии ссылочных европейских стандартов межгосударственным

стандартам

Т а б л и ц а ДА. 1

Обозначение ссылочного европейского стандарта Степень соответствия Обозначение и наименование межгосударственного стандарта EN ISO 3696 ЮТ ГОСТ ISO 3696-20131) «Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы контроля» Примечание — В настоящей таблице использовано следующее условное обозначение степени соответствия стандарта: - ЮТ — идентичный стандарт.

^ В Российской Федерации действует ГОСТ Р 52501-2005 «Вода для лабораторного анализа. Технические условия».

rOCTEN 14663—2014

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)

© Стандартинформ, 2016

В Российской Федерации настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

rOCTEN 14663—2014

Библиография

[1]    Bognar, A.: Bestimmung von Vitamin B₆ in Lebensmitteln mit Hilfe der Hochdruckflussig-Chromatographie (HPLC) Z Lebensm Unters Forsch A, 1985, 181: 200—205 (Определение содержания витамина B₆ в продуктах питания с использованием ВЭЖХ)

[2]    Bognar, A., Ollilainen, V: Influence of Extraction on the Determination of Vitamin B₆ in Food by FIPLC Z Lebensm Unters Forsch A, 1997, 204: 327—335 (Влияние экстракции на определение витамина В₆ в пищевых продуктах методом ВЭЖХ)

[3]    Metzler, D. Е., and Snell, Е. Е.: Spectra and Ionisation Constants of the Vitamin B₆ — Group and Related 3-Plydroxy-pyridine Derivates Journal ofthe American Chemical Society. 1955, 77:2431—2437 (Константы спектра и ионизации группы витамина В₆ — группа и связанные производные 3-гидроксипиридина)

[4] Bitsch, R., Moller, J., J Chromatogr 1989, 463: 207—211 (Журнал хроматографии)

[5]    Ollilainen, V: FIPLC Analysis of Vitamin B6 in Agricultural and Food Science in Finland Department of Applied Chemistry and Microbiology University of FHelsinki 1999. Vol. 8:No. 6: 515—619 (Анализ ВЭЖХ витамина B₆ в науках о сельском хозяйстве и продуктах питания в Финляндии)

[6]    Bergaentzle, М., Arella, F., Bourguignon, J.B., Plasselmann, С.: Determination of vitamin B₆ in foods by FIPLC A collaborative study. Food Chemistry, 1995, 52: 81—86 (Определение витамина B₆ в пищевых продуктах методом ВЭЖХ)

[7]    Ndaw, S., Bergaentzle, М., Aoude-Werner, D., Plasselmann, C.: Extraction procedures for the liquid chromatographic determination of thiamin Riboflavin and vitamin B₆ in foodstuffs Food Chemistry 2000, 71, 129—138 (Процедуры экстракции для определения тиамина, рибофлавина и витамина В₆ в пищевых продуктах методом жидкостной хроматографии)

[8]    ISO 5725:1986¹) Precision of test methods — Determination of repeatability and reproducibility for a standard test

method by inter-laboratory tests (Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений)

!> ISO 5725:1986 отменен и заменен на ISO 5725-1:1994, ISO 5725-2:1994, ISO 5725-3:1994, ISO 5725-4:1994, ISO 5725-5:1998, ISO 5725-6:1994.

17

Содержание

1    Область применения....................................................................................................................................1

2    Нормативные ссылки....................................................................................................................................1

3    Сущность метода..........................................................................................................................................1

4    Реактивы........................................................................................................................................................1

5    Оборудование...............................................................................................................................................5

6    Методика проведения испытания................................................................................................................5

7    Вычисление результата................................................................................................................................7

8    Прецизионность............................................................................................................................................8

9    Протокол испытания.....................................................................................................................................9

Приложение А (справочное) Данные по прецизионности..........................................................................10

Приложение В (справочное) Примеры подходящих условий проведения ВЭЖХ

для определения соединений витамина В₆......................................................................13

Приложение С (справочное) Примеры молярных коэффициентов    поглощения.....................................14

Приложение D (справочное) Примеры хроматограмм...............................................................................15

Приложение ДА (справочное) Сведения о соответствии ссылочных европейских

стандартов межгосударственным стандартам...............................................................16

Библиография................................................................................................................................................17

IV

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ПРОДУКЦИЯ ПИЩЕВАЯ

Определение витамина В₆ (включая гликозилированные формы) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Foodstuffs.

Determination of vitamin B₆ (including its glycosylated forms) by high performance liquid chromatography method

Дата введения — 2017—06—01

1    Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод определения витамина В₆ в пищевой продукции с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Витамин В₆ определяется как сумма пиридоксина, пиридоксаля, пиридоксамина, включая ихфос-форилированные производные, а также p-гликозилированные формы, в пересчете на пиридоксин.

Настоящий метод был успешно проверен на манной крупе с молоком (детское питание), картофельном пюре, овощах с ветчиной (типичная пищевая продукция) и мультивитаминном напитке в диапазоне концентраций от 0,034 мг/100 г до 1,210 мг/100 г.

2    Нормативные ссылки

Для применения настоящего стандарта необходим следующий ссылочный стандарт. Для недатированных ссылок применяют последнее издание ссылочного стандарта (включая все его изменения).

EN ISO 3696 Water for analytical laboratory use — Specification and test methods (Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы испытаний)

3    Сущность метода

Производные витамина В₆ (пиридоксаль, пиридоксамин и пиридоксин) извлекают из пищевой продукции путем кислотного гидролиза, затем подвергают ферментативному воздействию: дефосфорили-руют, используя кислую фосфатазу, и дегликозилируют, используя (5-глюкозидазу.

Полученные производные витамина В₆ разделяют и количественно определяют методом ВЭЖХ с флуоресцентным детектированием ([1], [2]).

4    Реактивы

4.1    Общие положения

В ходе анализа используют только реактивы признанной аналитической чистоты и воду не ниже первой степени чистоты в соответствии с EN ISO 3696 или бидистиллированную воду.

4.2    Фосфат калия двузамещенный, массовая доля w(K₂HP0₄-3H₂0) > 99,9 %.

4.3    Ацетат натрия безводный, w(CH₃COONa) > 99,0 %.

4.4    Трихлоруксусная кислота (ТХУ), w(CI₃CCOOOH) > 99,0 %.

4.5    Раствор ацетата натрия молярной концентрацией с (CH₃COONa) = 2,5 моль/дм³

205 г ацетата натрия (см. 4.3) растворяют в 1 дм³ воды.

4.6    Реагент послеколоночный (дополнительно), К₂НР0₄ раствор с концентрацией с (К₂НР0₄) = = 0,15 моль/дм³.

Издание официальное

Растворяют 34,2 г фосфата калия двузамещенного (см. 4.2) в воде, доводят до 1000 см³, перемешивают и дегазируют.

4.7    Соляная кислота, c(HCI) = 1 моль/дм³.

4.8    Соляная кислота, с(НС1) = 0,1 моль/дм³.

4.9    Соляная кислота, с(НС1) = 0,2 моль/дм³.

4.10    Серная кислота, c^SO^ = 1 моль/дм³.

4.11    Эфир петролейный, диапазон кипения от 40 °С до 60 °С.

4.12    Фосфатаза кислая из картофеля. Ферментативная активность составляет около 5,3 U/мг¹).

Необходимо, чтобы используемый фермент с положительным результатом проходил проверку

ферментативной активности согласно 4.13.2 (более подробная информация приведена в [2], [7]).

4.13    Раствор кислой фосфатазы

4.13.1    Общие положения

Растворяют 60 мг кислой фосфатазы (см. 4.12) в 10 см³ воды в конической колбе, перемешивая в течение 2 мин.

Раствор готовят в день проведения анализа.

4.13.2    Проверка ферментативной активности кислой фосфатазы

Взвешивают 10 г свинины, 5 г картофельного пюре или 5 г муки из цельного зерна в конической колбе и экстрагируют кислотой, как описано в 6.2.1. Добавляют к 12,5 см³ раствора экстрагированной пробы 1 см³ раствора кислой фосфатазы (см. 4.13.1) и опционально 1 см³ раствора р-глюкозидазы (см. 4.15) и перемешивают. Инкубируют раствор в течение не менее 12 ч или в течение ночи при температуре 37 °С при постоянном перемешивании. Повторяют эту операцию с двойным количеством раствора кислой фосфатазы.

Определяют массовую концентрацию витаминов в соответствии с 6.6. Ферментативная активность используемого фермента считается достаточной, если значения массовой концентрации соединений витамина В₆ в обоих растворах пробы эквивалентны. На хроматограмме должен отсутствовать пик фосфата пиридоксамина.

Примечание — Для межлабораторного испытания использовали кислую фосфатазу производства Sigma Nr Р 3752²).

4.14    р-глюкозидаза из миндаля с ферментативной активностью приблизительно 3,2 U/мг

Необходимо, чтобы используемый фермент с положительным результатом проходил проверку ферментативной активности согласно 4.15.2 (более подробная информация приведена в [2], [7]).

4.15    Раствор р-глюкозидазы

4.15.1    Общие положения

Растворяют 100 мг р-глюкозидазы (см. 4.14) в 10 см³ воды в конической колбе, перемешивая в течение 2 мин.

Раствор готовят в день проведения анализа.

4.15.2    Проверка ферментативной активности р-глюкозидазы

Взвешивают 10 г свинины, 5 г картофельного пюре или 5 г муки из цельного зерна в конической колбе и экстрагируют кислотой, как описано в 6.2.1. Добавляют к 12,5 см³ раствора экстрагированной пробы 1 см³ раствора кислой фосфатазы (см. 4.13.1) и 1 см³ раствора р-глюкозидазы (см. 4.15.1) и перемешивают. Инкубируют раствор в течение не менее 12 ч или в течение ночи при температуре 37 °С при постоянном перемешивании. Данную операцию повторяют с двойным количеством раствора Р-глюкозидазы.

Определяют массовую концентрацию витаминов в соответствии с 6.6. Ферментативная активность используемого фермента считается достаточной, если значения массовой концентрации соединений витамина В₆ в обоих растворах пробы эквивалентны. На хроматограмме должен отсутствовать пик фосфата пиридоксамина.

Примечание — Для межлабораторного испытания использовали кислую фосфатазу Sigma Nr G-0395²).

rOCTEN 14663—2014

4.16    Подвижная фаза для ВЭЖХ (серная кислота, c(H₂S0₄) = 0,015 моль/дм³, содержащая

0,005 моль/дм³ трихлоруксусной кислоты)

(817 ± 5) мг трихлоруксусной кислоты (см. 4.4) растворяют в 15 см³ серной кислоты молярной концентрацией 1 моль/дм³ (см. 4.10), переливают в мерную колбу вместимостью 1000 см³, объем содержимого в колбе доводят до метки водой, перемешивают и дегазируют.

4.17    Силиконовое масло для удаления пены.

4.18    Образцы сравнения

4.18.1    Общие положения

Пиридоксамин (РМ), пиридоксаль (PL) и пиридоксин (PN) могут быть получены у различных поставщиков. Чистота образцов сравнения может варьироваться, поэтому необходимо определить их концентрацию и чистоту (см. 4.19.4 и 4.20.7).

4.18.2    Пиридоксамина (РМ) дигидрохпорид, w(C₈H₁₂N₂0₂-2HCI) > 98 %.

4.18.3    Пиридоксаля (PL) гидрохлорид, w (C₈H₉N0₃-HCI) > 98 %.

4.18.4    Пиридоксина (PN) гидрохлорид, w (CgH^NOg-HCI) > 98 %.

4.19    Исходные растворы

4.19.1    Исходный раствор пиридоксамина (РМ), массовой концентрацией р(РМ) приблизительно 500 мкг/см³

71.7    мг пиридоксамина дигидрохпорида (см. 4.18.2) растворяют в соляной кислоте молярной концентрацией 0,1 моль/дм³ (см. 4.8) в мерной колбе вместимостью 100 см³, объем содержимого в колбе доводят до метки этим же раствором соляной кислоты.

Срок хранения раствора — 1 неделя при температуре 4 °С или 2 мес при температуре минус 18 °С.

4.19.2    Исходный раствор пиридоксаля (PL) массовой концентрацией p(PL) приблизительно 500 мкг/см³

60,9 мг пиридоксаля гидрохлорида (см. 4.18.3) растворяют в соляной кислоте молярной концентрацией 0,1 моль/дм³ (см. 4.8) в мерной колбе вместимостью 100 см³, объем содержимого в колбе доводят до метки этим же раствором соляной кислоты.

Срок хранения раствора — 1 неделя при температуре 4 °С или 2 мес при температуре минус 18 °С.

4.19.3    Исходный раствор пиридоксина (PN), массовой концентрацией p(PN) приблизительно 500 мкг/см³

60.8    мг пиридоксина гидрохлорида (см. 4.18.4) растворяют в соляной кислоте молярной концентрацией 0,1 моль/дм³ (см. 4.8) в мерной колбе вместимостью 100 см³, объем содержимого в колбе доводят до метки этим же раствором соляной кислоты.

Срок хранения раствора — 1 неделя при температуре 4 °С или 2 мес при температуре минус 18 °С.

4.19.4    Определение концентраций растворов

Отбирают пипеткой 1 см³ исходного раствора пиридоксамина (см. 4.19.1), пиридоксаля (см. 4.19.2) и пиридоксина (см. 4.19.3) соответственно в мерные колбы вместимостью 50 см³ и содержимое колб доводят до метки 0,1 моль/дм³ HCI (см. 4.8). Измеряют оптическую плотность растворов в кювете из кварцевого стекла с толщиной поглощающего слоя 1 см при длинах волн, соответствующих максимумам поглощения относительно 0,1 моль/дм³ HCI (см. таблицу 1).

Таблица 1 — Примеры молярных коэффициентов поглощения соединений витамина В6

Соединение Растворитель > лтах ММОЛЬ"1 СМ"1 Мг г/моль F РМ-2НС1а) 0,1 моль/дм3 HCI, pH ~ 1 292 8,2 241,1 0,698 Р1_-НС1Ь) 0,1 моль/дм3 HCI, pH ~ 1 288 9,0 203,6 0,821 PNHCIC) 0,1 моль/дм3 HCI, pH ~ 1 291 8,6 205,6 0,823 a)    PM-2HCI - Пиридоксамина дигидрохлорид (4.18.2). b)    PL HCI - Пиридоксаля гидрохлорид (4.18.3). c)    PN HCI - Пиридоксина гидрохлорид (4.18.4).

Массовую концентрацию пиридоксамина, пиридоксаля и пиридоксина в исходных растворах р,, мкг/см3, вычисляют, используя молярный коэффициент поглощения, по формуле

где A — значение оптической плотности растворов пиридоксамина, пиридоксаля и пиридоксина при длинах волн, соответствующих максимумам поглощения ^_тах (см. таблицу 1);

М₍- — молярная масса образцов сравнения PM, PL или PN соответственно согласно таблице 1, г/моль;

V — коэффициент разбавления, см³ (в данном случае V = 50 см³);

F — коэффициент для вычисления доли свободных форм соединений витамина В₆;

еI — молярный коэффициент поглощения PM, PL или PN при соответствующем pH согласно таблице 1, ммоль^-1 см^-1.

Данные значения массовой концентрации используют для вычисления точных концентраций веществ, приведенных в пунктах 4.19.1—4.19.3 и 4.20.1—4.20.6.

4.20 Стандартные растворы

4.20.1    Стандартный раствор пиридоксамина (PM) I, массовой концентрацией р(РМ) приблизительно 10 мкг/см³

Разбавляют 2 см³ исходного раствора пиридоксамина (см. 4.19.1) 0,1 моль/дм³ HCI (см. 4.8) и доводят до 100 см³. Полученный раствор хранению не подлежит.

4.20.2    Стандартный раствор пиридоксаля (PL) I, р(Р1_) приблизительно 10 мкг/см³ Разбавляют 2 см³ исходного раствора пиридоксаля (см. 4.19.2) 0,1 моль/дм³ HCI (см. 4.8) и доводят до 100 см³. Полученный раствор хранению не подлежит.

4.20.3    Стандартный раствор пиридоксина (PN) I, р(Р1_) приблизительно 10 мкг/см³ Разбавляют 2 см³ исходного раствора пиридоксаля (см. 4.19.3) 0,1 моль/дм³ HCI (см. 4.8) и доводят до 100 см³. Полученный раствор хранению не подлежит.

4.20.4    Стандартный раствор пиридоксамина (PM) II, р(РМ) приблизительно 1 мкг/см³ Разбавляют 10 см³ исходного раствора пиридоксамина (см. 4.20.1) 0,1 моль/дм³ HCI (см. 4.8) и

доводят до 100 см³. Полученный раствор хранению не подлежит.

4.20.5    Стандартный раствор пиридоксаля (PL) II, p(PL) приблизительно 1 мкг/см³ Разбавляют 10 см³ стандартного раствора пиридоксаля (см. 4.20.2) 0,1 моль/дм³ HCI (см. 4.8) до

100 см³. Полученный раствор хранению не подлежит.

4.20.6    Стандартный раствор пиридоксина (PN) II, p(PL) приблизительно 1 мкг/см³ Разбавляют 10 см³ стандартного раствора пиридоксина (см. 4.20.3) 0,1 моль/дм³ HCI (см. 4.8) и

доводят до 100 см³. Полученный раствор хранению не подлежит.

4.20.7    Проверка хроматографической чистоты методом ВЭЖХ

Чистота образцов сравнения может быть проверена методом ВЭЖХ, как описано ниже: вводят соответствующие объемы PM, PL и PN стандартных растворов I (см. 4.20.1, 4.20.2, 4.20.3) в систему ВЭЖХ и анализируют, как установлено в 6.4.

Степень чистоты образцов сравнения R_h %, вычисляют по формуле

X. 100

X/ + В ’

где х₍ — площадь пика образца сравнения /;

В — сумма площадей пиков загрязняющих веществ (без пика растворителя).

Хроматографическая чистота образцов сравнения должна быть не менее 98 %, в ином случае используют новые образцы сравнения или готовят новые стандартные растворы.

4.21 Смешанный градуировочный раствор (например р(РМ, PL, PN) = 0,1 мкг/см³ до 10 мкг/см³)

Отбирают пипеткой подходящие объемы исходных растворов PM, PL и PN (см. 4.19.1—4.19.3) или стандартных растворов (см. 4.20.1—4.20.6) в мерную колбу вместимостью 20 см³ и при необходимости доводят 0,1 моль/дм³ HCI (см. 4.8) до объема 6,5 см³. Доводят pH до значения 4,8 ед. pH, используя раствор ацетата натрия молярной концентрацией 2,5 моль/дм³ (см. 4.5), а затем доводят pH до значения 3,0 ед. pH, используя серную кислоту (см. 4.10), объем содержимого в колбе доводят водой до метки и перемешивают (градуировочные растворы). Рекомендуется использовать не менее трех градуировочных точек. При необходимости допускается разбавление смешанных градуировочных растворов подвижной фазой до ввода в хроматограф.

ГОСТ EN 14663—2014

5    Оборудование

5.1    Общие положения

Используют общепринятое лабораторное оборудование, стеклянную посуду, вспомогательное оборудование и следующие средства измерений.

5.2    УФ-спектрофотометр, пригодный для измерения оптической плотности при определенных длинах волн.

5.3    Нагревательные приборы

Используют лабораторный автоклав и печь или водяную баню, оборудованные мешалками и позволяющие устанавливать температуру на уровне 37 °С.

5.4    Система для ВЭЖХ

Система для ВЭЖХ состоит из насоса, устройства для ввода проб, флуоресцентного детектора, обеспечивающего длину волны возбуждения 290 нм и длину волны регистрации 390 нм, интегратора или устройства для обработки данных, устройства для постколоночной дериватизации.

5.5    Колонки для ВЭЖХ

Используют обращенно-фазовую колонку со следующими характеристиками:

Luna™ RP С₁₈, 5 мкм³), размер частицы 5 мкм, диаметр 4,0 мм, длина 250 мм⁴). Другие примеры подходящих колонок для ВЭЖХ приведены в приложении В.

5.6    Устройства фильтровальные

Фильтрация подвижной фазы, а также раствора анализируемой пробы через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм перед использованием или вводом проб увеличит срок службы колонок.

6    Методика проведения испытания

6.1    Подготовка анализируемой пробы

Отбирают и гомогенизируют анализируемую пробу. Измельчают материал в соответствующем смесителе-мельнице и снова перемешивают. Чтобы не подвергать пробу воздействию высокой температуры в течение длительного периода времени, необходимо предварительно ее охладить. После гомогенизации пробу сразу анализируют.

6.2    Подготовка раствора анализируемой пробы

6.2.1    Экстракция

6.2.1.1    Общие положения

Из проб с высоким содержанием жира (более 25 %) следует удалить жир, например, путем обработки петролейным эфиром перед кислотным гидролизом.

Для обработки пенящихся материалов рекомендуется использование нескольких капель силиконового масла (см. 4.17).

Значение pH экстрагированного раствора должно быть приблизительно 1 ед. pH. В ином случае рекомендуется уменьшить массу пробы или использовать соляную кислоту с более высокой концентрацией [(например, 0,2 моль/дм^{5 6 7} (см. 4.9) или 1 моль/дм⁵ (см. 4.7)].

6.2.1.2    Экстракция из сухих продуктов (содержание воды менее 20 %; например, в крупах, сухом молоке, сушеных овощах)

Взвешивают от 1 до 10 г гомогенизированной анализируемой пробы (см. 6.1) с точностью до миллиграмма в конической колбе вместимостью 150 см⁵, добавляют 50 см⁵ 0,1 моль/дм⁵ соляной кислоты (см. 4.8), перемешивают и проверяют, чтобы значение pH составляло приблизительно 1 ед. pH.

Нагревают в автоклаве (см. 5.3) в течение 30 мин при температуре 120 °С, затем охлаждают до комнатной температуры, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³, объем содержимого в колбе доводят водой до 100 см³ (с возможным силиконовым слоем выше метки) и перемешивают.

Фильтруют или центрифугируют при 3000 об/мин аликвотную часть (приблизительно 50 см³) пробы, обработанной кислотой, и отбирают верхний слой в герметичные стеклянные емкости (данный раствор является экстрактом пробы).

6.2.1.3    Экстракция из продуктов с высоким содержанием влаги (более 20 %) и жидких продуктов (например, в мясе, овощах, соках)

Взвешивают от 2 до 40 г гомогенизированной пробы (см. 6.1) с точностью до миллиграмма в конической колбе вместимостью 150 см³, добавляют 10 см³ 1 моль/дм³ соляной кислоты (см. 4.7), доводят водой до приблизительно 50 см³, перемешивают и проверяют, чтобы значение pH составляло приблизительно 1 ед. pH.

Нагревают в автоклаве (см. 5.3) втечение 30 мин притемпературе 120 °С, затем охпаждаютдо комнатной температуры, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ и объем содержимого в кобле доводят водой до 100 см³ (с возможным силиконовым слоем выше метки) и перемешивают.

Фильтруют или центрифугируют при 3000 об/мин аликвотную часть (приблизительно 50 см³) пробы, обработанной кислотой, и отбирают верхний слой в герметичные стеклянные емкости (данный раствор является экстрактом пробы).

Примечание — Во время автоклавирования может произойти взаимное превращение различных форм витамина, например, путем трансаминирования. Это часто наблюдается в приготовленном мясе или в пробах с высоким содержанием свободных аминогрупп (см. [2], [7]).

6.2.2 Ферментативная обработка и этапы подготовки проб трансформации

Для проб пищевой продукции животного происхождения (свинина, молоко, рыба и т. д.), которые не содержат р-глюкозилированного связанного пиридоксина, ферментативная обработка р-глюкозидазой не является необходимой. Лабораторные эксперименты показывают, что результаты определения общего содержания витамина В₆ в пищевой продукции, полученные с применением и без применения р-глюкозидазы для ферментативной обработки, были приблизительно одинаковыми (см. [2], [7]).

Отбирают пипеткой 12,5 см³ экстракта пробы по 6.2.1.2, 6.2.1.3 в коническую колбу вместимостью 20 см³ и доводят pH до значения (4,8 ± 0,1) ед. pH, используя раствор ацетата натрия (см. 4.5). Добавляют 1 см³ раствора кислой фосфатазы (см. 4.13) и 1 см³ раствора р-глюкозидазы (см. 4.15) и перемешивают. Накрывают коническую колбу и инкубируют раствор в течение не менее 12 ч или в течение ночи при температуре 37 °С, постоянно перемешивая.

После охлаждения до комнатной температуры доводят pH до значения приблизительно 3 ед. pH, используя серную кислоту (см. 4.10), переливают отрегулированный раствор количественно в мерную колбу вместимостью 20 см³ и объем содержимого в колбе доводят до метки водой. Встряхивают и фильтруют через сухой складчатый бумажный фильтр, удаляют первые 5 см³ фильтрата.

Подготовленный раствор пробы хранят до 3 сут в холодильнике при температуре около 4 °С.

Перед хроматографическим анализом фильтруют аликвоту (приблизительно 2 см³) через мембранный фильтр (см. 5.6) и разбавляют подвижной фазой, если необходимо.

6.3    Подготовка «холостой» пробы

Отбирают пипеткой 12,5 см³ раствора соляной кислоты (см. 4.8) в коническую колбу вместимостью 20 см³ и доводят pH до значения (4,8 ± 0,1) ед. pH, используя раствор ацетата натрия молярной концентрацией 2,5 моль/дм³ (см. 4.5). Добавляют 1 см³ раствора кислой фосфатазы (см. 4.13) и 1 см³ раствора р-глюкозидазы (см. 4.15) и перемешивают. Инкубируют раствор в течение не менее 12 ч или в течение ночи при температуре 37 °С при постоянном перемешивании.

После охлаждения до комнатной температуры доводят pH до значения приблизительно 3 ед. pH, используя серную кислоту (см. 4.10), переливают количественно в мерную колбу вместимостью 20 см³, объем содержимого в колбе доводят водой до метки, встряхивают и фильтруют через сухой складчатый бумажный фильтр, удаляя первые 5 см³ фильтрата.

Перед хроматографическим анализом фильтруют аликвоту (приблизительно 2 см³) через мембранный фильтр (см. 5.6) и разбавляют подвижной фазой, если необходимо.

6.4    Условия хроматографического анализа

Эффективность системы ВЭЖХ должна обеспечивать разделение пиков PM, PL и PN друг от друга, а также от пиков всех других веществ пробы до базовой линии.

6

1

1)    U — данная единица измерения (международная или стандартная единица) определяется количеством фермента, который катализирует трансформацию 1 мкмоль субстрата в минуту при стандартных условиях.

²)    Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламой указанного продукта со стороны CEN. Допускается использовать аналогичную продукцию, если она позволяет получать сопоставимые результаты.

2

3

^ Luna™ — это пример продукта, доступного на рынке, поставляемого фирмой Phenomenex. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламой указанного продукта со стороны CEN. Допускается использовать аналогичную продукцию, если она позволяет получать сопоставимые результаты.

4

) Допускается использовать размеры частиц или колонок, которые отличаются от установленных в настоя

5

щем стандарте. Параметры разделения должны адаптироваться к таким материалам, чтобы гарантировать эквивалентные результаты. Критерий эффективности функционирования подходящих аналитических колонок является

6

базовым разрешением рассматриваемых веществ, определяемых при анализе.

7