МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ

(МГС)

INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION

(ISC)

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ

СТАНДАРТ

Продукты пищевые

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФУМОНИЗИНОВ В₁ И В₂ В КУКУРУЗЕ

Метод ВЭЖХ с применением очистки экстракта методом твердофазной экстракции

(EN 13585:2001, ЮТ)

Издание официальное

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 - 92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены»

Сведения о стандарте

1    ПОДГОТОВЛЕН Открытым акционерным обществом «Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации» (ОАО «ВНИИС») при участии специалистов Государственного научного учреждения Всероссийского научно-исследовательского института консервной и овощесушильной промышленности Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИКОП Россельхозакадемии) на основе собственного аутентичного перевода на русский язык европейского регионального стандарта, указанного в пункте 4

2    ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (ТК 335)

3    ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 27 июня 2013 г. № 57-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97 Код страны по МК(ИСО 3166) 004-97 Сокращенное наименование национального органа по стандартизации Армения AM Минэкономики Республики Армения Беларусь BY Госстандарт Республики Беларусь Киргизия KG Кыргызстандарт Молдова MD Молдова-Стандарт Россия RU Росстандарт Узбекистан UZ Узстандарт

4    Настоящий стандарт идентичен европейскому региональному стандарту EN 13585:2001 «Foodstuffs. Determination of fumonisins Bi and B? in maize. HPLC method with solid phase extraction clean-up» (Продукты пищевые. Определение фумонизинов В, и В; в кукурузе. Метод ВЭЖХ с применением очистки экстракта методом твердофазной экстракции).

Перевод с английского языка (ел).

Официальный экземпляр европейского регионального стандарта, на основе которого подготовлен настоящий межгосударственный стандарт, имеется в Федеральном агентстве по техническому регулированию и метрологии Российской Федерации.

Степень соответствия - идентичная (IDT)

5    Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 31 октября 2013 г. № 1294-ст межгосударственный стандарт ГОСТ EN 13585-2013 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2015 г.

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

fOCTEN 13585—2013

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе *Национальные стандарты», а текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе • Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе *Национальные стандарты» Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

О Стандартинформ. 2014

В Российской Федерации настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

TOCTEN 13585—2013 СТА Н Д А Р Т

Продукты пищевые ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФУМОНИЗИНОВ В, И В₂ В КУКУРУЗЕ Метод ВЭЖХ с применением очистки экстракта методом твердофазной экстракции

Foodstuffs

Determination of fumomsms Bi and B; in maize HPLC method with solid phase extraction clean-up

Дата введения - 2015-07-01

1    Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод определения фумонизинов Bi и В_: в кукурузе с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Метод прошел валидацию путем межлабораторных испытаний, выполненных в соответствии с Руководством АОАС по процедуре проведения межлабораторных испытаний (1). Объектом испытаний были пробы кукурузы с содержанием фумонизина В- в диапазоне от 405 до 6732 мкг/кг и фумонизина В- в диапазоне от 152 до 2619 мкг/кг. Метод пригоден для определения фумонизинов в зерне кукурузы или продуктах его первичной переработки (например, сырой, сушеной и молотой кукурузе), но не обеспечивает получение достоверных результатов при испытании большинства продуктов на основе кукурузы.

2    Нормативные ссылки

Приведенные ниже ссылочные нормативные документы являются обязательными для применения настоящего стандарта. Датированные ссылки предполагают возможность использования только указанного издания документа. В случае недатированных ссылок используют последнее издание документа, включая все дополнения.

EN ISO 3696 Water for analytical laboratory use - Specification and test methods (ISO 3696:1987) (Вода для лабораторного анализа, Технические требования и методы испытаний).

3    Сущность метода

Фумонизины экстрагируют из пробы кукурузы смесью метанола и воды. Экстракт фильтруют и подвергают очистке методом твердофазной экстракции на патроне с сильным анионообменным сорбентом. Фумонизины элюируют смесью метанола с уксусной кислотой, элюат выпаривают, сухой остаток перерастворяют в смеси метанола с водой с добавлением ортофталевого диальдегида и 2-меркаптоэтанола для получения флуоресцирующих производных фумонизинов. Количественное определение фумонизинов проводят методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с применением аналитической колонки с обращенно-фазовым сорбентом и флуориметрического детектирования

ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ - Фумонизины являются гепатотоксичными, нефротоксичными и канцерогенными веществами в отношении крыс и мышей. Их воздействие на человека окончательно не установлено. Следует соблюдать соответствующие меры предосторожности при обращении с фумонизинами. Любое лабораторное оборудование, контактировавшее с фумонизинами, следует промыть раствором гипохлорита натрия массовой долей 5 %.

4    Реактивы и материалы

4.1 Общие положения

Для проведения испытания при отсутствии особо оговоренных условий используют только реактивы гарантированной аналитической чистоты и дистиллированную воду или воду не ниже первой степени чистоты по EN ISO 3696. Испопьзуемые растворители по степени чистоты должны быть пригодны для применения в анализе с помощью ВЭЖХ.

4.2    Метанол.

4.3    Смесь водно-метанольмая объемной долей метанола <p (CHjOH) = 75 %

Смешивают 75 объемных частей метанола по 4.2 с 25 объемными частями воды.

4.4    Смесь водно-ацетонитрильная объемной долей ацетонитрила <p (CHjCN) = 50 %

Смешивают 50 объемных частей ацетонитрила с 50 объемными частями воды.

4.5    Кислота ортофосформая объемной долей <р (Н₃Р0₄) = 85 %.

4.6    Смесь метанола и уксусной кислоты объемной долей уксусной кислоты р (CHjCOOH) = 1 % для элюирования фумонизинов при твердофазной экстракции

Смешивают 99 объемных частей метанола по 4.2 с 1 объемной частью ледяной уксусной кислоты.

4.7    Ортофталевый диальдегид.

4.8    2-Меркаптоэтанол.

4.9    Натрий фосфорнокислый однозамещенный, раствор молярной концентрации с (NaH₂P0₄ • 2Н₂0) = 0,1 моль/дм³

Раствор готовят растворением 15.6 г однозамещенного фосфата натрия (NaH_:P0₄ • 2Н_гО) в 1 дм³ воды.

4.10    Натрий тетраборнокислый, раствор молярной концентрации с (Na₂B₄0₂ - ЮН₂0) = 0,1 моль/дм³

Раствор готовят растворением 3.8 г тетрабората натрия (Na_:B.,0- 10Н_;О) в 100 см ' воды.

4.11    Натрия гидроксид, раствор молярной концентрации с (NaOH) = 0,1 моль/дм³

Раствор готовят растворением 0.4 г гидроксида натрия (NaOH) в 100 см воды.

4.12    Подвижная фаза для ВЭЖХ

Смешивают 77 объемных частей метанола по 4.2 с 23 объемными частями раствора однозамещенного фосфорнокислого натрия по 4.9. Значение pH полученного раствора доводят до 3.35 ед. pH добавлением ортофосфорной кислоты по 4.5. Подвижную фазу фильтруют через мембранный фильтр по 5.7.

При необходимости проводят корректировку состава подвижной фазы применительно к свойствам аналитической колонки для ВЭЖХ.

4.13    Реактив для дериватизации фумонизинов

Растворяют 40 мг ортофталевого диальдегида по 4.7 в 1 см³ метанола по 4,2. Добавляют 5 см³ раствора тетраборнокислого натрия по 4.10 и 50 мм 2-меркалтоэтанола по 4.8. полученный раствор перемешивают. Срок годности реактива для дериватизации - одна неделя при хранении при комнатной температуре в темном месте в укупоренном сосуде темного стекла.

4.14    Фумонизины Bi и В₂, градуировочный раствор

Готовят основные растворы фумонизина В, и фумонизина В₂ по отдельности в водноацетонитрильной смеси по 4 4 массовой концентрации 250 мкг/см³. Допускается использовать доступные для приобретения готовые растворы фумонизинов.

Порцию каждого основного раствора объемом 100 мм³ переносят в стеклянный флакон, затем добавляют 300 мм водно-ацетонитрильной смеси. Получают градуировочный раствор смеси фумонизинов В- и В; объемом 500 мм массовой концентрации каждого фумонизина 50 мкг/см . Если предполагается проведение градуировки с помощью градуировочного графика, готовят несколько градуировочных растворов. Для этого порции каждого основного раствора различного объема (например, 20. 50.100 и 200 мм³) разбавляют водно-ацетонитрильной смесью до объема 500 мм³.

Стандартные растворы фумонизинов хранят при температуре около 4 °С. при этом срок их годности составляет не менее 6 мес. ¹

fOCTEN 13585—2013

диаметр частиц сорбента - 5 мкм;

защитная колонка, заполненная подходящим обращенно-фазовым сорбентом.

Допускается использовать колонки других размеров.

5.1.3    Детектор флуориметрический, позволяющий проводить измерения при длине волны возбуждения 335 нм и длине волны эмиссии 440 нм.

5.1.4    Компьютерная система обработки данных.

5.2    Блендер, гомогенизатор или миксер лабораторные.

5.3    Бумага фильтровальная.

5.4    Колонка для твердофазной экстракции, заполненная сильным анионообменным сорбентом, например, патрон SAX Bond-Elut^{2 3}, содержащий 500 мг сорбента, или аналогичный.

5.5    Устройство для твердофазной экстракции многопозиционное, (манифолд).

5.6    Устройство для выпаривания растворителей (испаритель), снабженное нагревателем, или аналогичное.

5.7    Фильтры мембранные для фильтрации водных растворов размером пор 0.45 мкм.

6    Отбор проб

Необходимо, чтобы проба, поступающая в лабораторию, была представительной и не была испорчена при транспортировании или хранении.

7    Подготовка проб

Пробу измельчают до частиц, проходящих через сито размером ячеек 1.0 мм. Измельченную пробу перемешивают до гомогенного состояния.

8    Процедура проведения испытания

8.1    Экстракция

50 г пробы для анализа помещают в подходящий стеклянный или пластиковый сосуд (например, пластиковую центрифужную пробирку вместимостью 250 см⁴). В сосуд добавляют 100 см' водно-метанольной смеси по 4.3. после чего пробу для анализа диспергируют с помощью блендера по 5.2 при скорости вращения диспергирующего элемента около 10000 мин². Время, необходимое для полного экстрагирования, зависит от типа используемого оборудования.

Диспергированную пробу центрифугируют в течение 10 мин при центробежном ускорении 500 д. Центрифугат фильтруют через бумажный фильтр по 5.3. Измеряют значение pH фильтрата, при необходимости его корректируют добавлением раствора гидроксида натрия по 4.11 до достижения значения в диапазоне от 5.8 до 6.5 ед. pH.

8.2    Очистка экстракта

Патрон для твердофазной экстракции по 5.4 устанавливают в манифолд по 5.5. Через патрон пропускают 5 см⁴ метанола по 4 2. затем 5 см⁴ водно-метанольной смеси по 4.3. Далее через патрон пропускают аликвоту экстракта объемом 10 см⁴ при скорости потока не более 2 см⁴/мин. после чего патрон промывают сначала 8 см водно-метанольной смеси по 4.3, затем 3 см⁴ метанола по 4 2, не допуская при этом попадания воздуха в слой сорбента. Промывной элюат отбрасывают. Фумонизины элюируют 10 см ' смеси метанола с уксусной кислотой по 4 6 при скор2!йи потока не более 1 см '/мин. элюат собирают в емкость подходящей вместимости.

Элюат переносят из емкости для сбора во флакон подходящей вместимости и выпаривают досуха в токе азота при температуре около 60 X при помощи испарителя по 5.6. Емкость для сбора элюата ополаскивают 1 см⁴ метанола по 4.2, смыв переносят во флакон для выпаривания, растворитель выпаривают досуха в токе азота, обеспечивая при этом полное удаление уксусной кислоты. По окончании выпаривания флакон укупоривают. До проведения хроматографического анализа сухой остаток хранят при температуре около 4 X. при этом срок его годности составляет две недели.

8.3    Дериватизация и количественное определение

8.3.1 Дериватизация и хроматографический анализ градуировочных растворов

На дно пробирки небольшой вместимости помещают 25 мм⁴ градуировочного раствора смеси фумонизинов В- и В; по 4 14 и 225 мм реактива для дериватизации по 4.13. Содержимое пробирки

интенсивно перемешивают, после чего полученный раствор анализируют с помощью ВЭЖХ с использованием аналитической колонки по 5.1.2 при объеме инжекции 10 мм³, эквивалентном 0.050 мкг каждого фумонизина. При градуировке по нескольким градуировочным точкам для всех градуировочных растворов соблюдают равные промежутки времени с момента внесения реактива для дериватизации до момента хроматографического анализа, которые, однако, не должны превышать 3 мин. При градуировке по одной градуировочной точке устанавливают такую чувствительность флуориметрического детектора по 5.1.3, при которой высота пиков фумонизинов при анализе градуировочного раствора находится на уровне 80 % шкалы регистрирующего устройства.

8.3.2 Дериватизация и хроматографический анализ экстракта из кукурузы

Сухой остаток, полученный после очистки экстракта по 8.2. растворяют в 200 мм метанола по 4 2. Для растворения сухого остатка также допускается использовать водно-ацетонитрильную смесь по 4 4 Аликвоту полученного раствора объемом 25 мм³ помещают непосредственно на дно пробирки небольшой вместимости. В пробирку добавляют 225 мм³ реактива для дериватизации по 4.13. Содержимое пробирки перемешивают, после чего полученный раствор анализируют с помощью ВЭЖХ с использованием аналитической колонки по 5.1.2 при объеме инжекции 10 мм³. При этом для каедого раствора в серии растворов проб соблюдают равные промежутки времени с момента внесения реактива для дериватизации до момента хроматографического анализа, которые, однако, не должны превышать 3 мин.

Если величина пика фумонизина на хроматограмме раствора пробы превышает величину соответствующего пика на хроматограмме градуировочного раствора или верхнюю границу диапазона построения градуировочного графика по 4.14, проводят дериватизацию и хроматографический анализ нового раствора пробы, приготовленного путем дополнительного разбавления очищенного экстракта метанолом по 4.2.

Примечания

1    Необходимо соблюдать равные промежутки времени, не превышающие 3 мин. с момента внесения реактива для дериватизации по 4 13 до момента хроматографического анализа градуировочного раствора или раствора пробы, поскольку по истечении 4 мин интенсивность флуоресценции производных фумонизинов ослабевает с нарастающей скоростью

2    Пределы обнаружения и количественного определения фумонизинов существенно варьируют в зависимости от чувствительности используемого детектора Для большинства современных моделей детекторов достижимы пределы обнаружения фумонизинов Bi и Вг 5 мкг/кг при отношении уровня аналитического сигнала к уровню шума, равном 3.

3    Типичная хроматограмма представлена в приложении А

9 Обработка результатов

Массу каждого фумонизина т,, в инжектированной аликвоте раствора пробы, мкг, рассчитывают по формуле

(1)

где т_я - масса фумонизина в инжектированной аликвоте градуировочного раствора, мкг. рассчитанная, исходя из массовой концентрации градуировочного раствора (т_я = 0.05 мкг для кахщого фумонизина);

Р, - величина пика фумонизина на хроматограмме раствора пробы, в единицах площади

или высоты;

P_s - величина пика фумонизина на хроматограмме стандартного раствора, в единицах площади или высоты;

Содержание каждого фумонизина в пробе, и/, мг/кг, рассчитывают по формуле

где V, - объем раствора пробы для анализа после дериватизации. мм³ (У. = 250 мм³);

О - коэффициент, учитывающий разбавление раствора пробы для анализа, если таковое имело место;

W - масса пробы для анализа, эквивалентная аликвоте экстракта, взятой для дериватизации (W = 0.625 г при объеме аликвоты экстракта, взятом для дериватизации. равном 25 мм³);

V, - объем инжекции раствора пробы для анализа, мм ' (V, = 10 мм³).

fOCTEN 13585—2013

При градуировке методом построения градуировочного графика расчеты производят соответствующим образом.

10    Презиционность

10.1    Общие положения

Подробности межлабораторных испытаний по определению прецизионности метода приведены в приложениях В и С. Значения метрологических характеристик, полученные в результате межлабораторных испытаний, могут быть не применимы к другим содержаниям аналита и другим типам матриц, чем те. что указаны в данных приложениях.

10.2    Повторяемость

Абсолютное расхождение между результатами двух независимых единичных испытаний, полученными одним методом на идентичном объекте испытаний в одной лаборатории одним оператором с использованием одного оборудования в течение короткого промежутка времени, не должно превышать предел повторяемости г более чем в 5 % случаев.

Предел повторяемости при определении фумонизина В, равен следующим значениям:

при х = 405 мкг/кг г = 80,6 мкг/кг;

при х = 813 мкг/кг г - 132.7 мкг/кг;

при х = 1621 мкг/кг г = 349,2 мкг/кг;

при х = 3245 мкг/кг г = 559,2 мкг/кг;

при .? = 6732 мкг/кг г = 2062,5 мкг/кг;

при х = 4246 мкг/кг г = 1572,8 мкг/кг (проба, загрязненная фумонизинами естественным путем).

Предел повторяемости при определении фумонизина В> равен следующим значениям:

при х = 152 мкг/кг г = 35.6 мкг/кг;

при х - 313 мкг/кг г - 74,5 мкг/кг;

при х - 618 мкг/кг г = 205,5 мкг/кг;

при х = 1294 мкг/кг г = 260,7 мкг/кг;

при х = 2619 мкг/кг г = 891.5 мкг/кг;

при х - 1234 мкг/кг г - 603,1 мкг/кг (проба, загрязненная фумонизинами естественным путем).

10.3    Воспроизводимость

Абсолютное расхождение между результатами двух независимых единичных испытаний, полученными одним методом на идентичном объекте испытаний в разных лабораториях разными операторами с использованием разного оборудования, не должно превышать предел воспроизводимости R более чем в 5 % случаев.

Предел воспроизводимости при определении фумонизина Bi равен следующим значениям:

при х = 405 мкг/кг R= 157.4 мкг/кг;

при х - 813 мкг/кг R = 356.7 мкг/кг;

при х = 1621 мкг/кг R = 731,1 мкг/кг;

при х = 3245 мкг/кг R - 1383,5 мкг/кг;

при х = 6732 мкг/кг R= 3079.2 мкг/кг;

при х = 4246 мкг/кг R = 2643.5 мкг/кг (проба, загрязненная фумонизинами естественным путем).

Предел воспроизводимости при определении фумонизина В; равен следующим значениям:

при х - 152 мкг/кг R - 69.2 мкг/кг;

при х = 313 мкг/кг R = 138,3 мкг/кг;

при х = 618 мкг/кг R = 335,2 мкг/кг;

при х = 1294 мкг/кг R - 622.4 мкг/кг;

при х = 2619 мкг/кг R= 1309.6 мкг/кг;

при х = 1234 мкг/кг R = 922,3 мкг/кг (проба, загрязненная фумонизинами естественным путем).

11    Протокол испытаний

Протокол результатов испытаний должен содержать следующие сведения:

* всю информацию, необходимую для идентификации пробы (вид пробы, ее происхождение и назначение);

-    ссылку на настоящий стандарт;

-    дату и способ отбора пробы (если известны); ⁵

ГОСТ EN 13585—2013

-    дату поступления пробы в лабораторию:

-    дату проведения испытания:

-    результаты испытания с указанием единиц измерения:

-    все особенности, наблюдавшиеся при проведении испытания:

-    все операции, не оговоренные в методе или рассматриваемые как необязательные, которые могли повлиять на результат испытания. ⁶

rOCTEN 13585—2013

Приложение А (справочное)

Пример типичной хроматограммы

Рисунок А. 1

Условия хроматографического анализа:

способ дериватизации - смешивание экстракта объемом 25 мм³ с дериватизирующим реагентом объемом 225 мм³;

объем инжекции - 20 мм³;

подвижная фаза - смесь метанола с фосфатным буферным раствором (pH 3,35) в объемном соотношении 77 :23;

аналитическая колонка для ВЭЖХ - длина 150 мм, внутренний диаметр 4,6 мм, заполненная сорбентом Discovery⁸ С18;

скорость потока - 1 см³/мин;

условия флуориметрического детектирования: длина волны возбуждения 335 нм. длина волны эмиссии 440 нм. ⁷

1

Аппаратура

При проведении испытания используют общеупотребительное лабораторное оборудование, в частности, перечисленное ниже.

5.1    Система для ВЭЖХ в указанной ниже комплектации:

5.1.1    Насос для подачи подвижной фазы изократический, пригодный для создания постоянной скорости потока 1 см³/мин, оснащенный устройством ввода пробы (инжектором), обеспечивающим объем ввода 10 мм³.

5.1.2    Колонка для ВЭЖХ аналитическая, заполненная обращенно-фазовым сорбентом, например, с привитыми октадецильными группами (ODS), обеспечивающая отделение пиков фумонизинов от сопутствующих пиков на уровне базовой линии, со следующими характеристиками:

материал корпуса - нержавеющая сталь:

длина колонки - 150 мм;

внутренний диаметр колонки - 4.6 мм;

2

Bond-Elut - пример подходящего изделия, доступного для приобретения Данная информация приведена

3

для удобства использования настоящего стандарта и не является рекламной поддержкой CEN данного изделия

4

5

6

7