МУК 4.2.2316-08
Методы контроля бактериологических питательных сред

Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование _Российской    Федерации_

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Методы контроля бактериологических питательных сред

Методические указания МУК 4.2.2316—08

Издание официальное

Москва • 2008

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Методы контроля бактериологических питательных сред

Методические указания МУК 4.2.2316—08

ББК51.9

M54

M54 Методы контроля бактериологических питательных сред: Методические указания.—М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2008.—67 с.

ISBN 5—7508—0731—2

1.    Разработаны: Федеральным юсударственным учреждением науки «Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л. А. Тарасеви-ча» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (С. М. Суханова, Н. Е. Захарова, Э. И. Конду, И. А. Голубенко).

2.    Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 6 декабря 2007 г. № 3).

3.    Утверждены и введены в действие Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г. Г. Онищенко 18 января 2008 г.

4.    Введены впервые взамен документов - «Методические указания по применению физико-химических методов контроля питательных сред», (Москва, 1977) и «Методические рекомендации к контролю питательных сред по биологическим показателям» (Москва, 1980).

ББК51.9

ISBN 5—7508—0731 —2

© Роспотребнадзор, 2008 © Федеральный центр гигиены н

эпидемиологии Роспотребнадзора, 2008

МУК 4.2.2316—08

Содержание

1.    Область применения..................................................................................................................4

2.    Нормативные и методические ссылки.....................................................................................4

3.    Общие положения......................................................................................................................5

4.    Термины и определения.............. 5

5.    Общие указания при оценке качества питательных сред......................................................6

6.    Определение физико-химических показателей......................................................................7

6.1.    Общие указания для приготовления реактивов..............................................................7

6.2.    Описание препарата...........................................................................................................8

6.3.    Определение растворимости.............................................................................................8

6.4.    Определение прозрачности и цветности.........................................................................9

6.5.    Определение pH..................................................................................................................9

6.6.    Определение белка...........................................................................................................10

6.7.    Определение содержания пептидов по биуретовой реакции......................................11

6.8.    Определение общего азота с реактивом Несслера.......................................................12

6.9.    Определение содержания аминного азота формольным титрованием......................14

6.10.    Определение содержания хлоридов аргентомстрическим методом (в

пересчете на натрия хлорид).........................................................................................15

6.11.    Определение потери в массе при высушивании.........................................................17

6.12.    Определение сухого остатка.........................................................................................18

6.13.    Определение стерильности готовых к применению сред..........................................18

6.14.    Определение прочности студня агаровых сред по Валенту......................................19

6.15.    Определение температуры застудневания..................................................................21

6.16.    Определение температуры плавления студня среды.................................................22

6.17.    Определение продолжительности плавления студня среды.....................................22

6.18.    Определение срока годности........................................................................................22

7.    Оценка специфической активности питательных сред по биологическим

показателям...............................................................................................................................24

7.1 Подготовка образцов питательных сред для контроля.................................................24

7.2.    Тест-штаммы.....................................................................................................................25

7.3.    Определение показателя стабильности основных биологических свойств

микроорганизмов............................................................................................................36

7.4.    Определение показателей чувствительности среды и скорости роста

микроорганизмов............................................................................................................37

7.5.    Определение дифференцирующих свойств среды.......................................................37

7.6.    Определение ингибирующих свойств среды................................................................38

7.7.    Определение эффективности среды...............................................................................39

7.8.    Определение показателя прорастания микроорганизмов............................................41

7.9.    Определение нейтрализующих свойств среды.............................................................41

7.10.    Определение показателя чувствительности микроорганизмов к

антимикробным препаратам диск-диффузионным методом....................................42

7.11.    Определение показателей сохранения жизнеспособности и стабильности

основных биологических свойств микроорганизмов в транспортных средах........43

Приложение /. Перечень показателей, необходимых дзя контроля основных групп

питательных сред.............................................................................................44

Приложение 2. Требования к специфической активности зарегистрированных в РФ

бактериологических питательных сред и добавок.......................................46

Приложение 3. Перечень организаций, на базе которых функционируют

специализированные коллекции ПБА I—IV групп...........................................67

3

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г. Г. Онищенко

18 января 2008 г.

Дата введения: с момента утверждения

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Методы контроля бактериологических питательных сред

Методические указания _МУК    4.2.2316—08_

1. Область применения

1.1.    Настоящие методические указания предназначены для работников организаций, осуществляющих:

•    изготовление и контроль качества бактериологических питательных сред (диагностических, для культивирования, транспортных и др.) и (или) их основ при серийном промышленном выпуске;

•    конструирование новых питательных сред;

•    изготовление сред из отдельных компонентов по прописям, а также могут быть использованы:

-    при экспертизе НД и

-    при проведении внутрилабораторного контроля качества коммерческих питательных сред.

1.2.    Настоящие методические указания распространяются на исследования бактериологических питательных сред отечественного и зарубежного производства.

2. Нормативные и методические ссылки

2.1. Государственная Фармакопея СССР XI издания. Вып. 1, 2.

МУК 4.2.2316—08

2.2.    Методические указания по методам контроля МУК 4.1/4.2.588—96 «Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям» /Минздрав России. М., 1998.

2.3.    Санитарные правила СП 3.3.2.561—96 «Государственные испытания и регистрация новых медицинских иммунобиологических препаратов» /Минздрав России. М., 1998.

2.4.    Санитарные правила СП 1.2.036—95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I—IV групп патогенности» /Госкомсанэпиднадзор России. М., 1996.

2.5.    Микробиология. Продукты пищевые. Общие правила микробиологических исследований: ГОСТ Р 51446-99 (ISO 7218—96).

2.6.    Агар микробиологический: ГОСТ 17206-96.

2.7.    Методические рекомендации «Определение сроков годности сухих микробиологических сред и питательных основ методом «Ускоренного старения» при повышенной температуре». Махачкала, 1987.

2.8.    Водоросли морские, травы морские и продукты их переработки: ГОСТ 26185-84.

2.9.    Методические рекомендации к контролю питательных сред по биологическим показателям. М., 1980.

2.10.    Методические указания по применению физико-химических методов контроля питательных сред. М., 1977.

2.11.    Методические указания «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам»: МУК 4.2.1890—04.

3. Общие положения

3.1.    Целью введения настоящих методических указаний является регламентация стандартных методов контроля бактериологических питательных сред.

3.2.    Методические указания содержат описание общих методов контроля бактериологических питательных сред. Особенности контроля качества сред, не охватываемые настоящим документом, должны быть описаны в нормативной документации на эти препарат.

4. Термины и определения

4.1.    Бактериологические питательные среды (БПС) - препараты, предназначенные для выявления, накопления, культивирования, дифференциальной диагностики, транспортирования и хранения микроорганизмов.

4.2.    МИБП (медицинские иммунобиологические препараты) - лекарственные средства, предназначенные для иммунопрофилактики, диагностики и иммунотерапии заболеваний. ⁵

5

4.3.    Качество бактериологических питательных сред (основ, добавок) - совокупность свойств продукции, обусловливающих ее способность удовлетворять определенным требованиям в соответствии с назначением.

4.4.    Серия препарата - количество препарата, полученного в результате смешивания сухих компонентов питательной среды в мельнице-смесителе или сушки жидкого полуфабриката (для сухих питательных сред) при одноразовой закладке. Для жидких или агаризованных питательных сред, готовых к применению, под серией препарата подразумевают совокупность емкостей, полученных из полуфабриката одной емкости.

4.5.    Оценка результатов. Определение положительного или отрицательного результата.

4.6.    Разведение культуры. Величина, указывающая во сколько раз была разведена суспензия культуры (например, 10 , 10'⁷ и т. д.) в отношении исходной, соответствующей 10 ед. по стандартному образцу мутности ФГУН ГИСК им. Л. А. Тарасевича (ОСО-42-28-85 П).

5. Общие указания при оценке качества питательных сред

I. Оценка качества питательных сред и их компонентов проводится с помощью совокупности показателей, выбираемых для контроля среды в соответствии с ее назначением и включает:

1. Контроль качества препарата по физико-химическим показателям. ^{* •}

•

Используемые в лабораториях коммерческие питательные среды контролируются на предприятиях-изготовителях, поэтому внутрилабораторный контроль их качества проводят только в случаях:

•    указания на необходимость проведения контроля в приказах Минздрава РФ, инструкции по применению или других документах;

•    несоответствия клинического диагноза результатам микробиологического исследования в лаборатории;

•    неудовлетворительного выполнения внешней оценки качества микробиологических исследований;

•    неудовлетворительного качества среды при использовании в практической работе;

•    несоответствия величины колоний искомого микроорганизма данному виду бактерий при росте в данной среде;

•    позднего появления роста культуры в среде, не соответствующего срокам для данного микроорганизма;

•    отсутствия подавления роста сопутствующей микрофлоры на среде с заявленными ингибирующими свойствами.

Для внутрилабораторного контроля качества коммерческих питательных сред, контроль которых не предусмотрен действующими нормативными докуме1ггами, необходимо проводить визуальную оценку качества, определять значение pH готовой среды, стерильность каждой приготовленной серии (см. р. 7.1.1 «Контроль чистоты розлива»), а также оценивать качество среды с помощью контрольных штаммов.

МУК 4.2.2316—08

2. Контроль специфической активности препарата по биологическим показателям.

Перечень показателей, необходимых для контроля основных групп питательных сред, приведен в прилож. 1.

Готовую среду засевают культурой (тест-штаммом) того (целевого) микроорганизма, для которого приготовлена среда, и гетерологичных штаммов и визуально (или под малым увеличением микроскопа) изучают характер его роста. Рост микроорганизмов оценивают с помощью количественных (для плотных сред), полуколичественных или качественных методов .

Для оценки результатов качественным методом определяют наличие и характер роста каждого из тест-иггаммов. Рост целевых тест-штаммов должен быть типичным по цвету, размеру и морфологии колоний; рост нецелевых должен частично или полностью подавляться.

Для оценки результатов количественным методом при интерпретации ингибирующих, накопительных или задерживающих рост свойств среды, подсчитывают количество выросших колоний на тестируемой и контрольной (среде выращивания) средах.

Требования к специфической активности зарегистрированных в РФ бактериологических питательных сред и добавок перечислены в прилож. 2.

II.    Количество образцов одной серии среды для контроля - не менее трех.

III.    Серия среды признается годной только после проведения всех видов контроля.

6. Определение физико-химических показателей 6.1. Общие указания для приготовления реактивов

Концентрация. При указании концентрации растворов в процентах, следует подразумевать весобъемные проценты. Например, для приготовления 10 %-го раствора следует брать 10 г вещества на 100 мл готового раствора.

Точная навеска. Взвешивание на аналитических весах с точностью до 0,0002 г. Если не указано «точная навеска», то навеску берут с точностью до 0,01 г.

Постоянная масса - разница в массе между последовательными взвешиваниями, не превышающая 0,0005 г. ^{* 7}

Возможно использование среды сравнения - среды ранее отконтролированной и удовлетворяющей требованиям качества.

7

Оценка результатов. Результаты рассчитывают на основании не менее двух параллельных определений. За окончательный результат анализа принимают среднее арифметическое значений результатов двух параллельных измерений. Допустимое отклонение от средней величины не должно превышать 10 %.

Реактивы и титрованные растворы. Реактивы и титрованные растворы, приведенные в настоящих МУК, описаны в соответствующих разделах Государственной Фармакопеи СССР XI издания, вып. 2, если нет других указаний.

Квалификация реактивов. Для анализа необходимо использовать реактивы квалификации хч и чда.

Растворитель - вода очищенная (ФС 42-2619—97), если нет других указаний.

Хранение реактивов. Растворы реактивов хранят при температуре 18—20 °С в течение 6 мес., если нет изменений их физических свойств или нет других указаний.

Контрольный опыт (контроль на реактивы). Под контрольным опытом подразумевают определение, проводимое с тем же количеством реактивов и в тех же условиях, но без испытуемого препарата, вместо которого используют растворитель.

6.2. Описание препарата

Внешний вид препарата определяют визуально, указывая:

•    физическое состояние (жидкость, мелкодисперсный порошок, гель);

•    цветность ;

•    прозрачность (для препаратов готовых к применению). Препарат может быть либо прозрачным, либо с незначительной опалесценцией, либо мутный);

•    гигроскопичность (для сухих препаратов);

•    светочувствительность (при наличии в составе компонентов, разрушающихся на свету.

6.3. Определение растворимости

Количество препарата (г), необходимое для приготовления конкретной серии питательной среды, должно растворяться при перемешивании и, если необходимо, при кипячении в течение 2—3 мин.

11репарат считают растворившимся, если в растворе при визуальном наблюдении в проходящем свете не обнаруживаются частицы вещества.

При описании цвета оттенок указывают перед основным цветом (например, «желтовато-коричневый»).

МУК 4.2.2316—08

Для препаратов, образующих при растворении мутные растворы, соответствующее указание должно быть приведено в нормативной документации и инструкции по применению.

6.4. Определение прозрачности и цветности

Прозрачность и цветность сухих препаратов определяется визуально в проходящем свете в растворе после фильтрации его через ватно-марлевый фильтр (агаровые среды) и бумажный фильтр (жидкости) (подготовку образца см. раздел 6.3 «Определение растворимости») (см. примечание раздела «Описание препарата»).

Прозрачность и цветность готовых сред, разлитых во флаконы определяют визуально в проходящем свете. Агары предварительно расплавляют в кипящей водяной бане и разливают в чашки Петри слоем 4—5 мм.

Раствор препарата, а также готовая среда могут быть либо прозрач-ными, либо с незначительной опалесценцией, либо непрозрачными.

После приготовления среды из сухого препарата (стерилизации, розлива в чашки Петри, пробирки и подсушивания) показатель прозрачности и цветности указывается также и для готовой среды.

6.5. Определение pH

Определение pH питательных сред проводят потенциометрическим методом с применением стеклянного электрода.

Калибровка и проверка pH-метра (потенциометра). Подготовка pH-метра и электродной системы производится согласно инструкциям, прилагаемым к прибору. Перед работой на потенциометре необходимо, пользуясь стандартными буферными растворами со значениями pH 4,01; 6,86; 9,18 при 25 °С, провести калибровку прибора*. Для приготовления таких растворов могут быть использованы фиксаналы (ГОСТ 8-135— 74). Различие между показанием прибора и номинальным значением pH буферного раствора не должно превышать 0,04 единицы pH.

При измерении pH контролируемых растворов отсчет величины pH по шкале прибора производят после того, как показания прибора примут установившееся значение. Время установления показаний определяется буферными свойствами и температурой раствора (обычно время уста-

•

Если pH контролируемого раствора отличается менее чем на единицу от pH стандартного буферного раствора, то достаточна проверка прибора по одному буферному раствору, величина pH которого лежит в том же диапазоне измерения, что и значения pH контролируемого раствора. Если pH контролируемых растворов находятся в широких пределах, то проверку pH-метра следует производить по двум (трем) стандартным буферным растворам в соответствии с инструкцией.

9

новления показаний не превышает 2 мин). Определение pH проводят при (25 ± 2) °С, в противном случае необходимо сделать соответствующие поправки (подвести ручку термокомпенсатора либо использовать коэффициент пересчета). При измерении pH агаровых сред следует иметь ввиду, что полученные значения pH являются условными.

Оценку значения pH питательных сред необходимо проводить с учетом последующей стерилизации.

Примечание: автоклавирование, как правило, приводит к снижению pH, поэтому перед стерилизацией pH среды повышают на 0,2 единицы от требуемой величины, а после автоклавирования реакцию среды проверяют повторно.

Метод измерении pH

Подготовка проб:

•    в готовых жидких средах и гидролизатах определение pH проводят непосредственно в растворе;

•    для готовых плотных агаровых сред определение pH проводят в расплавленном и охлажденном до 45—50 °С препарате (необходимо особо тщательно отмывать электрод после измерения pH в агаризован-ных средах теплой (50—60 °С) дистиллированной водой; предпочтительно для этих сред пользоваться специально выделенным рН-метром). Возможно также определение pH в экстракте, приготовленном добавлением к 2,00 г измельченного студня 100 мл дистиллированной воды (pH 7,0—7,2), настаивания в течение 1 ч при температуре 18—25 °С с периодическим перемешиванием стеклянной палочкой и последующим фильтрованием через бумажный фильтр;

•    для сухих препаратов, не содержащих агар, определение pH проводят в 2 %-м растворе, приготовленном добавлением к 2,00 г сухого препарата 100 мл дистиллированной воды, перемешиванием и последующим фильтрованием через бумажный фильтр;

•    для сухих препаратов, содержащих агар, определение pH проводят в экстракте, приготовленном добавлением к 2,00 г сухого препарата 100 мл дистиллированной воды, настаиванием с периодическим перемешиванием в течение 1 ч при температуре 18—25 °С и последующим фильтрованием через бумажный фильтр.

6.6. Определение белка

Качественное определение отсутствия следов белка в пептонах -компонентах питательных сред - проводят визуально с использованием трихлоруксусной кислоты (ССЬСООН) для их осаждения.

МУК 4.2.2316—08

Реактивы: 20 %-я трихлоруксусная кислота.

Ход определения

К 5 мл 5 %-го раствора анализируемого препарата добавляют равный объем 20 %-й CCljCOOH, тщательно перемешивают.

Помутнение раствора через 5 мин свидетельствует о присутствии в препарате следов белка.

6.7. Определение содержания пептидов по биуретовой реакции

Метод основан на способности пептидов давать цветную реакцию с биуретовым реактивом. Концентрацию пептидов («пептонов») определяют путем сравнения интенсивности окраски испытуемого и стандартного растворов.

Реактивы: 1) 2 %-й раствор меди сульфата в 9 %-м растворе натрия-калия тартрата - реактив А;

Приготовление реактива А. Растворяют 1 г меди сульфата (CuS0₄ • 5 Н₂0) в нескольких миллилитрах воды. В этот раствор прибавляют 4,5 г натрия-калия тартрата, предварительно растворенного в 40 мл воды. Объем раствора доводят водой до 50 мл. Раствор годен к употреблению в течение дня.

2)    10 %-й раствор натрия едкого;

3)    0,9 %-й раствор натрия хлорида;

4)    1 %-й стандартный раствор пептона (ГОСТ 13805-76).

Приготовление I %-го стандартного раствора пептона. Стандартный

раствор 1 %-го пептона готовят с учетом влажности при растворении навески в 0,9 %-м растворе натрия хлорида. Реактив хранят в холодильнике. В качестве консерванта используют мертиолят (1 : 10 000).

Приготовление контрольного раствора. К 5 мл 0,9 %-го раствора натрия хлорида добавляют 0,5 мл 10 %-го раствора натрия едкого и 0,5 мл реактива А.

Построение калибровочной кривой. Из стандартного раствора готовят ряд разведений с содержанием пептона от 0,1 до 0,5 % на 0,9 %-м растворе натрия хлорида с интервалом 0,1 %. К 5 мл каждого разведения прибавляют 0,5 мл 10 %-го раствора натрия едкого и 0,5 мл реактива А.

Пробы колориметрируют сразу после внесения реактивов на фотоэлектро-колоримстре (ФЭК) при длине волны 540 нм в кюветах с толщиной слоя 5 мм против контрольного раствора. По показаниям прибора строят кривую зависимости оптической плотности от концентрации пептона. Калибровочную кривую проверяют перед каждым определением.

Подготовка проб. Для анализа используют гидролизаты и питательные среды, разведенные в 10 раз 0,9 %-м раствором натрия хлорида.

11

Ход определения

К 5 мл испытуемого раствора добавляют 0,5 мл 10 %-го раствора едкого натрия и 0,5 мл реактива А.

Одновременно готовят контрольную пробу и проводят определение, как описано при построении калибровочной кривой. Концентрацию пептона в испытуемом растворе в процентах вычисляют по калибровочной кривой и производят перерасчет с учетом разведения.

6.8. Определение общего азота с реактивом Несслера

Принцип метода основан на свойстве реактива Несслера давать цветную реакцию с ионами аммония (NH₄)\ образующимися после минерализации азотсодержащих органических веществ.

Реактивы: 1) серная кислота концентрированная;

2)    водорода перекись. Пергидроль (29—35 %) (Г ОСТ 10929—76);

3)    реактив Несслера (готовый);

4)    раствор аммония серно-кислого, содержащий 0,05 мг/мл азота.

Приготовление стандартного раствора серно-кислого аммония (0,1 мг/мл

азота). Из образца аммония сульфата, предварительно доведенного до постоянной массы (в эксикаторе над безводным кальция хлоридом), берут его точную навеску - 0,2357 г и растворяют в мерной колбе (v = 500 мл) в дистиллированной воде, доводя объем раствора до метки. Стандартный раствор хранят в течение 1 года при температуре 4—8 °С в колбе с притертой пробкой. Перед определением стандартный раствор разводят водой в 2 раза.

Построение калибровочной кривой. В пробирки вносят по 0,1— 0,2—0,3—0,4—0,5 мл раствора аммония серно-кислого (содержание азота от 5 до 25 мкг с интервалом 5 мкг). Объем каждой пробы доводят водой до 9,5 мл, перемешивают, затем прибавляют по 0,5 мл реактива Несслера. Пробы вновь перемешивают, а затем колориметрируют на фотоэлектроколориметре с синим светофильтром (X ~ 400 нм) в кюветах с толщиной слоя 10 мм.

Раствором сравнения служит контрольная проба, содержащая 0,5 мл реактива Несслера в 9,5 мл воды. По показаниям прибора строят кривую зависимости оптической плотности от концентрации азота. Калибровочный график воспроизводят при каждом определении. ^•

•

Мелодика может быть рекомендована для гидролизатов и питательных сред с определенной цветностью. Показатель оптической плотности среды не должен превышать 0,2 при определении на фотоэлектроколоримстре при длине волны 540 нм в кюветах с толщиной слоя 5 мм против воды.

МУК 4.2.2316—08

Ход определения

Подготовка проб. Для анализа в пробирку пипеткой вносят 1 мл раствора образца, с содержанием общего азота 100-—200 мкг*.

На песчаной бане минерализуют 1 мл исследуемого образца (2 параллельные пробы) с 0,1 мл концентрированной серной кислоты в пробирках со стеклянными колпачками. Параллельно минерализуют контрольную пробу, содержащую 0,1 мл концентрированной серной кислоты. Для ускорения минерализации в охлажденные испытуемые и контрольные пробы периодически добавляют по 1—2 капли пергидроля. Сжигание продолжают до обесцвечивания содержимого пробирок (не менее 10 ч).

К полученным минсрализатам добавляют по 8,9 мл дистиллированной воды, предварительно обмыв колпачок, тщательно перемешивают растворы. На колориметрирование отбирают по 1 мл раствора мине-рализата (10—20 мкг азота), добавляют 8,5 мл дистиллированной воды, перемешивают, а затем - по 0,5 мл реактива Несслера. Пробы перемешивают и колоримстрируют на фотоэлектроколориметре с синим светофильтром ((А.-400 нм) в кюветах с толщиной слоя 10 мм. Раствором сравнения служит раствор, приготовленный аналогично образцу.

Содержание общею азота в препарате в процентах (.X) вычисляют по формуле:

Для сухого образца (сухой гидролизат, сухая питательная среда)

_v >4 10 100 А

X =-=    —    где

1,0-С-1 000 С

А - количество азота (мкг), рассчитанное по калибровочному графику;

10 - разведение минерализата;

100 - коэффициент пересчета в проценты;

1,0 - количество анализируемого препарата (мл);

С - анализируемая навеска образца (мг), содержащаяся в 1 мл раствора образца;

1 000 - коэффициент пересчета микрограммов в миллиграммы.

Для жидкого образца (жидкий гидролизат):

_х_ д-ю loo юр в “ 1,о 1,0-1 ооо ооо ~ ю ’^где

В - количество азота (мкг), найденное по калибровочному графику;

При анализе сухой питательной среды, содержащей 5—10% общего азота, готовят 0,2 %-й раствор на дистиллированной воде (анализируемая навеска образца С - 2 мг).

При анализе сухого гидролизата, содержащего 12—17% общего азота, готовят 0,1 %-й раствор (анализируемая навеска образца С - 1 мг).

Жидкий гидролизат следует развести в 100 раз.

13

10 - разведение минерализата;

100 - степень разведения жидкого гидролизата;

100 - коэффициент пересчета (%);

1.0    - количество препарата (мл), взятое для колориметрирования;

1.0    - количество исследуемого образца (мл), взятое для минерализации;

1 000 000 - коэффициент пересчета (г).

6.9. Определение содержания аминного азота формолъным титрованием

Определение содержания аминного азота в питательных средах проводят методом формольного титрования. Принцип метода основан на блокировании формальдегидом при pH 7,0 свободных аминогрупп и титровании щелочью эквивалентного количества карбоксильных групп. Начало и конец титрования определяют потенциометрически.

Реактивы: 1) натрия гидроксид (0,1 моль/л) или раствор соляной кислоты (0,1 моль/л);

2)    натрия гидроксид 10 %-й раствор;

3)    раствор формалина (40 %-й раствор формальдегида)' (ГОСТ 1625-75).

Ход определения

В стакан вместимостью 50 мл наливают необходимый объем (А) (подготовка проб см. примечания 1 и 2) анализируемого раствора препарата, содержащего 1,5—5,0 мг аминного азота, и доводят общий объем дистиллированной водой до 20 мл. Электроды потенциометра (см. определение pH) погружают в исследуемый раствор, pH которого доводят до значения 7,0 с помощью раствора натрия гидроксида (0,1 моль/л) или раствора соляной кислоты (0,1 моль/л)'*.

К нейтрализованному раствору добавляют 2 мл нейтрального формалина, перемешивают и, не вынимая электроды, титруют содержимое раствором натрия гидроксида (0,1 моль/л) до pH 9,1 *. Проводят два параллельных измерения.

Содержание аминного азота в исследуемом препарате в процентах (X) вычисляют по следующим формулам.

Для сухого образца:

Перед каждым определением pH формалина доводят до pH 7,0 10 %-м раствором натрия гидроксида.

^ В ходе определения электроды должны все время оставаться погруженными в раствор. При титровании следует использовать бюретку, вместимостью 5 мл.

МУК 4.2.2316—08

„ V К 1,4 100 х =- ,    где

V - количество раствора натрия гидроксида (0,1 моль/л) в миллилитрах, пошедшее на титрование испытуемой пробы от pH 7,0 до 9,1;

К - поправка к титру раствора натрия гидроксида (0,1 моль/л);

1,4 - количество аминного азота в миллиграммах, эквивалентное

1,0 мл р-ра натрия гидроксида (0,1 моль/л);

С - анализируемая навеска сухого препарата в миллиграммах, содержащаяся в титруемом объеме «Л»;

100 - коэффициент пересчета миллиграммов в проценты.

Примечание 1.

Для сухих образцов (гидролизаты, экстракты, среды (1,5—4,0 % аминного азота) - «А» = 10 мл 1 %-го р-ра (анализируемая навеска образца «С» составляет соответственно 100 мг).

Для жидкого образца:

^ - л: -1,4 юр

Л-1000

, где

А - количество жидкого образца (мл), взятого на анализ;

100 - коэффициент пересчета миллиграммов в проценты;

1 000 - коэффициент пересчета миллиграммов в граммы.

Примечание 2:

•    для жидких гидролизатов низкой степени расщепления (0,1—0,2 % аминного азота) «А» - 3 мл;

•    для жидких гидролизатов средней степени расщепления (0,3—0,6 % аминного азота) «Л» = 1 мл;

•    для жидких гидролизатов высокой степени расщепления (0,7—1,3 % аминного азота) «Л» = 0,5 мл;

•    для жидких питательных сред (0,08—0,14 % аминного азота) «Л» = 10 мл;

•    для готовых плотных агаровых сред «Л» = 3 мл препарата, расплавленного в кипящей водяной бане.

6.10. Определение содержания хлоридов аргентометрическим методом (в пересчете на натрия хлорид)

Метод основан на определении ионов хлора после окисления белков перманганатом калия в кислой среде в присутствии нитрата серебра, избыток которого оттитровывают раствором роданида аммония. Реактивы: 1) серебро азотно-кислое - 0,01 н раствор (готовят, используя стандарт-титр (фиксанал) ;

15

Ex tempore готовят 0,01 моль/л раствор разведением 0,1 моль/л раствора (1 : 10).

2)    кислота азотная концентрированная;

3)    аммония роданид - 0,1 моль/л раствор (готовят, используя стандарт-титр фиксанал)*;

4)    калий марганцово-кислый - насыщенный раствор;

5)    глюкоза безводная, не содержащая С1 ;

6)    железоаммиачные квасцы, насыщенный раствор (к 40 %-му р-ру на холоде прибавляют но каплям концентрированную азотную кислоту до перехода коричневой окраски в желтовато-зеленую. Хранить в защищенном от света месте.

Ход определения

Для анализа используют объем «В, мл» жидкого образца.

Подготовка проб.

•    Жидкие питательные среды, содержащие 0,5—0,9 % NaCl, «В» = 0,2 мл.

•    Для жидких гидролизатов (1—10% NaCl), пробу развести в 10 раз дистиллированной водой:

-при содержании NaCl 1—5 % - «В» = 0,5мл;

-при содержании NaCl 6—10 % - «В» = 0,2мл.

•    Для сухих гидролизатов (1—10% NaCl), готовят 10 %-й раствор на дистиллированной воде:

•    при содержании NaCl в образце 1—5 % (анализируемая навеска образца С = 50 мг)«В» = 0,5мл;

•    при содержании NaCl в образце 6—10% (анализируемая навеска образца С = 20 мг) В = 0,2 мл.

•    Для сухих питательных сред, содержащих 10—30% NaCl, готовят 1,0 %-й раствор на дистиллированной воде и берут на анализ объем «В» = 0,5 мл (анализируемая навеска образца С = 5 мг).

В коническую колбу вместимостью 50 мл вносят 10 мл дистиллированной воды, а затем 0,2 мл препарата, содержащего 0,5—1,0 мг/мл (оптимальные значения содержания в питательных средах) натрия хлорида, прибавляют 5 мл р-ра азотно-кислого серебра (0,01 моль/л) и 1 мл концентрированной азотной кислоты. Смесь осторожно нагревают на асбестовой сетке до кипения. К испытуемому раствору прибавляют по каплям насыщенный раствор калия марганцово-кислого до бледно-розового окрашивания, не исчезающего в течение 5 мин. Затем прибавляют на кончике скальпеля сухую глюкозу (около 10 мг) до исчезновения окраски. После охлаждения раствора избыток ионов серебра титруют раствором аммония роданида (0,01 моль/л) до образования розового

МУК 4.2.2316—08

окрашивания (индикатор - железо-аммонийные квасцы - насыщенный - 40 % р-р), определяя объем, пошедший на титрование.

Параллельно проводят контрольный опыт ~ в качестве образца берут 0,2 мл дистиллированной воды.

Содержание натрия хлорида в жидких препаратах в процентах (X) вычисляют по формуле:

_v (А- Д) К 0,000585 Я-100 * =- .где

А - количество раствора аммония роданида (0,01 моль/л), пошедшего на титрование в контрольном опыте, мл;

Д - количество раствора аммония роданида (0,01 моль/л), пошедшего на титрование испытуемого раствора, мл;

К - поправка к титру раствора аммония роданида;

В - количество испытуемого раствора, мл;

Р - степень разведения жидкого образца (для питательных сред Р = 1, для гидролизатов Р = 10);

0,000585 - количество натрия хлорида, соответствующее 1 мл раствора роданида аммония (0,01 моль/л), г;

100 - коэффициент пересчета в проценты.

Содержание натрия хлорида в сухих препаратах в процентах (-Y) вычисляют по формуле:

_v (А-Д)К- 0,000585 100

X = --—-—-, где

С

С - навеска образца, мг.

Остальные обозначения см. выше.

6.11. Определение потери в массе при высушивании

Стеклянные бюксы высотой 45 мм и диаметром 28 мм доводят до постоянной массы при температуре 100—105 °С.

Около 0,15—0,20 г (точная навеска) препарата помещают в бюксы и сушат в сушильном шкафу при температуре (100—105) °С в течение 2 ч. После чего бюксы с закрытыми крышками выдерживают в эксикаторе в присутствии кальция хлорида безводного в течение 30—40 мин до полного охлаждения и взвешивают .

Расчет массовой доли влаги в процентах проводят по разности масс до и после высушивания.

Анализ проводят при температуре (20 ± 5) °С и относительной влажности воздуха 40—80 %.

17

6.12. Определение сухого остатка

Принцип метода основан на удалении влаги путем выпаривания исследуемого раствора и последующем высушивании остатка до постоянного веса.

Подготовка проб. Для анализа отбирается 1 мл исследуемого образца.

Ход определенна

Анализ проводят во взвешенной и доведенной до постоянной массы фарфоровой чашке (d= 7 см), куда наливают 1 мл исследуемого образца и выпаривают его на кипящей водяной бане (при постоянном помешивании препаратов, содержащих агар). После испарения жидкости чашку ставят в сушильный шкаф (100 ± 5) °С на 2 ч, охлаждают в эксикаторе и взвешивают на аналитических весах.

Содержание сухого остатка (%) рассчитывают но формуле:

X -

(Л-Д)-ЮО

в

, где

А - вес чашки (г) с исследуемым образцом после высушивания; Д - вес чашки;

100 - коэффициент пересчета в проценты;

В - объем анализируемого образца (мл).

6.13. Определение стерильности готовых к применению сред

Определение стерильности готовой питательной среды проводят визуально путем просмотра 3—5 % каждой партии после инкубации в термостате при температуре 37 °С в течение 2—14 сут. в зависимости от типа среды.

Обнаружение после инкубации помутнения жидкой (полужидкой) среды или появление на чашках (пробирках) более 2—4 колоний свидетельствует о нестерильности среды, и вся исследуемая среда подлежит повторному контролю на удвоенном количестве образцов. При повторном подтверждении результата среда подлежит уничтожению.

Определение стерильности добавок питательных сред (кровь, сыворотка крови) проводят методом прямого посева.

Пробу препарата объемом 1 мл высевают в 2 пробирки, содержащие по 20,0 мл тиогликолевой среды, одну из которых инкубируют при 30—35 °С для выявления аэробных и анаэробных микроорганизмов, а другую при 20—25 °С для выявления грибов и бактерий с оптимумом роста в данном температурном режиме. Продолжительность инкубации

МУК 4.2.2316—08

посевов 14 сут. В течение всего срока проводится их периодический просмотр.

В случае помутнения питательной среды после внесения в нее испытуемого препарата следует в интервале от 3 до 7 сут. после посева сделать пересев приблизительно по 0,5 мл на две пробирки, содержащие

10,0 мл тиогликолсвой среды. Все пробирки выдерживают после пересева при соответствующих температурах до окончания инкубации (14 сут.) со дня первичного посева.

Среды, приготавливаемые из сухих препаратов и (или) разливаемые в лаборатории в чашки (пробирки), контролируют на чистоту розлива (см. «Подготовка образцов питательных сред для контроля. Контроль чистоты розлива»).

6.14. Определение прочности студня агаровых сред по Валенту

Прочность студня среды. Сущность метода заключается в определении массы нагрузки, необходимой для разрушения структуры образца. Определение проводят с помощью прибора Валета (рис. 1).

Примечание.

Подготовка оборудования:

•    сборные цилиндры (стаканчики) свинчиваются так, чтобы центральная выпуклость диска - отметка - была обращена кверху;

•    в приборе Ваяента проверяются: линии отвеса и устойчивость прибора на всех регулировочных ножках. В сборник при помощи воронки насыпается песок, на шпильку нажимного штока надевается приёмник песка.

Время от времени проверяется скорость истечения песка за 1 с. Для этого на шпильку давящего штока надевается большой приемник (вес известен) и песок из сборника выпускается ровно 30 с. Шнур надо держать туго натянутым. Скорость истечения песка в приборе Валента подгоняется с помощью винта к 10,4—10,8 г/с, после чего винт закрепляется контргайкой. Песок из сборника выпускается ровно 30 с. Приемник с песком взвешивается. Масса песка (без приемника, деленная на 30, дает скорость истечения песка в 1 с. Определение проводят не менее 3 раз и рассчитывают средний показатель;

•    песок, применяемый в приборе, приготавливается из кварцевого путем промывки его разбавленной соляной кислотой (12 ч), водой, высушивания и отсева на почвенных ситах. Для работы используется фракция с диаметром частиц более 0,5 мм.

Подготовка проб.

Для готовых препаратов. Готовую агаровую среду выдерживают в кипящей водяной бане до полного расплавления студня осторожно помешивая круговыми движениями, и немедленно разливают в 3 сборных цилиндра по 30 мл.

19