ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

РОССИЙСКИЙ РЕСПУБЛИКАНСКИЙ ИНФОРМАЦИОННО-АНАЛИТИЧЕСКИЙ ЦЕНТР

МЕТОДЫ АНАЛИЗА ЧУЖЕРОДНЫХ ВЕЩЕСТВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ

(Сборник нормативных материалов)

Москва, 1994 г.

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

РОССИЙСКИЙ РЕСПУБЛИКАНСКИЙ ИНФОРМАЦИОННО-АНАЛИТИЧЕСКИЙ ЦЕНТР

МЕТОДЫ АНАЛИЗА ЧУЖЕРОДНЫХ ВЕЩЕСТВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ

(Сборник нормативных материалов)

Москва, 1994 г.

ВВЕДЕНИЕ

Загрязнение пищевых продуктов токсичными чужеродными веществами является частью глобальной проблемы загрязнения окружающей среды, поэтому в настоящее время очень важным аспектом является определение микропримесей загрязняющих веществ в продуктах питания и снижение их содержания. В последние годы все больший приоритет приобретают исследования по определению таких токсикантов как различные микотоксины (афла-токсины, патулин, зеараленон, вомитоксин, трихотецены и др.), соли тяжелых металлов, нитриты, нитраты, N-шпгрозамины и др.

Настоящий сборник включает в себя ранее изданные Методические указания по определению наиболее приоритетных загрязнителей пищевых продуктов, разработанные научно-исследовательскими институтами медицинского профиля и утвержденные Главным санитарно-эпидемиологическим управлением Минздрава СССР и ГКСЭН РФ.

В соответствии с Постановлением Госкомсанэпиднадзора Российской Федерации от 06.02.92 г. № 1 «О порядке действия на территории Российской Федерации нормативных актов бывшего Союза ССР в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения» на всей территории Российской Федерации действуют общесоюзные санитарные правила и нормативные акты впредь до принятия соответствующих нормативных актов Российской Федерации в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения.

Сборник предназначен для санитарно-гигиенических лабораторий центров Госсанэпиднадзора, НИИ и учреждений гигиенического профиля, кафедр гигиены питания медицинских институтов и институтов усовершенствования врачей, а также может быть использован лабораториями других организаций, занимающихся исследованиями пищевых продуктов.

Будем признательны за все критические замечания и пожелания, направленные на улучшение данного Сборника или составление аналогичных Сборников по другим разделам исследований пищевых продуктов.

Л. Г. Подунова

МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ЭСТРАДИОЛА-17/? В ПРОДУКТАХ ЖИВОТНОВОДСТВА (химический метод)

Принцип метода

Метод основан на экстракции эстрадиола-17/? диэтиловым эфиром, очистке экстрактов адсорбционной хроматографией и количественном измерении (в зависимости от имеющихся условий с применением ГЖХ или радиоиммунологического анализа).

Реактивы

Хлороформ, ГОСТ 3160-51, перегнанный

Эфир диэтиловый, медицинский или ГОСТ 6255-52

Этанол, х. ч., перегнанный

Бензол, х. ч., для хроматографии

Этилацетат, х. ч.

Натрий сернокислый, безводный, ГОСТ 4166-76, х.ч.

Окись алюминия для хроматографии, 150—200 меш. Силикагель для тонкослойной хроматографии, 200 меш. Ангидрид гептафтормаслянный или трифторуксусный, х.ч. 2,5-Дифенилоксазол сцинтилляционный, х.ч. 1,4-Ди-|2,-(5-фенил)-оксазолил]-бензол, х.ч.

Эстрадиол-17/3, крист, стандартный препарат, хроматографически чистый (по поводу приобретения стандарта обращаться в Институт питания АМН СССР — 109240, Москва, Устьинский проезд 2/14)

Набор для радиоиммунологического определения эстрадиола-17/?: поставляется для учреждений Минздрава СССР Ленинградским межреспубликанским отделением В/О «Изотоп* (196002, Ленинград, Загородный проспект, 13), а также НИИ экспериментальной патологии и терапии АМН СССР (384900, г. Сухуми, гора Трапеция)

Оборудование и лабораторная посуда

Скоростной смеситель типа РТ-1 Ротационный испаритель типа ЛГ-108 Центрифуга типа 1ДЛЗ 31М Газовый хроматограф типа «Цвет»

Сцинтилляционный счетчик типа «Бета-1» или «Бета-2»

Насос водоструйный, ГОСТ 10969-75 Сушильный шкаф типа 2В-151 Баня водяная типа ТУ 64-1-432-72

— Определение химическим методом остаточных количеств эстрадиола-17р в продуктах животноводства, утв. М3 СССР 17.01.85 № 3208-85

139

Камера для тонкослойной хроматографии с притертой крышкой, например, стеклянный четырехугольный сосуд 195 х 195 х 200 мм завода «Дружная горка*

Термометр от 0° до 100°, ГОСТ 1770-74

Колбы мерные вместимостью 25, 50, 100 мл, ГОСТ 1770-74

Ступка, ГОСТ 2045-71

Стаканы хим. на 250 мл

Стеклянная колонка для хроматографии, размером 0,5 х 30 см Воронки стеклянные, ГОСТ 868-75 Бюхнеровская воронка, ГОСТ 93-75

Пробирки хим. на 5 и 10 мл с НШ № 14,5 с притертыми пробками ОСТ 10515-75

Колбы для упаривания на 50 и 250 мл с НШ № 14,5 и НШ № 28, ГОСТ 10394-72

Делительные воронки вместимостью 250 мл, ГОСТ 8613-75 Цилиндры мерные вместимостью50,100,250 мл, ГОСТ 1770-74 Колбы плоскодонные на 250 мл с НШ № 14,5 ТУ 48-52 Стеклянный бюкс с притертой крышкой Пипетки на 2, 5, 10 мл, ГОСТ 20292-74 Микропипетки на 0,1 и 0,2 мл ГОСТ 1770-74

Отдельные стадии метода

5 г ткани мышц, печени или почек тщательно измельчают, растирают в ступке, переносят в скоростной смеситель и гомогенизируют с 20 мл дистиллированной воды в течение 2 мин. Гомогенат переносят в плоскодонную колбу, добавляют 50 мл диэтилового эфира и экстрагируют в аппарате для встряхивания в течение 30 мин. Экстракцию 50 мл диэтилового эфира проводят дважды. Эфирные экстракты объединяют, фильтруют через безводный Na:SO< и выпаривают; сухой остатой растворяют в 3 мл хлороформа и используют в дальнейшем для хроматографии на колонке.

При подготовке колонки для адсорбционной хроматографии, окись алюминия обезвоживают прогреванием в сушильном шкафу при 200° в течение 3 часов и стандартизуют добавлением 10% воды (обьем/вес адсорбента). После добавления воды адсорбент тщательно перемешивают и в герметично закрытом бюксе встряхивают в аппарате для встряхивания в течение 30 мин. Затем окись алюминия суспензируют в хлороформе и формируют колонку размером 0,5 х 6,0 см. При использовании каждой новой партии адсорбента необходимо с применением стандарта эстрадиола-17^ проводить контрольные исследования условий элюции препарата с колонки.

3 мл хлороформного экстракта наносят на колонку окиси алюминия. Элюцию осуществляют: 10 мл хлороформа (фракция № 1), 15 мл 0,5% этанола в хлороформе (фракция № 2), 20 мл 3% этанола

140

в хлороформе (фракция N° 3, содержащая эстрадиол-17/3). Последнюю фракцию выпаривают на роторном испарителе и используют для количественного определения радиоиммунологическим методом или проводят дальнейшую очистку тонкослойной хроматографией при применении ГЖХ.

При наличии набора для радиоиммунологического определения эстрадиола-17/3 целесообразно применение этого более простого, но высоко специфичного варианта метода. При этом исключается стадия тонкослойной хроматографии, т. к. использование колоночной хроматографии на окиси алюминия позволяет получить степень очистки экстрактов, достаточную для количественного измерения стероида радиоиммунологическим методом. Постановка радиоим-мунологической реакции проводится в зависимости от имеющегося набора и в соответствии с инструкцией к нему. Радиоиммуно-логический метод позволяет выявить от 3 до 20 пг эстрадиола-17/3 (в зависимости от антисыворотки к данному гормону, предлагаемой в наборе). Предел обнаружения эстрадиола-17/3 в образце составляет 4 нг/кг.

Применение ГЖХ метода количественного измерения требует более высокой степени очистки экстрактов. При проведении тон-косклойной хроматографии применяют пластины силикагеля 20 х 20 см, толщина слоя 0,4 мм; перед употреблением адсорбент активируют при 120° С 50 мин. Сухой остаток, полученный после выпаривания фракции N° 3 с эстрадиолом-17/3, растворяют в минимальном объеме смеси: 96% этанол-эфир (3:1) и наносят в левый нижний угол пластины силикагеля на расстоянии 3 см от бокового и 1,5 см от нижнего края пластины. Последующие пробы исследуемых образцов наносят на левую половину пластины на расстоянии 2 см друг от друга. В правый нижний угол пластины также на расстоянии 3 и 1,5 см от бокового и нижнего краев наносят 0,5—1 мкг стандарта эстрадиола-17/3. Хроматографируют в системе растворителей: бензол-этилацетат, 2:3. Пластину высушивают, закрывают стеклом левую половину, а правую половину пластины с нанесенным стандартом эстрадиола-17/3 проявляют, опрыскивая 20% серной кислотой. Слой силикагеля на правой и левой половине пластины разрезают скальпелем, выделяя полосу на 0,8 см выше и ниже центра пятна стандарта. Участки слоя силикагеля, соответствующие исследуемому образцу, снимают с пластины, переносят в плоскодонную колбу объемом 50 мл, заливают 10 мл смеси: 96% этанол-эфир и встряхивают в аппарате для встряхивания в течение 20 мин. Элюцию проводят двукратно. Силикагель отделяют фильтрованием через бумажный фильтр и отбрасывают. Элюаты объединяют и выпаривают досуха на роторном испарителе.

В дальнейшем проводят ГЖХ фторпроизводных стероида с использованием детектора электронного захвата. Для получения фторпроизводных сухой остаток (после выпаривания элюата) рас-

141

творя ют в 0,5 мл безводного бензола, добавляют 20 мкл ангидрида (гептафтормаслянного или трифторуксусного) и инкубируют 30 мин при 65°. Смесь высушивают под током азота, сухой остаток растворяют в 0,5 мл бензола и проводят ГЖХ; остатки ангидрида после инкубации могут быть удалены промыванием водой — к 0,5 мл смеси добавляют 0,3 мл дистиллированной воды, встряхивают 0,5—1,0 мин и центрифугируют. Бензольную фракцию отделяют и используют для ГЖХ. При проведении ГЖХ анализа применяют стеклянную колонку, размером 2 м с 3% SE-30 на Хроматоие N-AW-ГМДС; температура испарителя — 230°, колонки — 200°, детектора — 240®; газ-носитель —азот, 40 мл/мин. В этих условиях время удерживания эстрад иол а-17у? равно 7,6 мин. ГЖХ анализ позволяет определить 0,1—0,2 нг стероида в пробе (в зависимости от использования гептафтормаслянного или трифторуксусного ангидрида и чувствительности детектора хроматографа). Коэффициент вариации равен 10%.

142

СОДЕРЖАНИЕ

I    МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКОТОКСИНОВ    1

1.    Методика определения афлатоксинов в пищевых продуктах методом тех.................................... 3

2.    Методика определения афлатоксинов в пищевых продуктах с

помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии    ...    11

3.    Методика определения афлатоксипов в продуктах животного

происхождения ................................. 19

4.    Методика определения содержания латулииа в фруктовых и

овощных соках и пюре............................ 26

5.    Методика определения мпкотоксина патулпнл в продуктах

переработки плодов и овощей ....................... 31

6.    Методика определения зсараленопл в пищевых продуктах    ....    37

7.    Методика определения дезокенпивалепола (вомитокспна) в    зерне

и зернопродуктах................................ 41

8.    Методика определения дсзоксинивалснола и зсараленона в зерне

и зернопродуктах ............................... 45

9.    Методика определения Т-2 токсина в пищевых продуктах и

продовольственном сырье.......................... 53

10.    Методика определении охратоксина Л в пищевых продуктах ...    57

11.    Методики определения микотоксииом: Т-2 токсина, зсараленона

(Ф-2) и охратоксина Л............................ 63

II. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУЖЕРОДНЫХ ВЕЩЕСТВ    77

12.    Атомио-абсорОциоиныс методы определения токсичных элементов п пищевых продуктах и пищевом сырье.............. 77

13.    Методика определения мстил-этилмсркурхлорида в пищевых

продуктах, кулпнарно обработанных ................... 93

14.    Методика определения содержания общей ртути в пищевых

продуктах методом беспламенной атомной абсорбции....... 97

15.    Методика по определению хрома в овощных консервах...... 103

16.    Методика определения содержания гистамина в рыбопродуктах

(флуоромстричсский метод)......................... 105

17.    Метод выделения, идентификации и количественного определения

гистамина в рыбопродуктах (колориметрический метод)...... 110

18.    Методика определения нитратов и нитритов в молоке и молочных

продуктах..................................... 114

19.    Методика определения жиратов и нитритов в плодовоощной

консервированной продукции........................ 124

биологических жидкостях .......................... 133

21.    Методика определения остаточных количеств

Эстрадиола-17/? в продуктах животноводства ............. 138

22.    Методика определения антибиотиков тстрациклинового ряда методом тонкослойной хромато<рафии (качественный анализ) ...    142

23.    Методика определения антибиотиков тетрацикл и нового ряда

<|»луоримстричсским методом (количественный анализ) ...... 143

24.    Определение летучих N-нитрозаминов в продовольственном сырье

и пищевых продуктах........................ .    .    .    146

Брагина И. В., Орехова И. Л- — специалисты лаборатории физико-химических методов исследований Российского Республиканского информационно-аналитического центра.

Под редакцией: Подуповой JI. Г. — заместители Главного государственного санитарного врача РФ, заслуженного врача РФ.

Подписано к печати. 21.11.94.

Формат 60 х 88/16. Бумага офсетная. Уел. псч. л. 9,8. Уел. кр.-отт. 9,8. Тираж 1000 экз. Зак. 220.

Изготовлено в Московской типографии № 11 Комитета по печати РФ. 113105, Москва, ул. Нагатинская, 1.