Товары в корзине: 0 шт Оформить заказ
Стр. 1 

18 страниц

258.00 ₽

Купить МР 2453-81 — бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль"

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

Способы доставки

  • Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
  • Курьерская доставка (7 дней)
  • Самовывоз из московского офиса
  • Почта РФ

Методические рекомендации предназначены для сотрудников исследовательских лабораторий медицинского и биологического профиля, занимающихся тестированием на канцерогенность.

 Скачать PDF

Оглавление

I. Принципы отбора веществ для исследования

II. Планирование эксперимента

     Лабораторные животные

     Пути введения испытуемого вещества

     Продолжительносгь опыта

     Выбор дозы

III. Постановка опытов при различных путях введения испытуемого вещества

     1. Пероральный путь введения

     2. Подкожное введение

     3. Смазывание кожи

     4. Внутритрахеальное введение

     5. Другие пути введения

IV. Проведение экспериментов и их документация

     Вскрытие животных и гистологическое исследование

V. Оценка результатов исследования

Приложение 1. Протокол вскрытия

Приложение 2. Частота опухолей у мышей (крыс) при пероральном и подкожном введении испытуемого вещества

Приложение 3. Частота опухолей у мышей (крыс) при пероральном и подкожном введении препарата

Приложение 4. Средняя продолжительность жизни мышей (крыс) при пероральном и подкожном введении вещества (мес.)

Стр. 1
стр. 1
Стр. 2
стр. 2
Стр. 3
стр. 3
Стр. 4
стр. 4
Стр. 5
стр. 5
Стр. 6
стр. 6
Стр. 7
стр. 7
Стр. 8
стр. 8
Стр. 9
стр. 9
Стр. 10
стр. 10
Стр. 11
стр. 11
Стр. 12
стр. 12
Стр. 13
стр. 13
Стр. 14
стр. 14
Стр. 15
стр. 15
Стр. 16
стр. 16
Стр. 17
стр. 17
Стр. 18
стр. 18

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

ПО ИССЛЕДОВАНИЮ КАНЦЕРОГЕННЫХ СВОЙСТВ ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ И БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОДУКТОВ В ХРОНИЧЕСКИХ ОПЫТАХ НА ЖИВОТНЫХ

Москва — Ленинград 1981

Методические рекомендации предназначены для сотруД-н и ко и исследовательских лабораторий медицинского и биологического профиля, занимающихся тестированием на кап-церогенность.

Рекомендации составлены членами Комитета по канцерогенным веществам при Министерстве здравоохранения СССР академиком АМН СССР профессором Л. М. Шабадом, доктором мед. наук, профессором В. С. Турусовым, доктором мед. наук Л. Н. Пылевым (Всесоюзный онкологический научный центр АМН СССР), доктором мед. наук профессором Г. Б. Плиссом (Научно-исследовательский институт онкологии им. проф. Н. Н. Петрова М3 СССР).

УТВЕРЖДАЮ

Заместитель Главного государственного санитарного врача СССР А. И. ЗАЙЧЕНКО 6 октября 1981 г.

№ 2453-81 от 9 октября 1981 г.

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

по исследованию канцерогенных свойств химических веществ и биологических продуктов в хронических опытах на животных

Прогресс химии и широкое использование продуктов химической промышленности в различных сферах народного хозяйства диктуют необходимость всесторонней оценки биологического действия химических веществ, в том числе их возможной канцерогенной активности. Актуальность такой оценки особенно возросла в последние годы, когда была убедительно доказана канцерогенная опасность для человека ряда новых химических веществ. Своевременное обнаружение в опытах на животных канцерогенных свойств химических продуктов может послужить основой для принятия мер по предотвращению их действия на человека и проведению соответствующих профилактических мероприятий.

Приказом Министра здравоохранения СССР № 484 от 8 мая 1979 г. «Об организации Комитета по канцерогенным веществам при Министерстве здравоохранения СССР» установлен порядок проведения испытаний химических соединений па канцерогенную активность, согласно которому все исследования должны проводиться по единым разработанным Комитетом схемам и под его контролем. Планы экспериментов и результаты испытаний должны направляться в Комитет на согласование и заключение.

В связи с новым положением о Комитете по канцерогенным веществам и возросшими требованиями к проведению испытаний на канцерогенность возникла необходимость в пересмотре Методического письма, утвержденного М3 СССР в 1969 г.

I. Принципы отбора веществ для исследования

В связи с невозможностью одновременного тестирования на канцерогенную активность большого числа химических веществ, что связано с длительностью и высокой стоимостью

3

опытов на животных, необходимо придерживаться следующих принципов отбора при установлении первоочередности испытаний. Испытанию должны быть подвергнуты вещества: (1) подозрительные в отношении их канцерогенных свойств в связи с эпидемиологическими и профпатологическими данными, свидетельствующими о появлении опухолей среди людей, имевших с ними контакт; (2) имеющие химическое структурное сходство с уже известными канцерогенными веществами; (3) получающие широкое распространение среди населения и могущие попадать в пищевые продукты, воду, воздух и почву; (4) обладающие алкилирующими гормоно-подобными, ростстимулирующими или цитостатическнми свойствами; (5) давшие положительные реакции в краткосрочных тестах на мутагенность, связывание с ДНК и пр. Токсичность вещества не может служить признаком наличия или отсутствия канцерогенности.

Если технический химический продукт имеет сложный состав, то проводится изучение всего продукта. В случае обнаружения канцерогенности целесообразно подвергнуть испытаниям на канцерогенность и отдельные химические компоненты, входящие в состав продукта.

II. Планирование эксперимента

В опытах по тестированию на канцерогенность должны быть созданы условия, обеспечивающие максимальное проявление канцерогенных свойств испытуемого вещества. Рекомендуется следующая схема опыта: 2 вида животных, 2 пола каждого вида, 2 пути введения, одна доза испытуемого вещества.

Лабораторные животные

Наиболее рационально для тестирования химических веществ па канцерогенность использовать мышей и крыс вследствие их относительной дешевизны, простоты их содержания и обращения с ними, а также большого опыта, накопленного эксперимснтаторами-онкологами при работе с этими видами животных. Испытания следует начинать на молодых (8—12-нсдёльных) животных. Можно использовать как линейных, так и беспородных животных; желательно, чтобы животные имели низкую частоту спонтанных опухолей и были устойчивы к инфекциям и интоксикациям.

Для тестирования могут использоваться и другие виды животных — хомяки, кролики, собаки, птицы, аквариумные рыбы или речная форель, но при этом необходимо, чтобы

4

одним из двух видов, на которых испытывается вещество, были бы мыши или крысы. Собак можно рекомендовать для испытания ароматических аминов, которые у этого вида животных, как и у человека, могут вызывать рак мочевого пузыря, однако вследствие чрезвычайно длительного, исчисляемого многими годами латентного периода развития опухолей мочевого пузыря у собак, опыты на них можно рекомендовать для проверки результатов испытаний на мелких лабораторных животных веществ; имеющих большое промышленное значение.

Контрольные и опытные животные должны быть одного возраста, получены одновременно из одного питомника и находиться в одинаковых условиях содержания. Наличие идентичных с опытными контрольных групп является обязательным во всех случаях, в том числе и при работе на животных с хорошо известной окнологической характеристикой (частота и спектр спонтанных опухолей могут с течением времени меняться даже у высокоинбредных линий). В каждую подопытную группу следует брать не менее 50 животных каждого пола. Таким образом, на испытание одного вещества но выше приведенной схеме требуется не менее G00 животных (300 мышей и 300 крыс).

Если испытуемое вещество вводится в специальном растворителе (растительное масло и др.), контрольные животные должны получать тот же растворитель используемыми путями введения. При одновременном испытании нескольких веществ количество животных в контрольной группе определяется по формуле 50 Vn, где «п»— количество тестируемых веществ. Например, при одновременном испытании 4 веществ, количество животных в контрольной группе составит 100.

Пути введения испытуемого вещества

Рекомендуется использовать два пути введения испытуемого вещества, один из которых соответствовал бы имеющемуся в реальной жизни. Последнее требование не является обязательным. В качестве стандартных могут быть рекомендованы два пути введения— пероральный и подкожный. Наиболее адэкватпым для большинства химических веществ является пероральный путь введения. Второй способ введения может быть согласован с Комитетом и выбирается с учетом особенностей действия вещества на организм человека в реальных условиях, физических и химических свойств вещества, степени его опасности для персонала и т. д. Например, при испытании саж, смол и других продуктоб, действующих

5

на кожу человека, один из способов введения будет накожный. При испытании веществ, попадающих в организм человека, главным образом, через дыхательные пути, один из способов введения может быть ннтратрахсальный или ингаляционный. При тестировании различных образцов асбеста используют внутриплевральное введение.

Продолжительность опыта

Испытуемое вещество вводится на протяжении 24 месяцев, и опыт продолжается до естественной гибели животных. Могут быть забиты последние единичные животные, оставшиеся в отдельных группах.

Выбор дозы

При выборе дозы вещества исходят из предпосылки, что наиболее выраженный канцерогенный эффект проявится при использовании максимально переносимой дозы (МПД), то-есть той, введение которой в течение всей жизни животных не приводит к их гибели или к токсическим проявлениям. Определение МПД проводится на каждом виде животных обоего пола, при каждом методе введения. Предварительно уточняется, проводилось ли ранее исследование токсичности соединения.

Определение МПД включает 2 этапа. 1

На первом этапе проводят исследование токсичности вещества в остром опыте с целью определения ЛДМ и ЛД20 по методу Литчфилда и Уилкоксона. При подкожном методе введения вещество вводят однократно, при скармливании с пищей или при введении зондом в желудок — ежедневно в течение 5 дней, при аппликации на кожу — 3 раза на протяжении 1 недели. За динамикой гибели животных следят в течение 10 дней с момента первого введения.

На втором этапе определяется МПД в субхропическом опыте. Он ставится на 6 группах 6—8-педельных животных обоего пола (при каждом методе введения на каждом виде животных). В каждую группу входят 3 самца и 3 самки одинакового веса. 5 групп подопытных животных получают тестируемый препарат в разных дозах, 6-я группа — контрольная. Максимальная доза находится на уровне ЛД20, определенной в остром опыте. Следующие 4 группы животных получают более низкие дозы, каждая из которых в 1,5 раза

ниже предыдущей. Режим введения такой же, как в хроническом опыте. Исследуемый препарат вводят подопытным животным в течение 6 недель и затем 2 недели наблюдают за их состоянием. Контрольным животным вводят растворитель. Критерием токсического действия вещества в субхро-ничсском опыте является вызываемое им торможение нарастания массы тела животных. Поэтому при проведении опыта следует строго следить за постоянством состава диеты животных, которая должна быть такой же, как в планируемом хроническом исследовании на каицерогенность. Взвешивание животных проводят 2 раза в неделю.

В соответствии с международными требованиями МПД определяют как максимальную дозу, не приводящую к гибели животных от токсического действия и вызывающую в субхроническом опыте торможение нарастания массы тела не более чем на 10% по сравнению с контролем. Не исключена возможность того, что МПД окажется различной у животных разного пола.

В хронический эксперимент могут быть включены выжившие животные из субхроиического опыта. В ходе хронического опыта МПД может быть уменьшена в случае токсических проявлений, связанных с возможным кумулятивным действием вещества. Увеличивать МПД в ходе хронического опыта нельзя.

III. Постановка опытов при различных путях введения испытуемого вещества

1. Пероральный путь введения может считаться адэкват-ным для большинства веществ, испытываемых на канцерогенную активность, Введение этим путем может осуществляться с кормом, питьевой водой или через желудочный зонд. В качестве растворителей испытуемых соединений используются неактивные вещества, не обладающие раздражающим действием, такие как вода, растительные масла, крахмал. Если вещество не растворяется в этих растворителях, его можно вводить в виде эмульсий и суспензий.

Введение с кормом (или питьевой водой) является наиболее физиологичным для многих веществ и соответствующим пути их поступления в организм человека. Дозу вещества определяют в миллиграммах на килограмм (мг/кг) массы рациона или массы животного и рассчитывают на всю группу животных, которые будут его получать.

При введении с кормом химический продукт растворяется в небольшом объеме растворителя и смешивается с пи-

7

Щей. Для сохранения пропорций и стабильности дозы при увеличении массы тела животных можно руководствоваться следующей таблицей концентраций.

Таблица I *

Доза

Период после отъема детенышей D З-псдсльном возрасте (н неделях)

Вес принятой пищи в г/кг массы тела в день

Количество исследуемого вещества (в % от пищевого рациона)

10 мг на 1 кг

0-2

120

0,084

массы тела

2-4

100

0,100

4-6

75

0,133

6-8

65

0,154

8—10

60

0,168

>10

50

0,200

* Таблица заимствована из материалов доклада Объединенного экспертного Комитета ФАО/ВОЗ по пищевым добавкам. Серия технических докладов ВОЗ, № 220, 1961.

В случае, если исследуемое вещество может быть растворено, устойчиво взвешено или эмульгировано в воде, молоке или жидком крахмале, его можно давать животным в виде питья из автопоилок. При этом необходимо периодически определять количество воды, выпиваемой животными в сутки, с последующим пересчетом дозы вещества на кг массы животного. Количество воды, потребляемой животным в сутки, в значительной мере зависит от характера кормов (натуральные, гранулированные, смешанные).

Метод введения испытуемого вещества с кормом или питьевой водой может оказаться непригодным, если вещество придает корму или воде неприятный вкус или запах, вследствие чего животные отказываются от их приема, или если вещество вступает с пищей или водой в реакцию.

Введение испытуемого вещества в желудок через зонд производится 2—3 раза в неделю: мышам в объеме 0,1—0,2 мл, крысам— 0,5—1,0 мл. Более частое введение может вызвать нежелательные осложнения от передозировки растворителя (например, растительного масла). Зонд изготавливается из толстой иглы для инъекций. Острие иглы срезается и ее конец сгибается под углом 30°. Во избежание травмы слизистой оболочки пищевода на спиленный край иглы, напаивается небольшая олива.

2. Подкожное введение

Вещества инъецируют 1 раз в неделю как в нативном виде, так и в виде растворов и суспензий в воде, растительном масле, глицерине, крахмале, а также в виде парафиновых пилюль. В последнем случае интервал между введениями можно увеличить. Рекомендуемый объем в опыте на крысах составляет 0,5—1,0 мл, на мышах — 0,1—0,2 мл. Иглу рекомендуется направлять сверху вниз от головы к хвосту. Для предупреждения вытекания раствора иглу следует продвигать по возможности дальше под кожу.

Подкожный путь введения обеспечивает точную дозировку испытуемого вещества и даст возможность изучать как местный, так и системный эффект.

3. Смазывание кожи

Этот способ весьма полезен при испытании веществ, поступающих в организм человека главным образом через кожу.

Наиболее подходящим экспериментальным животным для изучения возможной канцерогенности химических веществ путем смазывания кожи являются мыши гибриды первого поколения (Cr.7BLXCBA)F, а также C57BL, СВА. Возможно использование и беспородных животных. Помимо мышей, эксперименты со смазыванием кожи можно проводить и на кроликах. На крысах такие опыты проводить не следует вследствие относительной резистентности их кожи к индукции опухолей.

В качестве растворителей (при невозможности нанесения на кожу вещества в нативном состоянии, что предпочтительнее) рекомендуется использовать ацетон. Возможно в качестве растворителей использовать растительные масла или слабые разведения спирта.

Смазывание кожи следует проводить 2—3 раза в неделю. Исследуемое вещество наносится стеклянной палочкой, микропипеткой или пинеткой на кожу межлопаточной области (кроликам на кожу уха). Дозу вещества рассчитывают исходя из веса капли или числа капель в 1 мл раствора. Волосы на месте нанесения предварительно выстригают. В ходе опыта по мере отрастания шерсти проводится повторная стрижка.

4. Внутритрахеальное введение

Данный способ можно использовать в случаях, когда ингаляция является основным путем попадания вещества в организм человека.

9

Опыты можно проводить на крысах, хомяках и мышах. Спонтанные опухоли легких у крыс и хомяков редки, однако, крысы, в отличие от хомяков, склонны к различным воспалительным заболеваниям легочной ткани, что затрудняет проведение экспериментов. У мышей некоторых линий (А, BALB/C, С57 белые) довольно часто встречаются спонтанные опухоли легких (главным образом, аденомы), что необходимо учитывать при оценке результатов опытов по тестированию на канцерогенность. Инстилляцию веществ в легкие можно проводить в виде водных растворов и суспензий. Возможно использование различных коллоидных растворов белка. Для увеличения срока пребывания вещества в легочной ткани рекомендуется добавление к раствору или суспензии порошка туши или инертных пылей (графитированная сажа и др.). Во всех случаях необходима постановка соответствующих контрольных экспериментов. Вещества следует вводить 1 раз в две недели или 1 раз в месяц по 0,2—0,5 мл крысам, 0,2 мл — хомякам и 0,05—0,1 мл — мышам внутритрахеаль-но под визуальным контролем. Введение осуществляется под легким эфирным наркозом. Животное фиксируется на столике для оперирования мелких лабораторных животных или в специальном пенале или подвешивается на штативе за передние зубы. Рот животного раскрывают пинцетом, язык вытягивается до отказа. В полость рта вставляется ушная воронка, через которую освещают вход в гортань с помощью оторннолярингологического лобного рефлектора. Затупленную на конце иглу под контролем зрения вводят в трахею. Правильность введения подтверждает дыхание крысы через иглу. Изучаемый раствор набирается в туберкулиновый шприц; над необходимым для введения объемом раствора оставляют 0,1—0,2 мл воздуха. Вещество быстро вводят в легкие, а затем вводят оставшийся в шприце воздух.

Возможно проведение также ингаляционной затравки животных для чего необходимы специальные камеры.

5. Другие пути введения

При испытаниях лекарственных препаратов рекомендуется, чтобы один из путей введения был обязательно таким же, каким препарат будет вводиться больным. В том случае, если предполагаемый клинический способ введения (например, через рот) не обеспечивает поддержания в тканях животного высокой концентрации вещества, следует использовать дополнительный путь (виутрибрюшинный, внутривенный или

1

М. Л. Беленький «Элементы количественной оценки фармакологического эффекта». Изд. Мед. литературы. Л., 1963, 150 с.

6