МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ

(МГС)

INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION

(ISC)

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ

СТАНДАРТ

Продукты пищевые

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФУМОНИЗИНОВ В, И В₂ В ПРОДУКТАХ НА ОСНОВЕ КУКУРУЗЫ

Метод ВЭЖХ с применением иммуноаффинной колоночной очистки экстракта

(EN 14352:2004, ЮТ)

Издание официальное

Москва

Стандартинформ

2014

fOCTEN 14352—2013

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 — 92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные. правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены».

Сведения о стандарте

1    ПОДГОТОВЛЕН Открытым акционерным обществом «Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации» (ОАО «ВНИИС») при участии специалистов Государственного научного учреищения Всероссийского научно-исследовательского института консервной и овощесушильной промышленности Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИКОП Россельхозакадемии) на основе собственного аутентичного перевода на русский язык европейского регионального стандарта, указанного в пункте 4

2    ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (ТК 335)

3    ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 27 июня 2013 г. Ne 57-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны no МК (ИСО 3166) 004-97	Код страт по МК (ИСО 3166) 004-97	Сокращенное наименование наскального органа по стандартизации
Армения	AM	Минэкономики Республики Армения
Беларусь	BY	Госстандарт Республики Беларусь
Киргизия	KG	Кыргыэстандарт
Молдова	MD	Молдова-Стандарт
Россия	RU	Росстандарт
Узбекистан	UZ	Узстандарт

4    Настоящий стандарт идентичен европейскому региональному стандарту EN 14352:2004 «Foodstuffs — Determination of fumonisin В- and В; in maize based foods. HPLC method with immunoaffinity column clean up» (Продукты пищевые. Определение фумонизинов В, и В; в продуктах на основе кукурузы. Метод ВЭЖХ с применением иммуноаффинной колоночной очистки экстракта).

Перевод с английского языка (еп)

Официальный экземпляр европейского регионального стандарта, на основе которого подготовлен настоящий межгосударственный стандарт, имеется в Федеральном агентстве по техническому регулированию и метрологии Российской Федерации.

Степень соответствия — идентичная (IDT)

5    Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 08.11.2013 № 1515-ст межгосударственный стандарт ГОСТ EN 14352-2013 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2015 г.

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

fOCTEN 14352—2013

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а люкст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

© Стандартинформ, 2014

В Российской Федерации настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен. тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

TOCTEN 14352—2013

Содержание

1    Область применения.....................................................................................................................................1

2    Нормативные ссылки....................................................................................................................................1

3    Сущность метода...........................................................................................................................................1

4    Реактивы..........................................................................................................................................................1

5    Аппаратура.....................................................................................................................................................3

6    Отбор проб.....................................................................................................................................................4

7    Процедура проведения испытания..............................................................................................................4

8    Обработка результатов.................................................................................................................................6

9    Презиционность.............................................................................................................................................7

10    Протокол испытаний....................................................................................................................................8

Приложение А (справочное) Данные по прецизионности метода...............................................................9

Приложение В (справочное) Типичные хроматограммы............................................................................12

Библиография.................................................................................................................................................14

IV

fOCTEN 14352—2013

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ

Продукты пищевые ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФУМОНИЗИНОВ В, И В₂ В ПРОДУКТАХ НА ОСНОВЕ КУКУРУЗЫ Метод ВЭЖХ с применением иммуноаффинной колоночной очистки экстракта

Foodstuffs.

Determination of fumonisins В, and B₂ in maize based foods.

HPLC method with immunoaffinity column clean up

Дата введения — 2015—07—01

1    Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод определения фумонизинов В, и В., в пищевых продуктах на основе кукурузы с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с применением очистки экстракта на колонке с иммуноаффинным сорбентом (1). (2). (3).

Метод прошел валидацию путем межлабораторных испытаний, выполненных в соответствии с Руководством АОАС по процедуре проведения межлабораторных испытаний (4] для определения характеристик эффективности метода анализа. Объектами испытаний были пробы кукурузной муки и хлопьев с содержанием фумонизина В- в диапазоне от 323 до 1414 мкт/кт и фумонизина В_: в диапазоне от 90 до 558 мкг/кг.

2    Нормативные ссылки

Приведенные ниже ссылочные нормативные документы являются обязательными для применения настоящего стандарта. Датированные ссылки предполагают возможность использования только указанного издания документа В случае недатированных ссылок используют последнее издание документа. включая все дополнения

EN ISO 3696 Water for analytical laboratory use — Specification and test methods (ISO 3696:1987) (Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы испытаний)

3    Сущность метода

Фумонизины экстрагируют из пробы смесью воды, метанола и ацетонитрила. Экстракт фильтруют и подвергают очистке на колонке с иммуноаффинным сорбентом Фумонизины элюируют метанолом. элюат выпаривают, сухой остаток перерастворяют в смеси ацетонитрила с водой с добавлением ортофталевого диальдегида и 2-меркаптоэтанола для получения флуоресцирующих производных фумонизинов. Количественное определение фумонизинов проводят методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с применением аналитической колонки с обращенно-фазовым сорбентом и флуориметрического детектирования.

4    Реактивы

4.1 Общие положения

Для проведения анализа при отсутствии особо оговоренных условий используют только реактивы гарантированной аналитической чистоты и дистиллированную воду или воду не ниже первой сте-

Издание официальное

rOCTEN 14352—2013

пени чистоты по EN ISO 3696. Используемые растворители по степени чистоты должны быть пригодны для применения в анализе с помощью ВЭЖХ.

4.2    Метанол.

4.3    Ацетонитрил.

4.4    Кислота ортофосфорная объемной долей <р (НэР0₄) = 85 %.

4.5    Ортофталевый диальдегид.

4.6    2-Меркаптоэтанол.

4.7    Натрий фосфорнокислый однозамещенный, раствор концентрации с (NaH₂P0₄ • 2Н?0)

= 0,1 моль/дм³

Раствор готовят растворением 15,6 г однозамещенного фосфата натрия (NaH_:P0₄ • 2Н_гО) в 1 дм³ воды.

4.8    Натрий тетраборнокислый, раствор концентрации с (Na₂B₄0₂- ЮН₂0) = 0,1 моль/дм³

Раствор готовят растворением 3.8 г тетрабората натрия (Na_:B₄0₇ • ЮН_:0) в 100 см³ воды.

4.9    Натрий хлористый.

4.10    Натрий фосфорнокислый двухзамещенный (Na₇HP0₄).

4.11    Калий фосфорнокислый однозамещенный (КН;Р0₄).

4.12    Калий хлористый.

4.13    Кислота соляная концентрированная.

4.14    Экстрагент

Экстрагент готовят смешиванием 25 объемных частей ацетонитрила по 4.3. 25 объемных частей метанола по 4 2 и 50 объемных частей воды.

4.15    Смесь водно-ацетонитрильная объемной долей ацетонитрила p(CHjCN) = 50 %

Смешивают 50 объемных частей ацетонитрила по 4.3 с 50 объемными частями воды.

4.16    Раствор фосфатно-хлоридный буферный

Растворяют 8.0 г хлористого натрия по 4.9. 1.2 г двухзамещенного фосфорнокислого натрия по 4.10. 0.2 г однозамещенного фосфорнокислого калия по 4.11 и 0.2 г хлористого калия по 4.12 в 990 см воды. Значение pH приготовленного раствора доводят до 7,0 ед. pH добавлением соляной кислоты по 4.13, после чего объем раствора доводят водой до 1 дм В качестве альтернативы допускается использовать доступные для приобретения таблетированный препарат или готовый раствор.

4.17    Колонка с иммуноаффинным сорбентом

Для проведения испытания пригодна колонка с иммуноаффинным сорбентом, содержащим иммобилизованные антитела, специфичные в отношении фумонизинов В, и В:, имеющая общую сорбционную емкость по отношению к фумонизинам не менее 5 мкг и обеспечивающая полноту обнаружения не менее 90 % при внесении в нее 5 мкг фумонизинов В, и В: в смеси метанола или ацетонитрила с фосфатно-хлоридным буферным раствором, при этом объемная доля метанола или ацетонитрила не должна превышать 10 %. Перед использованием колонку выдерживают до достижения ею комнатной температуры.

4.18    Подвижная фаза для ВЭЖХ

Смешивают 77 объемных частей метанола по 4.2 с 23 объемными частями раствора однозамещенного фосфорнокислого натрия по 4.7. Значение pH полученного раствора доводят до 3.35 добавлением ортофосфорной кислоты по 4.4. Подвижную фазу фильтруют через мембранный фильтр по 5.14.

При необходимости проводят корректировку состава подвижной фазы применительно к свойствам аналитической колонки для ВЭЖХ.

4.19    Реактив для дериватизации фумонизинов

Растворяют 40 мг ортофталевого диальдегида по 4.5 в 1 см³ метанола по 4.2. Добавляют 5 см" раствора тетраборнокислого натрия по 4 8 и 50 мм³ 2-меркаптоэтанола по 4 6. полученный раствор перемешивают.

rOCTEN 14352—2013

Срок годности реактива для дериватиэации — 1 неделя при хранении при комнатной температуре в темном месте в укупоренном сосуде темного стекла

4.20    Фумонизины В, и В₂, основные растворы

Готовят основные растворы фумонизина В- и фумонизина В_: в водно-ацетонитрильной смеси по 4.15 массовой концентрации 50 мкг/см¹. Основные растворы фумонизинов хранят при температуре около 4 °С, при этом срок их годности составляет не менее 6 мес.

4.21    Фумонизины В, и В₂, смешанный основной раствор

В мерную колбу вместимостью 5 см¹ помещают 1000 мм основного раствора фумонизина В. и 500 мм основного раствора фумонизина В₂. Объем содержимого в колбе доводят до метки водноацетонитрильной смесью по 4.15, после чего содержимое колбы тщательно перемешивают. Массовая концентрация фумонизина В, в полученном растворе составляет 10 нг/мм¹. фумонизина В₂ — 5 нг/мм¹. Раствор хранят при температуре 4 °С. при этом срок его годности составляет не менее 6 мес. Допускается готовить смешанный основной раствор фумонизинов в меньшем объеме.

4.22    Фумонизины В, и В₂, смешанные градуировочные растворы

Градуировочные растворы смеси фумонизинов В, и В_: готовят в мерных колбах вместимостью 5 см в соответствии с таблицей 1. Объем содержимого в колбах доводят до метки водноацетонитрильной смесью по 4.15, содержимое колб тщательно перемешивают. Градуировочные растворы хранят при температуре 4 °С, при этом срок их годности составляет не менее 6 мес. Допускается готовить градуировочные растворы фумонизинов в меньшем объеме.

Таблица 1 — Приготовление градуировочных растворов смеси фумонизинов Bi и В2

Раствор Объем смешанного основного раствора фумонизинов. взятый для приготовления градуировочного раствора. мм3 Объем водноацетонитрильной смеси. использованный для приготовления градуировочного раствора. мм3 Массовая концентрация фумоииэ**^ В. в градуировочном растворе. нг/мм3 Массовая концентрация фумонизина Вт в градуировочном растворе. к/мм3 1 50 4950 0,10 0,050 2 125 4875 0,25 0,125 3 500 4500 1,00 0.500 4 1000 4000 2,00 1.000

5 Аппаратура

5.1    Общие положения

При проведении испытания используют общеупотребительные лабораторную посуду и оборудование, в частности, перечисленные ниже.

5.2    Встряхиватель лабораторный орбитальный.

5.3    Пробирки центрифужные вместимостью 250 см ' с винтовыми пробками.

5 4 Центрифуга лабораторная, обеспечивающая центробежное ускорение 2500д.

5.5    Фильтры бумажные диаметром пор от 20 до 25 мкм.

5.6    Фильтры стекловолоконные диаметром пор 11 мкм.

5.7    Резервуары для элюента вместимостью 25 см¹, снабженные адаптерами для соединения с иммуноаффинными колонками.

5.8    Микрошприцы или микропипетки градуированные вместимостью от 25 до 1000 мм¹.

5.9    Весы лабораторные, пригодные для взвешивания с точностью до 0,01 г.

5.10    Весы аналитические, пригодные для взвешивания с точностью до 0,1 мг.

rOCTEN 14352—2013

5.11    Устройство для вакуумной фильтрации многопозиционное, приспособленное для установки иммуноаффинных колонок (манифолд).

5.12    Устройство перемешивающее (миксер) типа Вортекс.

5.13    Устройство для выпаривания растворителей, снабженное нагревателем, или аналогичное.

5.14    Фильтры мембранные для водных растворов диаметром пор 0.45 мм³.

5.15    Система для ВЭЖХ в указанной ниже комплектации:

5.15.1    Насос для подачи подвижной фазы изократический, пригодный для создания постоянной скорости потока 1 см³/мин.

5.15.2    Инжектор, обеспечивающий объем ввода 20 мм³.

5.15.3    Колонка для ВЭЖХ аналитическая, заполненная обращенно-фазовым сорбентом, например, с привитыми октадецильными группами (ODS), обеспечивающая отделение пиков фумонизинов от сопутствующих пиков на уровне базовой линии, со следующими характеристиками:

материал корпуса — нержавеющая сталь:

длина колонки — 150 мм;

внутренний диаметр колонки — 4,6 мм;

диаметр частиц сорбента — 5 мкм;

защитная колонка, заполненная подходящим обращенно-фазовым сорбентом.

5.15.4    Детектор флуориметрический. снабженный проточной кюветой, позволяющий проводить измерения при длине волны возбуждения 335 нм и длине волны эмиссии 440 нм. обеспечивающий предел обнаружения фумонизинов В- и В; не менее 0.5 нг при отношении уровня аналитического сигнала к уровню шума равном 3.

5.15.5    Компьютерная система обработки данных.

6    Отбор проб

Необходимо, чтобы проба, поступающая в лабораторию, была представительной и не была испорчена при транспортировании или хранении.

7    Процедура проведения испытания

7.1    Подготовка пробы

Пробу измельчают до частиц, проходящих через сито размером ячеек 1 мм. Измельченную пробу перемешивают до гомогенного состояния.

7.2    Экстракция

Пробу для анализа массой 20 г. измеренной с точностью до 0.1 г. помещают в центрифужную пробирку по 5.3. В пробирку добавляют 50 см³ экстрагента по 4.14 Пробирку укупоривают, после чего встряхивают в течение 20 мин с использованием орбитального встряхивателя по 5.2. По окончании встряхивания содержимое пробирки центрифугируют в течение 10 мин при центробежном ускорении 2500 д. Центрифугат фильтруют через бумажный фильтр по 5.5. при этом следят, чтобы осадок не попадал на фильтр. Осадок в центрифужной пробирке подвергают повторной экстракции, для чего в пробирку вносят новую порцию экстрагента объемом 50 см³. Содержимое пробирки снова встряхивают в течение 20 мин. затем центрифугируют в течение 10 мин при центробежном ускорении 2500 д. Центрифугат фильтруют через бумажный фильтр, фильтрованные экстракты объединяют.

Пипеткой отбирают аликвоту объединенного экстракта объемом 10.0 см' и помещают ее в колбу вместимостью 100 см В колбу добавляют 40 см фосфат но-хлоридного буферного раствора по 4.16. содержимое колбы тщательно перемешивают и фильтруют через стекловолоконный фильтр по 5.6. Для дальнейшей очистки на иммуноаффинной колонке отбирают аликвоту фильтрата объемом 10 см³, эквивалентную 0.4 г пробы.

7.3    Очистка экстракта на колонке с иммуноаффинным сорбентом

Из входного отверстия колонки удаляют пробку и соединяют колонку с резервуаром для элюен-та по 5.7. Далее из выходного отверстия колонки удаляют пробку и присоединяют колонку к вакуумному манифолду по 5.11. В резервуар колонки пипеткой вносят аликвоту экстракта объемом 10 см ’ и пропускают ее через колонку со скоростью одна — две капли в секунду, элюат отбрасывают. Далее ²

rOCTEN 14352—2013

колонку промывают, пропуская через нее 10.0 см' фосфатно-хлоридного буферного раствора по 4.16 со скоростью одна — две капли в секунду до тех пор. пока колонка не заполнится воздухом, промывной элюат отбрасывают. Фумонизины элюируют порцией метанола по 4.2 объемом 1,5 см³ со скоростью не более одной капли в секунду, элюат собирают во флакон вместимостью 4 см³. Собранный элюат выпаривают досуха с помощью устройства по 5.13 в токе азота при температуре не более 60 °С. До проведения дериватизации и хроматографического анализа сухой остаток хранят при температуре около 4 °С.

7.4 Дериватизация

7.4.1 Дериватизация фумонизинов в градуировочных растворах

Дериватизацию проводят непосредственно перед хроматографическим анализом градуировочных растворов. На дно пробирки небольшой вместимости помещают 50 мм³ градуировочного раствора смеси фумонизинов Bi и В; и 50 мм³ реактива для дериватизации по 4.19. Содержимое пробирки интенсивно перемешивают в течение 30 с с помощью миксера типа Вортекс по 5.12, после чего полученный раствор анализируют методом ВЭЖХ по 7.5.2. При этом для всех градуировочных растворов соблюдают равные промежутки времени с момента внесения реактива для дериватизации до момента хроматографического анализа, которые, однако, не должны превышать 3 мин. Допускается проводить дериватизацию с использованием автоматизированной системы. Массовая концентрация фумонизинов в градуировочных растворах после дериватизации указана в таблице 2.

Таблица 2 — Массовая концентрация фумонизинов в градуировочных растворах после дериватизации

Градуирово^ый раствор Массовая концентрация фумомиэина Bi в градуирово^ом растворе. нг/мм5 Массовая концентрация фумомиэина В: в градуировочном растворе. нг/мм5 1 0.050 0.025 2 0.125 0.063 3 0.500 0,250 4 1,000 0,500

7.4.2 Приготовление раствора пробы для хроматографического анализа

Дериватизацию фумонизинов в растворе пробы проводят непосредственно перед его хроматографическим анализом. Сухой остаток, полученный после очистки экстракта по 7.3, растворяют в 200 мм водно-ацетонитриль-ной смеси по 4.15. Аликвоту полученного раствора объемом 50 мм³ помещают непосредственно на дно пробирки небольшой вместимости. В пробирку добавляют 50 мм³ реактива для дериватизации по 4 19. Содержимое пробирки интенсивно перемешивают с помощью миксера типа Вортекс по 5.12. после чего полученный раствор анализируют с помощью ВЭЖХ по 7.5.3. При этом для серии растворов проб соблюдают равные промежутки времени с момента внесения реактива для дериватизации до момента хроматографического анализа, которые, однако, не должны превышать 3 мин.

7.5 Анализ с помощью ВЭЖХ

7.5.1 Условия хроматографического анализа

Приведенные ниже параметры обеспечивают удовлетворительное качество хроматографического анализа (см. рисунок А.1. приложение А) при использовании аналитической колонки по 5.15.3 внутренним диаметром 4.6 мм. длиной 150 мм и диаметром частиц сорбента 5 мкм. а также подвижной фазы по 4.18.

Скорость подачи подвижной фазы — 1.0 см³/мин.

Параметры работы флуориметрического детектора: длина волны возбуждения 335 нм. длина волны эмиссии 440 нм.

Объем инжекции анализируемых растворов — 20 мм³. ³

rOCTEN 14352—2013

7.5.2    Анализ градуировочных растворов

Градуировку по фумонизинам Bi и В_: осуществляют ежедневно перед анализом растворов проб или при изменении условий хроматографического анализа. Для этого проводят хроматографический анализ приготовленных по 7.4.1 градуировочных растворов при объеме инжекции 20 мм Для всех градуировочных растворов соблюдают равные промежутки времени с момента внесения реактива для дериватизации по 4.19 до момента хроматографического анализа, не превышающие 3 мин. Коэффициент вариации площади пиков фумонизинов В- и В:, рассчитанный по результатам 10 повторных анализов градуировочного раствора смеси фумонизинов № 3 по таблице 1. не должен превышать 5 %.

7.5.3    Анализ растворов проб

Проводят хроматографический анализ растворов проб по 7.4.2 при объеме инжекции 20 мм ', соответствующем 0,02 г пробы. При анализе серии растворов проб соблюдают равные промежутки времени с момента внесения реактива для дериватизации по 4.19 до момента хроматографического анализа, не превышающие 3 мин.

7.5.4    Идентификация пиков

Пики фумонизинов В- и В: на хроматограмме раствора анализируемой пробы идентифицируют по совпадению их времени удерживания со временем удерживания пиков фумонизинов В- и В; на хроматограмме градуировочного раствора. При возникновении сомнений в правильности идентификации пики фумонизинов на хроматограмме раствора пробы идентифицируют путем ее сопоставления с хроматограммой раствора пробы с добавлением градуировочного раствора фумонизинов.

7.5.5    Количественное определение

Количественное определение фумонизинов проводят методом внешнего стандарта, для чего определяют площадь или высоту пика фумонизина на хроматограмме раствора анализируемой пробы и сопоставляют ее с градуировочным графиком. При этом диапазон массовых концентраций фумонизинов. в котором построен градуировочный график, должен находиться в пределах его линейной области, которую устанавливают методом регрессионного анализа.

Объем инжекции раствора пробы для анализа должен быть равен объему инжекции градуировочных растворов, использованных при построении градуировочного графика.

Если величина пика фумонизина на хроматограмме раствора пробы для анализа превышает верхнюю границу диапазона градуировки, проводят дериватизацию и хроматографический анализ нового раствора анализируемой пробы, приготовленного путем дополнительного разбавления очищенного экстракта водно-ацетонитрильной смесью по 4.15.

Примечания:

1    Необходимо соблюдать равные промежутки времени, не превышающие 3 мин, с момента внесения реактива для дериватизации по 4.19 до момента хроматографического анализа градуировочного раствора или раствора анализируемой пробы, поскольку по истечении 3 мин интенсивность флуоресценции производных фумонизинов ослабевает с нарастающей скоростью

2    Пределы обнаружения и количественного определения фумонизинов существенно варьируют в зависимости от чувствительности используемого детектора Для большинства современных моделей детекторов достижимы пределы количественного определения фумонизинов Bi и В; 50 мкг/кг при отношении уровня аналитического сигнала к уровню шума, равном 6

3    Типичные хроматограммы кукурузной муки и хлопьев, загрязненных фумонизинами естественным путем, представлены в приложении В

8 Обработка результатов

По градуировочному графику определяют массу фумонизина В- и фумонизина В_:. нг. соответствующую площади пика фумонизина на хроматограмме раствора пробы

Содержание кахщого фумонизина в пробе, w. мкг/кг. рассчитывают по формуле

ro_a у, D

W V,

где т_а — масса фумонизина в инжектированной аликвоте раствора пробы, нг;

V, — объем раствора пробы для анализа после дериватизации, мм³ (V, - 100 мм³); ⁴

1

2

3

4