ГОСТ 10444.7-86
Продукты пищевые. Методы выявления ботулинических токсинов и Сlostridium botulinum

ГОСТ 10444.8-88

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ BACILLUS CEREUS

Издание официальное

Москва

Стандартинформ

2010

УДК 663/.664:543.9:006.354

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ

Группа Н09

СТАНДАРТ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

Метод определения Bacillus cereus

Food products. Method for determination of Bacillus cereus

ГОСТ

10444.8-88

МКС 07.100.30 ОКСТУ 9109

Дата введения 01.01.90

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и устанавливает метод определения Bacillus cereus. в том числе близких к нему видов В. anihracis. В. thuringiensis. В. cereus var. mycoides.

Метод основан на выделении В. cereus из колоний, полученных при поверхностном посеве продукта, ею разведения или культуральной жидкости на селективные среды. Принадлежность выделенных колоний к В. cereus определяют по морфологическим и биохимическим свойствам. В зависимости от требований нормативного документа подсчитывают количество или учитывают присутствие (отсутствие) В. cereus в исследуемом продукте.

Метод предназначен для:

установления соответствия микробиологических показателей качества пищевою продукта требованиям нормативною документа;

исследования продукта по санитарно-эпидемиологическим показаниям;

анализа микрофлоры посевов (культуральной жидкости), в которых обнаружены мезофильные факультативно-анаэробные микроорганизмы, при необходимости подтверждения присутствия в посевах В. cereus.

1. ОТБОР И ПОДГОТОВКА ПРОБ

1.1.    Огбор проб пищевых продуктов по ГОСТ 26668, ГОСТ 26809.

1.2.    Подготовка проб пищевых продуктов к анализу — по ГОСТ 26669.

Консервы проверяют на герметичность по ГОСТ 8756.18.

Полные консервы, нормальные по внешнему виду, перед испытанием тер моста тиру ют при 30—37'С в таре вместимостью до 1дм³ включительно не менее 5 сут. в таре вместимостью свыше 1 дм³ — не менее 7 суг.

Пищевые продукты, в которых нормируется допустимое количество В. cereus, термостатированию не подлежат.

Масса (объем) навески, предназначенной для приготовления гомогената продукта или исходною разведения, — не менее (10.010.1) г (см³).

Исходные разведения продуктов, с массовой долей NaCl более 5 %. готовят с использованием пептонной воды; исходные разведения мясных, молочных продуктов и молока готовят с использованием физиологического раствора. Для приготовления последующих десятикратных разведений используют псптонно-солевой раствор. Пептонную воду и неггтонно-солевой раствор готовят по ГОСТ 26669. физиологический раствор — но ГОСТ 10444.1.

Из пробы нишевого продукта, в котором нормируется количество В. cereus. или его исходного разведения готовят ряд разведений в соответствии с допустимым количеством В. cereus. указанном в нормативно-технической документации на конкретный вид пищевого продукта. Культуральную жидкость разводят так. чтобы получить при высеве раздельные колонии.

Истине официальное ★

Персиечагка воспрещена

© Издательство стандартов. 1988 © СТАНДАРТИНФОРМ. 2010

2. АППАРАТУРА, МАТЕРИАЛЫ И РЕАКТИВЫ

ГОСТ 10444.8-88 С. 2

2.1.    Для проведения испытания применяют аппаратуру, материалы и реактивы но ГОСТ 10444.1, а также аппаратуру, материалы и реактивы, указанные ниже:

весы лабораторные обшего назначения с метрологическими характеристиками но ГОСТ 24104*. с наибольшим пределом взвешивания до 200 г и поверочной ценой деления не более 2 мг (для взвешивания реактивов):

весы лабораторные обшего назначения с метрологическими характеристиками по ГОСТ 24104*. с наибольшим пределом взвешивания до 200 г и поверочной ценой деления нс более 20 мг (для взвешивания продукта):

микроскоп свеговой биологический с приспособлением для фазовоконтрастного мнкроскопиро-вания:

стекла предметные по ГОСТ 9284: стекла покровные по ГОСТ 6672: петлю бактериологическую;

термостат с диапазоном рабочих температур ог 28 до 55 'С. позволяющий поддерживал, заданную температуру с погрешностью ±1 *С; шпатели стеклянные; калия гидроокись по ГОСТ 24363: креатин:

полимиксин В сульфат во флаконах но 25 мг (250000 ЕД) и по 50 мг (500000 ЕД);

полимикенн М сульфат во флаконах но 500000 ЕД;

кислоту 5-амнно-2-нафтален сульфоновую;

кислоту сульфан иловую;

феноловый красный, индикатор;

цинк — порошок по ГОСТ 3640.

3. ПОДГОТОВКА К ИСПЫТАНИЮ

3.1.    IIриготовлеиие растворов

3.1.1.    Раствор массовой концентрацией гидроокиси калия 400 г/дм³: 40 г гидроокиси калия переносят, смывая дистиллированной водой, в мерную посуду вместимостью 100 см³, доводят объем дистиллированной водой до метки.

Применяют для постановки реакции на образование ацетил мстил карбинол а.

3.1.2.    Раствор массовой концентрации гидроокиси натрия 4 г/дм³: 0.4 г гидроокиси натрия переносят, смывая дистиллированной водой, в мерную посуду вместимостью 100 см . доводят объем дистиллированной водой до метки.

Применяют для приготовления раствора индикатора фенолового красною.

3.1.3.    Раствор полимиксин В сульфата или полимиксин М сульфата: непосредственно перед использованием во флакон со стерильным полимиксин сульфатом 250000 ЕД (для инъекций) внести 2.5 см³ стерильной дистиллированной воды (на 500000 ЕД вносят 5 см³ воды).

Применяют для приготовления селективных сред.

3.1.4.    Раствор 5-амино-2-нафтален сульфоновой кислоты: 0.1 г 5-амино-2-нафтален сульфоновой кислоты переносят, смывая раствором уксусной кислоты с объемной долей уксусной кислоты 15 %, в мерную посуду вместимостью 100 см ' и доводят этой же кислотой объем до метки.

Раствор фильтруют через бумажный фильтр и хранят при температуре (4±2) *С в хорошо закупоренных сосудах из темного стекла не более 3 мес.

Применяют для приготовления индикатора при определении нитратредуцирующих свойств.

3.1.5.    Раствор массовой концентрации сульфаниловой кислоты 4 г/дм³: 0.4 г сульфаниловой кислоты переносят, смывая раствором уксусной кислоты с объемной долей уксусной кислоты 15 %. в мерную посуду вместимостью 100 см³.

Объем доводят до метки гем же раствором уксусной кислоты. Раствор фильтруют через бумажный фильтр и хранят при температуре (4±2) *С в хорошо закупоренных сосудах из темного стекла не более 2 мес.

Применяют для приготовления индикатора при определении нитратредуцирующих свойств.

• С 1 июля 2002 г. введен в действие ГОСТ 24104 — 2001. На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 53228-2008.

267

С. 3 ГОСТ 10444.8-88

3.1.6.    Раствор массовой концентрации сульфаннловой кислоты 8 г/дм³: 0,8 г сульфан иловой кислоты переносят, смывая раствором уксусной кислоты с объемной долей уксусной кислоты 30 %. в мерную посуду вместимостью 100 см³. Объем доводят до метки тем же раствором уксусной кислоты. Раствор фильтруют через бумажный фильтр и хранят при температуре (4±2) ’С в хорошо закупоренных сосудах из темного стекла не более 2 мес.

Применяют в качестве индикатора при определении нитратредуцирующих свойств.

3.1.7.    Раствор массовой концентрации 1-нафтола 5 г/дм³: 0,5 г 1-нафтола переносят, смывая раствором уксусной кислоты с объемной долей уксусной кислоты 30 %. в мерную посуду вместимостью 100 см³. Объем доводят до метки тем же раствором уксусной кислоты.

Применяют в качестве индикатора мри определении нитратредуцирующих свойств.

3.1.8.    Растворы с объемной долей уксусной кислоты 15 и 30 %: 15 или 30 см³ ледяной уксусной кислоты вносят в мерную посуду вместимостью 100 см³. Объем доводят до метки дистиллированной водой.

Применяют для приготовления индикатора при определении нитратредуцирующих свойств.

3.1.9.    Раствор индикатора фенолового красного: 1,25 г фенолового красного растирают в ступке с 40 см³ раствора гидроокиси натрия, как указано в п. 3.1.2, до полною растворения. Добавляют 460 см³ стерильной дистиллированной воды. Раствор хранят в сосуде из темного стекла при комнатной температуре не более 3 мес.

Применяют для приготовления агара желточного с полимиксин В или полимнксин М сульфатом.

3.1.10.    Эмульсию яично-желточную готовят по ГОСТ 10444.7.

3.2. Приготовление питательных сред

3.2.1. Селективный агар для выделения и идентификации, выпускаемый Дагестанским НИИ

питательных сред.

Состав среды на I дм³, п

<|н:рмснгаишный гидролизат кормовых дрожжей    12,0

L-a-лецитин или яичное масло    1.0

натрий хлористый    3.0

натрий лимоннокислый трехзамещенный    5.0

лкгий сернокислый    5.0

маннит    5.0

бромгимоловый синий    0,04

a nip микробиологический    10.0.

4.0 г сухого порошка готовой среды размешать в колбе со 100 см³ диспил ированной воды. Колбу закрыть рыхлой ватной пробкой, нагреть на слабом огне до кипения и кипятить 2—3 мин. Раствор профильтровать через ватный фильтр, фильтрат разлить но колбам. Стерилизовать 20 мин при температуре < 121 ± 1) ’С. pH среды после стерилизации 7.4±0.1.

Применяют в качестве селективной среды.

3.2.2. Лецитин-агар для выделения В. cereus из консервированных продуктов, выпускаемый Да

гестанским НИИ питательных сред.

Состав среды на I дм³, г:

ферментативный гидролиза г кормовых дрожжей    15.0

L-u-лецитин или яичное масло    1.0

натрий хлористый    3.0

бромгимоловый синий    0,04

агар микробиологический    10,0.

2.8 г сухого порошка готовой среды размешать в колбе в 100 см³ дистиллированной воды: колбу закрыть рыхлой ватной пробкой, нагреть на слабом огне до кипения и кипятить 2—3 мин. Профильтровать через ватный фильтр. Фильтрат разлить по колбам и стерилизовать 20 мин при температуре (12111) *С.

Охлажденную до 45—50 ‘С среду разлить в чашки Петри. После застывания агара чашки подсушить в термостате 40—60 мин. Цвет ютовой среды — салатный. pH среды посте стерилизации

7.410.2.

Применяют в качестве селективной среды для выделения В. cereus из консервированных продуктов.

268

ГОСТ 10444.8-88 С. 4

3.2.3.    Агар желточный с хлористым натрием, полимиксин В или иолнмиксин М сульфатом и 2. 3.5-трифенилтетраэолиум хлоридом.

К1 дм³ мясо-пептонного бульона по ГОСТ 10444.1 добавляют 45,0 г хлористого натрия и

15.0 гагара. Смесь кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения агара. Среду стерилизуют в течение 15 мин при температуре (121 ± I) *С. pH среды после стерилизации

7.210.1. Хранят при температуре (411) *С не более 1 мсс.

Перед употреблением к 1 дм³ рааыавленной и охлажденной до 45—55 'С среды добавляют 5 см³ приготовленного непосредственно перед употреблением 1 %-ного водного раствора 2. 3.5-трифе-н ил тетра золнум хлорида, I см³ раствора нолимиксина сульфата и 100 см³ желточной эмульсии, хорошо перемешивают и разливают в чашки Петри.

Применяют в качестве селективной среды.

3.2.4.    Агар желточный с маннитом, полимиксин В или полимиксин М сульфатом и феноловым красным.

К I дм³ мясо-пеитонного бульона, приготовленного по ГОСТ 10444.1. добавляют 5.0 г хлористого натрия. 10,0 г маннита и 15.0 г агара. Смесь кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения агара. Среду стерилизуют в течение 15 мин при температуре (12111) *С. pH среды после стерилизации 7,110.1. Хранят при температуре (411) °С не более I мес.

Перед употреблением к 1дм³ расплавленной и охлажденной до 45—55 *С среды добавляют 1 см³ раствора полимиксин В или полимиксин М сульфата, 10 см³ раствора индикатора фенолового красного и 100 см³ желточной эмульсии, хорошо перемешивают и разливают в чашки Петри.

Применяют в качестве селективной среды.

3.2.5.    Агар мясо-иептонный готовят но ГОСТ 10444.1.

Применяют для мор<|юлогической и биохимической идентификации.

3.2.6.    Среда с индикатором бромкреэоловым пурпуровым и глюкозой, выпускаемая Дагестан

ским НИИ питательных сред.

Состав среды на 1 дм³, п

сухой питательный агар    7.3

глюкоза    3.65

натрий (|№сфорнокисль1Й лкузамещенныи    0.38

натрий хлористый    3.65

бромкрезоловмй пурпуровый    0.02.

15.0 г сухого порошка готовой среды растворяют в колбе в 1 дм³ холодной диспылнрованной воды, кипятят 1—2 мин. не допуская пригорания. фильтруют, рахливают в пробирки столбиком 10— 12 см. Стерилизуют 20 мин при температуре ПО *С. pH среды после стерилизации 7.010.2. цвет — фиолетовый.

Применяют для определения анаэробной ферментации глюкозы.

3.2.7. Среда с индикатором 6ромкреэоловым пурпуровым и маннитом, выпускаемая Дагестан

ским НИИ питательных сред.

Состав среды на I дм³, г:

сухой питательный агар    7.3

маннит    3.65

натрий фосфорнокислый лвузамещенный    0.38

натрий хлористый    3.65

бромкрезоловый пурпуровый    0.02.

15.0 г сухого порошка готовой среды рас творяют в колбе в 1 дм³ холодной дистиллированной воды, кипятят 1—2 мин. не допуская пригорания. фильтруют, рахливают в пробирки по 5—6 см³. Стерилизуют 20 мин при температуре 110 *С. pH среды после стерилизации 7.010.2. цвет — фиолетовый.

Применяют для определения биохимических свойств.

3.2.8.    Пептонную среду с глюкозой готовят по ГОСТ 10444.1.

Применяют для определения способности В. cereus образовывать ацетплметилкарбинол.

3.2.9.    Нитратная среда

К 1дм' мясо-пеитонного бульона по ГОСТ 10444.1. добавляют 1.0 г калия азотнокислого. Среду рахшвают по 5 см' в пробирки и стерилизуют при температуре (I2I1I) *С в течение 15 мин.

Среду хранят при температуре 0—5 *С не более 1 мес.

Применяют для определения нитратредуцирующих свойств.

4. проведение испытания

С. 5 ГОСТ 10444.8-88

4.1.    Выделение характерных колоний

4.1.1.    Для проведения испытания отбирают объем 0.1—0.2 см' подготовленной пробы продукта, его разведении или разведения культуральной жидкости.

Допускается для получения раздельных колоний проводить посев культуральной жидкости петлей на поверхность питательной среды.

4.1.2.    Подготовленную пробу продукта, его разведения или разведения культуральной жидкости высевают поверхностным методом по ГОСТ 26670 параллельно в две чашки Петри с предварительно подсушенной селективной средой, указанной в пп. 3.2.1—3.2.3 или 3.2.4.

4.1.3.    Посевы на чашках Петри термостатируют при (30±1) *С в течение 24—48 ч. Через 24 ч посевы просматривают и выбирают чашки Петри, на которых выросло от 15 до 150 колоний, характерных дтя В. cereus. Характеристик;! колоний В. cereus на селективных питательных средах приведена в приложении.

Через 48 ч уточняют число обнаруженных колоний. Корректировку подсчета количества В. cereus проводят после изучения морфологических и биохимических особенностей микроорганизмов из колоний, характерных дтя В. cereus.

4.2. Подтверждение принадлежности характерных колоний к В. cereus.

4.2.1.    Для подтверждения принадлежности подсчитанных колоний к колониям, образуемым В. cereus. микроорганизмы из пяти колоний пересевают на скошенный мясо-пептонный агар и термостатируют 18—24 ч при (30±1) *С.

На скошенном мясо-нентонном агаре В. cereus образует сплошной налет белого цвета, иногда с мучнистой поверхностью. Со скошенного мясо-пептонного агара готовят препараты, окрашивают по Граму но ГОСТ 30425, а также определяют подвижность клеток при микросконировании методом висячей капли.

В мазках, приготовленных со скошенною агара, В. cereus имеет вид крупных грамположительных палочек размером 1.0—1.2x3.0—5.0 мкм со слегка закругленными концами, лежащих в виде цепочек или штакетообразных скоплений, реже отдельно друг от друга. В. cereus образует субтерминальные пли центральные споры. В висячей капле клетки подвижны, однако могут встречаться штаммы со слабо выраженной подвижностью.

4.2.2.    Для доказательства анаэробной ферментации глюкозы культуры со скошенного агара, указанного в и. 4.2.1. высевают указом в питательную среду с индикатором бромкрезоловым пурпуровым и глюкозой (см. и. 3.2.6). Посевы инкубируют при температуре (30±1)*С в течение 24 ч. В. cereus растет, окрашивая среду в желтый пли желто-коричневый цвет по всей длине укола.

4.2.3.    Для определения способности В. cereus ферментировать маннит культуры со скошенного агара (см. и. 4.2.1) пересевают на питательную среду с индикатором бромкрезоловым пурпуровым и маннитом (см. и. 3.2.7). Посевы термостатируют при (30± 1) *С в течение 24 ч.

При развтггии В. cereus на среде с маннитом, цвет среды не изменяется.

4.2.4.    Для постановки реакции на образование ацетилметилкарбинола культуры со скошенного агара (см. п. 4.2.1) пересевают на пептонную среду с глюкозой с pH 7.0. Посевы термостатируют при (30±1) *С в течение 24 ч. В чистую пробирку отбирают I см³ культуры, добавляют 0.2 см⁵ раствора гидроокиси калия массовой концентрацией 400 г/дм³ и 0.6 см³ свежепрнготоаленного по ГОСТ 10444.1 раствора 1-нафтола и несколько кристадюв креатина. Допускается реакцию на образование ацетилме-тилкарбинола проводить без применения креатина.

После добавления каждого раствора содержимое пробирки тщательно встряхивают, а затем оставляют на 1 ч при комнатной температуре.

В. cereus образует ацетил метил карби нал, поэтому окраска среды меняется в розовый цвет.

При отрицательной реакции культуральную жидкость термосгалфуют дополнительно 24 ч. после чего делают окончательное заключение.

4.2.5.    При постановке реакции на подтверждение редукции В. cereus нигратов предварительно убеждаются в том. что сама среда нс содержит нитритов. Для этого в две конлрольные пробирки со средой добавляют по 0.2—0.5 см³ смеси равных объемов растворов, как указано в пи. 3.1.4. 3.1.5. Если в течение 15 мин нс происходит покраснения среды, то среду используют для определения нилрагреду-цнруюшей способности микроорганизмов.

Допускается истюльзованис йодокрахмального реактив;! по ГОСТ 10444.1 для конгроля отсутствия нитритов в питательной среде.

270

ГОСТ 10444.8-88 С. 6

Для подтверждения редукции нитратов проводят посевы в пробирки с нитратной средой. Посевы термостатируют при температуре (30± 1) *С в течение 24 ч, затем добавляют 0.2—0.5 см' смеси равных объемов растворов по ни. 3.1.4. 3.1.5.

Если в течение 15 мин не происходит покраснения, добавляют в посев немного порошкообразного цинка и выдерживают еше 10 мин. Если после добавления цинка среда краснеет, то редукция нитратов, вследствие отсутствия В. cercus. не произошла и тест считают отрицательным. Ест после добавления цинка среда не краснеет, то делают вывод о том. что редукция нитратов, вследствие присутствия В. cercus произошла.

Допускается вместо смеси равных объемов растворов, указанных в пп. 3.1.4. 3.1.5. использовать растворы, указанных в пп. 3.1.6. 3.1.7.

В этом случае эти растворы добавляют из расчета по две капли каждого раствора к 3 см' культуральной жидкости.

5. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ

5.1.    Результаты испытания продукта оценивают по каждой пробе отдельно.

5.2.    Если при изучении культуральных, морфологических и биохимических свойств микроорганизмов. выделенных из колонии, обнаружены подвижные, грамположительные, нитратредуциру-юшие. спорообразуюшие палочки, способные образовывать ацетил мстил карбинол, ферментировать в анаэробных условиях глюкозу и не способные ферментировать маннит, то дают заключение о том. что обнаруженные микроорганизмы относятся к В. cereus.

5.3.    При необходимости подсчета В. cereus если в 80 % случаев, т. е. не менее чем в четырех из пяти колонии, подтвержден рост В. cereus. то считают, что все характерные колонии, выросшие в чашке, принадлежат к В. cereus.

В остальных случаях количество В. cereus определяют, исходя из процентного отношения подтвержденных колоний к общему количеству характерных колоний, взятых для изучения морфологических и биохимических свойств.

5.4.    Результаты испытаний, пересчитывают на 1 г или 1 см' продукта и записывают в соответствии с требованиями ГОСТ 26670.

ПРИЛОЖЕНИЕ

Справочное

ХАРАКТЕРИСТИКА КОЛОНИЙ В. C'ERF.LS НА СЕЛЕКТИВНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ

Нажанис питательной среды

Характеристика колоний

1. Селективный агар для выделения и идентификации ^{2 3}

2.    Желточный агар с хлористым натрием, 1юли-миксин В или полимиксин М сульфатом и 2. 3. 5-трнфен ил гетра зол нум хлоридом

3.    Желточный агар с маннитом, полимиксин В или полимиксин М сульфатом и феноловым красным

Колонии диаметром 1.5—2.0 мм. окруженные зонами прешшитата синего цвета диаметром 4—5 мм. В первые часы роста колонии округлые, выпуклые; затем края колоний становятся изрезанными.

Колонии круглые, блестящие, красные, диаметром около 2—3 мм с зоной белого преципитата диаметром окшо 4—5 мм.

Катон и и розовые (вследствие отсутствия способности ферментировать маннит), крупные, шероховатые, сухие, окруженные зоной бело-розового преципитата.

Если в чашках содержится много микроорганизмов, ферментирующих маннит до кислоты, то характерный розовый цвет колоний В. cereus может побледнеть иди исчезнуть, в этом случае эти катонии следует учиты-

4. Лецитин-arap для выделения В. cereus из консервированных продуктов

Колонии, аналогичные колониям, указанным в и. 1.

271

ИНФОРМАЦИОННЫЕ ДАННЫЕ

С. 7 ГОСТ 10444.8-88

1.    РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Государственным агропромышленным комитетом СССР

2.    УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государственного комитета СССР но стандаргам от 25.08.88 № 3021

3.    В стандарт введен ме жду народный стандарт ИСО 7932 (1987)

4.    ВЗАМЕН ГОСТ 10444.10-75

5.    ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ

Обозначение НТД. на который лака ссылка

Номер пункта

ГОСТ 3640-94

2.1

ГОСТ 6672-75

2.1

ГОСТ 8756.18-70

1.2

ГОСТ 9284-75

2.1

ГОСТ 10444.1-84

1.2; 2.1; 3.2.3; 3.2.4; 3.2.5; 3.2.8; 3.2.9; 4.2.4; 4.2.5

ГОСТ 10444.7-86

3.1.10

ГОСТ 24104-88

2.1

ГОСТ 24363-80

2.1

ГОСТ 26668-85

1.1

ГОСТ 26669-85

1.2

ГОСТ 26670-91

4.1.2; 5.4

ГОСТ 26809-86

1.1

ГОСТ 30425-97

4.2.1

6.    Ограничение срока действия снято но протоколу № 4—93 Межгосударственного совета но стандартизации, метрологии и сертификации (ИУС 4—94)

7.    П ЕРЕИЗДАНИ Е. Апрель 2010 г.

272