4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ И
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ.
ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ
Метод идентификации
генно-инженерно-модифицированных
организмов (ГМО)
растительного происхождения с применением
ферментного анализа на биологическом микрочипе
Методические указания
МУ
4.2.2008-05
1. Разработаны: ГУ НИИ питания РАМН (В.А. Тутельян - руководитель, Е.Ю.
Сорокина, О.Н. Чернышева, Н.А. Кашина); ФГУЗ «Федеральный центр гигиены и
эпидемиологии» Роспотребнадзора (Т.В. Воронцова, Т.Н. Потапова); Инновационной
корпорацией «Биозащита» (И.В. Панкин).
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному
санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в
сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
3. Утверждены и введены в действие Руководителем Федеральной службы по
надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным
государственным санитарным врачом Российской Федерации, Г.Г. Онищенко 17
октября 2005 г.
4. Введены впервые.
УТВЕРЖДАЮ
Руководитель Федеральной службы
по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека,
Главный государственный санитарный врач
Российской Федерации
Г.Г. Онищенко
17 октября 2005 г.
Дата введения: с момента утверждения
4.2. МЕТОДЫ
КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И
ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ
Метод идентификации генно-инженерно-модифицированных
организмов (ГМО) растительного происхождения с применением ферментного анализа
на биологическом микрочипе
Методические
указания
МУ 4.2.2008-05
1.
Область применения
1.1. Настоящие методические указания подготовлены для
идентификации генно-инженерно-модифицированных организмов (далее - ГМО) растительного
происхождения в пищевых продуктах с применением ферментного анализа на
биологическом микрочипе и его последующей обработки на аппаратно-программном
комплексе «ДЕГМИГЕН-001».
1.2. Методические указания разработаны в соответствии с
Федеральным законом от 30.03.99 № 52-ФЗ (в редакции от 09.05.05 № 45-ФЗ) «О
санитарно-эпидемиологическом благополучии населения», Законом Российской
Федерации от 07.02.92 № 2300-1 (в редакции от 21.12.04 № 171-ФЗ) «О защите прав
потребителей», постановлением Правительства Российской Федерации от 30.06.04 №
322 «Об утверждении Положения о Федеральной службе по надзору в сфере защиты
прав потребителей и благополучия человека», постановлением Правительства
Российской Федерации от 15.09.05 № 569 «О Положении об осуществлении
государственного санитарно-эпидемиологического надзора в Российской Федерации»,
постановлением Правительства Российской Федерации от 24.07.00 № 554 (в редакции
от 15.09.05 № 569) «Об утверждении Положения о государственном
санитарно-эпидемиологическом нормировании».
1.3. Методические указания предназначены для органов и
учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и
благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности
продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также других испытательных
лабораторий, аккредитованных в порядке, установленном Правительством Российской
Федерации.
1.4. Методические указания разработаны для одновременного
определения в одном лабораторном испытании пяти различных маркеров рекомбинантной
ДНК при проведении скрининга с целью
выявления ГМО растительного происхождения в пищевых продуктах, в т.ч., в
продовольственном сырье.
2. Общие
положения
Методические указания
содержат описание метода определения ГМО растительного происхождения в пищевых
продуктах с помощью набора реагентов для выявления и идентификации ГМО
растительного происхождения с применением ферментного анализа на биологическом
микрочипе. Метод основан на идентификации рекомбинантной ДНК с использованием
метода асимметричной мультиплексной полимеразной цепной реакции (далее - амПЦР)
и последующей гибридизации продуктов амПЦР с применением ферментного анализа на
биологическом микрочипе. Метод одновременно устанавливает наличие или
отсутствие в анализируемой пробе не менее пяти различных рекомбинантных
последовательностей ДНК: трех регуляторных (35 S, nos и ocs) и двух селективных (gus, nptII).
Идентификация этих последовательностей позволяет проводить предварительную
проверку пищевых продуктов на наличие ГМО растительного происхождения.
Чувствительность метода не менее 10-12 г (1пг) ДНК.
3.
Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы
3.1. Аппаратура и инструменты
Амплификатор ДНК типа «Терцик-мс-2» под
микроцентрифужные пробирки, вместимостью 0,2; 0,5 см3, со скоростью
нагрева/охлаждения активного элемента не менее 1,5 °С/с
|
ТУ 9642-001-4648062-98
|
Комплекс аппаратно-программный для анализа
биологических микрочипов типа «ДЕГМИГЕН-001»
|
ТУ 9443-001-02699501-03
|
Компьютерная программа «Arra» для анализа изображений, полученных с помощью
комплекса «ДЕГМИГЕН-001»
|
ТУ 4320-002-71321417-04
|
Биологический микрочип с иммобилизованными
олигонуклеотидами (прилож. 1А)
|
Термостат суховоздушный типа ТВ3-25 с рабочей
температурой 42 °С, рабочий диапазон от 20 до 60 °С точность поддержания
температуры ±1 °С
|
ТУ 42-61961
|
Весы лабораторные общего назначения 2-го класса
точности с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного
взвешивания не более ±0,0001 г
|
ГОСТ 24104-01
|
Термостат типа «TERMO 24-15» под пробирки типа «Эппендорф» вместимостью
0,5 и 1,5 мл, диапазон температур от 15 до 120 °С, количество гнезд - не
менее 20 каждого типа, точность поддержания температуры - 0,2 °С, разность
температур между соседними ячейками - не более 0,5
|
|
Камера морозильная, обеспечивающая температуру минус
20 °С
|
ГОСТ 26678-85
|
Холодильник бытовой
|
ГОСТ 26678-85
|
Микроцентрифуга настольная типа «Эппендорф» с
частотой вращения не менее 13000 мин-1
|
|
Аппарат для встряхивания типа «Вортекс», скорость
вращения 250 - 3000 мин-1
|
|
Дистиллятор, обеспечивающий качество
дистиллированной воды
|
ГОСТ 6709-72
|
Микродозаторы с переменным объемом дозирования: 0,5
- 10,0 мм3 (шаг - 0,1 мм3, точность ±2,5 - 10,0 %,
воспроизводимость 3 - 7 %); 0,5 - 50,0 мм3 (шаг - 0,5 мм3,
точность ±2,0 - 5,0 %,
воспроизводимость 2,5 - 5 %); 20,0 - 200,0 мм3 (шаг - 1,0 мм3,
точность ±1,5 - 2,0 %,
воспроизводимость 2 - 3 %); 100 - 1000 мм3 (шаг - 5 мм , точность
±1,0 - 1,5 %, воспроизводимость 1 - 2 %); 2000 - 10000 мм3 (шаг -
10 мм3, воспроизводимость 1 - 2 %)
|
|
Облучатель бактерицидный настенный ОБН-150 или
других видов
|
ТУ 16-535-84
|
Примечание. Допускается использование другой
аппаратуры и инструментов с аналогичными техническими характеристиками, разрешенных
для применения в установленном порядке.
|
3.2. Лабораторная посуда и материалы
Бумага фильтровальная лабораторная
|
ГОСТ 12026-76
|
Воронки стеклянные
|
ГОСТ 25336-82
|
Колбы стеклянные мерные плоскодонные конические,
вместимостью 25, 50, 100, 200, 1000 см3
|
ГОСТ 12738-77
|
Чашки Петри
|
ГОСТ 25336-82
|
Цилиндры стеклянные мерные лабораторные,
вместимостью 25, 100, 1000 см3
|
ГОСТ 1770-74
|
Пробирки микроцентрифужные типа «Эппендорф»,
вместимостью 0,2; 0,5; 1,5 см3
|
|
Наконечники с фильтром для дозаторов с переменным
объёмом дозирования до 10; 20; 200; 1000; 10000 мм3
|
|
3.3. Реактивы и реагенты
Додецилсульфат натрия (SDS)
|
|
Натрия гидроокись
|
ГОСТ 4328-77
|
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), хч
|
ТУ 6-09-11-1721-83
|
Альбумин бычий сывороточный сухой (БСА). Корпорация
«Сигма Алдрич» (Sigma), кат. № В
4287
|
|
Спирт этиловый ректификованный
|
ГОСТ Р 51652-00
|
Вода дистиллированная
|
ГОСТ 6709-72
|
Вода деионизованная
|
ОСТ 11.029.003-80
|
3 %-й раствор пероксида водорода
|
|
Примечание. Допускается использование других реактивов
с аналогичными техническими характеристиками; препараты импортного производства
должны иметь международный сертификат качества ИСО 9000 или EN 29000.
|
Набор реагентов для выявления и идентификации ГМО
растительного происхождения на биологическом микрочипе состоит из набора для
выделения ДНК, набора для проведения амПЦР и набора для ДНК гибридизации и
ферментного анализа. Наборы рассчитаны на 100 реакций
|
|
Набор реагентов для пробоподготовки (бисер - 30 г,
лизирующий реагент - 60 см3 (2 флакона), сорбент - 2 см3
(2 пробирки), солевой буфер (10-кратный) - 10 см3, экстракционный
раствор - 10 см3)
|
ТУ 2643-003-71321417-04
|
Порядок приготовления рабочего раствора солевого
буфера описан в п. 4.1. Остальные реагенты готовы к использованию.
|
Набор реагентов для амПЦР (включает в себя: сухие
смеси реагентов (100 пробирок, каждая пробирка содержит Taq ДНК полимеразу, дезоксинуклеозидтрифосфаты и хлорид
магния с конечными концентрациями, соответственно, 1 ед, 200 мкМ и 2,5 мМ, а
также оптимизированную буферную систему для проведения одной стандартной
ПЦР); растворитель; минеральное масло; «+» контроль амплификации - 1
пробирка, 0,5 см3, праймеры на 35S-промотор вируса мозаики цветной капусты:
|
ТУ 2643-003-71321417-04
|
• 35S_п 5¢ CGG CTA CTC CAA GAA TAT CAA AGA TAC AGT TTC AGA AGA
|
(39 н.о.);
|
• 35S_о* 5¢ CCA ТТТ ТСС ТТТ ТТТ ATT GTC СТТ TCG ATG AAG TGA CAG А
|
(40 и.о.);
|
праймеры на маркерный ген gus из бактерии Escherichia coli:
|
• gus_ 5¢ ACC GTA CCT CGC ATT ACC CTT ACG CTG AAG AGA
|
(33 н.о.);
|
• gus_o* 5¢ TGC CCG CTT CGA AAC CAA TGC CTA AAG AGA
|
(30 н.о.);
|
• праймеры на терминатор nos из агробактерии Agrobacterium tumefaciens:
|
• nos_п 5¢ GGA CAA GCC GTT TTA CGT TTG GAA CTG ACA GA
|
(32 н.о.);
|
• nos_o* 5¢ GCC TGA CGT ATG TGC TTA GCT CAT TAA ACT CCA GA
|
(35 н.о.);
|
праймеры на маркерный ген nptII из транспазона Tn5 бактериального происхождения:
|
• npt_п 5¢ GTG ACC CAT GGC GAT GCC TGC TTG С
|
(25 н.о.);
|
• npt_o* 5¢ ACC CAG CCG GCC ACA GTC GAT GAA TCC AGA
|
(30 н.о.);
|
праймеры на промотор ocs из агробактерии Agrobacterium tumefaciens:
|
• ocs_п 5¢ AAA AAG TGG CAG AAC CGG TCA AAC СТА AAA GA
|
(32 н.о.);
|
• ocs_o* 5¢ CGT TAT TAG TTC GCC GCT CGG TGT GTC GTA GA
|
(32 н.о.).
|
Праймеры
расфасованы в 10 пробирках по 0,5 см3.
|
Примечание: 35S_п; gus_п; nos_п; nptII_п; ocs_п - обозначают прямые
праймеры; 35S_o*; gus_o*; nos_o*; nptII_o*; ocs_o* - обозначают
обратные праймеры меченные биотином; н.о. - нуклеотидные остатки.
|
Набор реагентов для ДНК гибридизации и ферментного
анализа: 20 х SSC - 50 см3;
диаминобензидин (ДАБ) - 100 таблеток; конъюгат пероксидазы хрена со
стрептавидином - 0,1 см3 с концентрацией 1 мг/см3, 1
пробирка
|
ТУ 2643-003-71321417-О4
|
Примечание. Срок
годности набора реагентов - 12 месяцев со дня изготовления. Основную часть
реагентов, упакованную в картонную коробку, хранят в сухом тёмном месте при
температуре от 2 до 8 °С. В отдельных пластиковых пакетах при температуре -20
°С хранят праймеры, положительный контроль и конъюгат
стрептавидин-пероксидазы.
|
|
|
|
|
4.
Подготовка к анализу. Приготовление растворов
4.1. Приготовление
0,5 М ЭДТА (рН 8,0)
В мерной колбе на 100 см3 растворить 18,62
г этилендиаминтетрауксусной кислоты (молекулярный вес 372,2) в 80 см3
дистиллированной воды. Раствором 30 %-й гидроокиси довести pH раствора до 8,0 дистиллированной водой - объем раствора
до метки, перемешать. Хранить в колбе с притертой пробкой при комнатной
температуре до года.
4.2. Приготовление 10 %-го раствора SDS
Растворить 10 г SDS в 90 см3 дистиллированной воды. Хранить
при комнатной температуре не более 1 года.
4.3. Приготовление рабочего раствора
солевого буфера
Содержимое флакона с 10-кратным солевым буфером (10 см3)
(из набора реагентов) перенести из флакона в цилиндр, довести
бидистиллированной водой до отметки 100 см3 и 96 %-м этиловым
спиртом до отметки 300 см3 и перемешать. Рабочий раствор солевого
буфера следует хранить в герметично закрытой посуде при температуре 4 °С.
5. Отбор
и подготовка проб пищевых продуктов для анализа
Отбор проб проводят по государственным стандартам,
устанавливающим порядок отбора проб для однородных групп пищевой продукции: ГОСТ
5904-82, 9163-90, 12292-00, 10852-86,12430-66, 13979-86, 26313-84, 22617.0-77,
27668-88, 26312-84, 9792-73, 7631-85, 12036-85, 51447-99, 135869.3-86,
13440-89, 17109-88, 19341-73, 26809-86, 27668-88, 27853-88, 28741-90, 29142-91,
13634-90, 15877-70, 17110-71, 17109-88, ГОСТ Р 50436-92, 50437-92, 51926-02,
ГОСТ Р ИСО 2170-97.
6.
Проведение анализа. Выделение ДНК
6.1. В одноразовые центрифужные пробирки типа «Эппендорф»
на 1,5 см3 внести 300 мг бисера и 70 - 80 мг анализируемого
материала. Добавить 0,5 мл 5 мМ Na2-соль ЭДТА и термостатировать при
65 °С в течение 30 - 60 мин. Время инкубации составляет 30 мин для
процессированных продуктов (мука, чипсы, детское питание и др.) и до 60 мин для
зерна. Через каждые 10 - 15 мин гомогенизировать пробу срезанным наконечником (для
каждой пробы использовать индивидуальный наконечник).
6.2. К содержимому пробирки добавить 400 мм3
лизирующего реагента из набора реагентов и перемешать на вортексе до
максимально однородного состояния. Пробу термостатировать при 65 °C 60 - 120 мин.
6.3. После термостатирования пробу, при необходимости,
еще раз гомогенизировать, добавить 500 мм бидистиллированной воды и перемешать
на вортексе.
6.4. Центрифугировать пробу 1 мин при 5000 g (12000 об./мин). Прозрачный супернатант перенести в
чистую пробирку.
6.5. Добавить 20 мм3 сорбента из набора
реагентов (перед использованием сорбент следует интенсивно встряхнуть на
вортексе). Пробирку поместить на ротатор и перемешивать на вортексе 10 мин (10
- 20 об./мин).
6.6. Центрифугировать пробу 10 с при 5000 g.
6.7. Осторожно, не задевая осадка, удалить супернатант. К
осадку добавить 200 мм3 лизирующего реагента из набора реагентов и
перемешать на вортексе до однородного состояния. Центрифугировать пробу 10 с
при 5000 g.
6.8. Удалить супернатант. К осадку добавить 1 см3
рабочего раствора солевого буфера из набора реагентов, перемешать содержимое
пробирки переворачиванием 5 - 10 раз. Центрифугировать пробу 10 с при 5000 g.
6.9. Удалить супернатант, не задевая, осадка.
6.10. К осадку добавить 1 см3 рабочего раствора
солевого буфера, перемешать на вортексе, центрифугировать пробу 10 с при 5000 g и осторожно удалить супернатант.
6.11. Повторить предыдущий пункт ещё раз.
6.12. Подсушить осадок при 65 °C в течение 4 - 5 мин.
6.13. К осадку добавить 50 мм3 экстракционного раствора
из набора реагентов. Отбор раствора из исходного флакона проводить при
постоянном помешивании, не допуская выпадения в осадок гранул ионообменной
смолы.
6.14. Суспендировать содержимое пробирки на вортексе 5 -
10 с до гомогенного состояния, затем термостатировать 10 мин при 65 °С.
6.15. Еще раз суспендировать пробу на вортексе,
центрифугировать 1 мин при 5000 g.
6.16. Супернатант, содержащий очищенную ДНК, перенести в
чистую пробирку и хранить при - 20 °С до проведения ПЦР анализа. При отборе
раствора ДНК необходимо избегать захвата осадка, содержащего сорбент.
Примечание. Кроме описанного выше сорбционного метода выделения ДНК, возможно
использование метода выделения, с помощью СТАВ (гексадецилтриметиламмониум
бромид), описанного в методических указаниях по определению генетически
модифицированных источников в продуктах питания растительного происхождения
методом полимеразной цепной реакции (МУК
4.2.1902-04 «Определение генетически модифицированных источников (ГМИ)
растительного происхождения методом полимеразной цепной реакции»).
7. Амплификация
7.1. Перед проведением реакции вынуть из холодильника
необходимое количество микропробирок с сухими реагентами из набора реагентов.
Промаркировать соответствующим образом: «-» контроль», «исследуемые пробы», «+»
контроль».
7.2. Добавить во все пробирки по 5 мм3
праймеров.
7.3. Добавить во все пробирки по 10 мм3
растворителя.
7.4. В пробирку, которая служит отрицательным контролем,
добавить 5 мм3 бидистиллированной воды. В опытные пробирки добавить
по 5 мм3 исследуемой ДНК. В пробирку с положительным контролем добавить
5 мм3 раствора контрольной ДНК.
7.5. Добавить во все пробирки по 20 мм3
минерального масла (масло не используется в случае, если амплификатор имеет
термостатируемую крышку).
7.6. Подготовленные для проведения реакции пробирки
перенести в термоблок программируемого термостата и запустить программу
амплификации в соответствии с режимами, приведенными в табл. 1.
Таблица
1
Программа проведения амПЦР
Шаг программы
|
Температура,
°C
|
Время
инкубации, с
|
Количество
циклов
|
1
|
94
|
180
|
1
|
2
|
94
|
30
|
42
|
3
|
62,5
|
30
|
4
|
72
|
180
|
1
|
Примечание. Для пипетирования жидкостей без примесей
рекомбинантной ДНК (праймеры, растворитель, вода), необходимо иметь отдельный комплект
микродозаторов, не используемых при пробоподготовке или работах с
ДНК-содержащими препаратами. При подготовке смесей для проведения амПЦР каждую
пробирку открывают только перед отбором или внесением проб, а по окончании
манипуляции сразу же закрывают. Запрещается открывать одновременно несколько
микропробирок с пробами и оставлять их открытыми на длительное время.
7.7. После завершения реакции микропробирки необходимо передать в
помещение, в котором будет проводиться гибридизация. Отбор пробы для гибридизации
проводится из-под слоя минерального масла в случае его использования.
7.8. Подготовка проб для амПЦР и их гибридизации с применением ферментного
анализа на биологическом микрочипе в одном помещении не допускается.
Реакционные смеси после амплификации содержат в высоких концентрациях фрагменты
ДНК, контаминация которыми помещений, оборудования и реактивов может привести к
получению ложноположительных результатов.
8.
Проведение ДНК-гибридизации
8.1. Приготовить рабочие разведения раствора 20 ´ SSC (3М NaCl, 0,3 М цитрат натрия, pH
7,4): 2 ´ SSC, 0,1 % SDS; 0,1 ´ SSC; 0,1 ´ SSC, 0,1 % SDS; 0,01 ´ SSC. Для приготовления 100 см3 раствора можно воспользоваться
табл. 2.
Таблица 2
Приготовление рабочих растворов
SSC
Раствор
|
20 ´ SSC
|
10
%-й SDS
|
H2O дист.
|
2 ´ SSC, 0,1 % SDS
|
10 см3
|
1 см3
|
89 см3
|
0,1 ´ SSC
|
0,5 см3
|
-
|
99,5
см3
|
0,1 ´ SSC, 0,1 % SDS
|
0,5 см3
|
1см3
|
98,5
см3
|
0,01 ´ SSC
|
0,05 см3
|
-
|
99,95
см3
|
8.2. Микропробирки с продуктами
амплификации ДНК центрифугировать 1 - 2 с для сбора пробы на дне пробирки и
держать далее только в вертикальном положении. Добавить в каждую микропробирку
5 мм 20 ´ SSC и 0,2 мм 10 % SDS, перемешать и центрифугировать
1 - 2 с. Распределить полученную смесь по поверхности микрочипа, содержащей
зоны иммобилизованных олигонуклеотидов.
8.3. Поместить микрочип во влажную камеру (например, в чашку Петри со
смоченным дистиллированной водой бумажным фильтром) и поставить на 1 ч в
воздушный термостат с температурой 42 °С.
8.4. По окончании реакции капли смыть буфером 2 ´ SSC, 0,1 % SDS и затем тщательно промыть
чип следующими растворами:
• 2 ´ SSC, 0,l % SDS - 1 paз 5 мин;
• 0,1 ´ SSC, 0,1 % SDS - 2
раза по 5 мин;
• 0,1 ´ SSC - 5 раз по 1 мин;
• 0,01 ´ SSC в течение 10 с.
9.
Проведение ферментного анализа
9.1. Исходный стрептавидин-пероксидазный конъюгат разбавить в 200 раз
буфером 1 ´ SSC, содержащим 1 % BSA (бычий сывороточный
альбумин), из расчёта 25 мм3 на микрочип. Например, необходимо
проанализировать 5 микрочипов. Для этого потребуется 25 ´ 5 = 125 мм3 раствора конъюгата. Готовят с небольшим
избытком, 150 мм3 раствора. Для этого 1,5 мг BSA растворяют в 150 мм3 1 SSC, а затем добавляют 0,75 мм3 исходного конъюгата.
9.2. Нанести 25 - 30 мм3 разведенного конъюгата на рабочую зону
микрочипа и поместить его на 30 мин во влажную камеру при комнатной
температуре.
9.3. Смыть конъюгат раствором 1 ´ SSC.
9.4. Залить микрочип раствором 2 ´ SSC и промыть 5 мин.
9.5. Промыть микрочип раствором 1 ´ SSC.
9.6. Непосредственно перед применением приготовить раствор субстрата -
диаминобензидина (ДАБ). Для этого растворить таблетку ДАБ в 1 см3
буфера 0,1 ´ SSC, добавить 30 мм3 3 %-го раствора пероксида водорода и
перемешать. Раствор использовать немедленно.
9.7. Залить рабочую зону микрочипа раствором субстрата и выдержать от 2 до
10 минут при комнатной температуре. В случае положительной реакции появляются
коричневые пятна окисленного субстрата.
9.8. Промыть микрочип дистиллированной водой, встряхнуть капли воды и
поместить в термостат 42 °C на 5 - 10 мин. После сушки
микрочип с окрашенными зонами необходимо хранить в тёмном месте.
10.
Сканирование биологических микрочипов
10.1. В соответствии с руководством по эксплуатации, поставляемым в
комплекте с аппаратно-программным комплексом «ДЕГМИГЕН-001», подготовить сканер
микрочипов к работе.
10.2. Поместить микрочип в рамку для сканирования, зафиксировать его и
закрыть рамку.
10.3. Запустить программу сканирования, функционирующую в диалоговом
режиме, дождаться появления на мониторе приглашения к сканированию и только
после этого вставить рамку с микрочипом в приемное окно детектора.
10.4. После завершения сканирования микрочипа необходимо сохранить
изображение (прилож. 1Б), присвоив файлу
соответствующее имя.
10.5. Для завершения работы с программой сканирования следует нажать в
диалоговом окне клавишу «ВЫХОД».
11.
Анализ изображений биочипов
11.1. Запустить программу обработки изображения микрочипа «Arra».
11.2. Ввести оцифрованное изображение в программу, для этого нужно выбрать
опцию меню «Файл», и затем открыть изображение. В появившемся диалоговом окне
выбрать формат, в котором представлены изображения, и выбрать в списке нужный
файл, после чего изображение появится в основном окне программы.
11.3. Провести операцию разметки матрицы, чтобы совместить центры
измерительных зондов с центрами пятен решетки в изображении, для этого выбрать
опцию меню «Анализ» и затем «Разметка матрицы». Разметка начинается с рисования
прямоугольника, боковые стороны которого проходят через центры узлов крайних
столбцов. Для этого нужно щелкнуть левой кнопкой мыши в центре левого верхнего
пятна/ячейки. Затем, держа кнопку нажатой, переместить правую нижнюю вершину
появившегося прямоугольника в центр нижнего правого узла.
11.4. В результате предварительной разметки на экране появится
четырехугольник с внутренними линиями, расположенными равномерно, в
соответствии с заданным числом столбцов матрицы.
11.5. Чтобы завершить разметку и закрыть диалоговое окно,
нужно нажать клавишу «Принять».
11.6. После завершения базовой разметки проводят
автоматическую коррекцию положения зондов. Для этого в меню выбирается опция
«Настройки/Автоматическая подстройка».
11.7. Для анализа результатов нужно выбрать опцию меню «Анализ»
- «Показать результаты».
11.8. По окончании измерений программа предоставляет
возможность подготовки и распечатки протокола испытаний (прилож. 2). Для этого
нужно выбрать опцию меню «Файл» и затем «Заполнить протокол». После этого
появится окно с формой для заполнения. После того как она будет заполнена,
нажать кнопку «Выход».
12.
Интерпретация результатов
12.1. Появление регистрируемого компьютерной программой Arra оптического сигнала в одной, нескольких или во всех
пяти зонах гибридизации, содержащих иммобилизованные олигонуклеотиды, указывает
на присутствие рекомбинантной ДНК, свидетельствующей о наличии ГМО
растительного происхождения в анализируемом образце (пробе).
12.2. Отсутствие регистрируемого оптического сигнала во
всех пяти гибридизационных зонах, содержащих иммобилизованные олигонуклеотиды,
указывает на неимение рекомбинантной ДНК, что свидетельствует о том, что
анализируемый образец (проба) не имеет ГМО растительного происхождения.
12.3. Появление оптического сигнала в зоне гибридизации
при использовании отрицательного контроля амплификации свидетельствует о
получении ложноположительного результата. Причиной может быть загрязнение
реактивов и/или оборудования. В этом случае необходимо обработать поверхности
лабораторных столов и оборудования раствором 1Н соляной кислоты, заменить
реактивы на свежеприготовленные и повторить анализ.
12.4. Отсутствие оптического сигнала при использовании
положительного контроля амплификации, свидетельствует о получении
ложноотрицательного результата. Причиной могут быть потеря активности одного из
компонентов реакционной смеси для амПЦР и/или гибридизации с применением
ферментного анализа на биологическом микрочипе. В этом случае необходимо
заменить реактивы на свежеприготовленные и повторить анализ.
13.
Организация рабочих мест
Организация рабочих мест для проведения исследований,
описанных в настоящих методических указаниях, проводится в соответствии с МУК
4.2.1902-04 «Определение генетически модифицированных источников (ГМИ)
растительного происхождения методом полимеразной цепной реакции».
Нормативные ссылки
1. Федеральный закон «О санитарно-эпидемиологическом
благополучии населения» от 30.03.99 № 52-ФЗ (в редакции от 09.05.05 № 45-ФЗ) .
2. Закон Российской Федерации «О защите прав
потребителей» от 07.02.92 № 2300-1 (в редакции от 21.12.04 № 171).
3. Постановление Правительства Российской Федерации «Об
утверждении Положения о государственном санитарно-эпидемиологическом
нормировании» от 24.07.00 № 554 (в редакции от 15.09.05 № 569).
4. Постановление Правительства Российской Федерации «О
Положении об осуществлении государственного санитарно-эпидемиологического
надзора в Российской Федерации» от 15.09.05 № 569.
5. Постановление Правительства Российской Федерации «Об
утверждении Положения о Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека» от 30.06.04 № 322.
6. Постановление Главного государственного санитарного
врача Российской Федерации «О порядке проведения санитарно-эпидемиологической
экспертизы пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных
источников» от 08.11.00 № 14.
7. Постановление Главного государственного санитарного
врача Российской Федерации «Об усилении надзора за пищевыми продуктами,
полученными из ГМИ» от 31.12.04 № 13.
8. СанПиН
2.3.2.1078-01
«Продовольственное сырье и пищевые продукты. Гигиенические требования
безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов».
9. ГОСТ 5904-82 «Изделия кондитерские. Правила приемки, методы отбора
и подготовки проб».
10. ГОСТ 9163-90 «Консервы мясные и мясорастительные. Сосиски.
Технические условия».
11. ГОСТ 12292-00 «Консервы рыбные с растительными гарнирами.
Технические условия».
12. ГОСТ 10852-86 «Семена масличные. Правила приемки и методы отбора
проб».
13. ГОСТ 12430-66 «Продукция сельскохозяйственная. Методы отбора проб
при карантинном досмотре и экспертизе».
14. ГОСТ 26313-84 «Продукты переработки плодов и овощей. Правила
приемки, методы отбора проб».
15. ГОСТ 22617.0-77 «Семена сахарной свеклы. Правила приемки и методы
отбора проб».
16. ГОСТ 27668-88 «Мука и отруби. Приемка и методы отбора проб».
17. ГОСТ 26312.1-84 «Крупа. Правила приемки и методы отбора проб».
18. ГОСТ 9792-73 «Колбасные изделия и продукты из свинины, баранины,
говядины и мяса других видов убойных животных и птиц. Правила приемки и методы
отбора проб».
19. ГОСТ 7631-85 «Рыба, морские млекопитающие, морские беспозвоночные
и продукты их переработки. Правила приемки, органолептические методы оценки
качества, методы отбора проб для лабораторных испытаний».
20. ГОСТ 12036-85 «Семена сельскохозяйственных культур. Правила приемки
и методы отбора проб».
21. ГОСТ Р 51447-99 «Мясо и мясные продукты. Методы отбора проб».
22. ГОСТ
17109-88 «Соя. Требования при заготовках и поставках».
23. ГОСТ 19341-73 «Консервы рыбные. Печень рыб с растительными добавками. Технические
условия».
24. ГОСТ 26809-86 «Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и
подготовка проб к анализу».
25. ГОСТ 27853-88 «Овощи соленые и квашеные, плоды и ягоды моченые. Приемка, отбор
проб».
26. ГОСТ 28741-90 «Продукты питания из картофеля. Приемка, подготовка проб и методы
испытаний».
27. ГОСТ 29142-91 «Семена масличных культур.
Отбор проб».
28. ГОСТ
13634-90 «Кукуруза. Требования при заготовках и поставках».
29. ГОСТ 15877-70 «Кукуруза сахарная консервированная. Технические условия».
30. ГОСТ 17110-71 «Соя (промышленное сырье). Требования при поставках. Технические
условия».
31. ГОСТ Р 50436-92 «Зерновые. Отбор проб зерна».
32. ГОСТ Р 50437-92 «Бобовые культуры в мешках.
Отбор проб».
33. ГОСТ Р
51926-2002 «Консервы. Икра овощная. Технические условия».
34. ГОСТ ИСО 2170-97 «Зерновые и бобовые. Отбор проб молотых продуктов».
Приложение
1
Пример гибридизационной картины продуктов амПЦР на
биологическом микрочипе
А
Б
А - схема
негелевого биологического микрочипа для идентификации ГМИ растительного
происхождения;
Б - гибридизационная картина
на экране компьютера, полученная в результате анализа генетически
модифицированной сои, содержащей промотор 35S и терминатор nos.
Приложение 2
Форма протокола испытаний по идентификации
генно-инженерно-модифицированных организмов (ГМО) растительного происхождения с
применением ферментного анализа на биологическом микрочипе
ПРОТОКОЛ
ИСПЫТАНИЙ
Серия АБ № 0000000
№________от
«____»________________200___г.
Продукция
_________________________________________________________________
|
Производитель сырья или продукции
__________________________________________
|
Предъявитель сырья или продукции ___________________________________________
|
Отбор проб произведен в соответствии с нормативным
документом на соответствующую группу сырья или продукции
_________________________________
|
Акт отбора проб и техническое задание на испытания №
_____ от __________________
|
Испытания проведены на основании требований
|
Номер образца _____________________________________________________________
|
Характеристика испытуемого образца (маркировка, вид
и состояние упаковки, этикетки, штрих кода)
|
в образцах № __________
отсутствует, а в образце № _________ присутствует
|
Маркировка:
_______________________________________________________________
|
Годен до _________________ Штриховой код
___________________________________
|
Результаты испытаний
Номер
образца
|
Трансгенные
последовательности
|
35S
|
gus
|
nos
|
nptII
|
ocs
|
|
|
|
|
|
|
Результаты анализа
_________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
|
Исполнители:
|
___________________ ___________________
|
подпись подпись
|
___________________ ___________________
|
подпись подпись
|
Руководитель испытательной лаборатории
____________________________________
|
подпись
|
м. п. _____________________________________
|
Фамилия, инициалы
|
Заключение распространяется на образец,
представленный на испытания.
|
СОДЕРЖАНИЕ
1. Область применения. 1
2. Общие положения. 2
3. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы.. 2
4. Подготовка к анализу. Приготовление растворов. 5
5. Отбор и подготовка проб пищевых продуктов для
анализа. 5
6. Проведение анализа. Выделение ДНК.. 5
7. Амплификация. 6
8. Проведение ДНК-гибридизации. 7
9. Проведение ферментного анализа. 7
10. Сканирование биологических микрочипов. 8
11. Анализ изображений биочипов. 8
12. Интерпретация результатов. 8
13. Организация рабочих мест. 9
Нормативные ссылки. 9
Приложение 1. Пример гибридизационной картины
продуктов амПЦР на биологическом микрочипе. 10
Приложение 2. Форма
протокола испытаний по идентификации генно-инженерно-модифицированных
организмов (ГМО) растительного происхождения с применением ферментного
анализа на биологическом микрочипе. 11
|