ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

РОССИЙСКИЙ РЕСПУБЛИКАНСКИЙ ИНФОРМАЦИОННО-АНАЛИТИЧЕСКИЙ ЦЕНТР

МЕТОДЫ АНАЛИЗА ЧУЖЕРОДНЫХ ВЕЩЕСТВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ

(Сборник нормативных материалов)

Москва, 1994 г.

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

РОССИЙСКИЙ РЕСПУБЛИКАНСКИЙ ИНФОРМАЦИОННО-АНАЛИТИЧЕСКИЙ ЦЕНТР

МЕТОДЫ АНАЛИЗА ЧУЖЕРОДНЫХ ВЕЩЕСТВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ

(Сборник нормативных материалов)

Москва, 1994 г.

ВВЕДЕНИЕ

Загрязнение пищевых продуктов токсичными чужеродными веществами является частью глобальной проблемы загрязнения окружающей среды, поэтому в настоящее время очень важным аспектом является определение микропримесей загрязняющих веществ в продуктах питания и снижение их содержания. В последние годы все больший приоритет приобретают исследования по определению таких токсикантов как различные микотоксины (афла-токсины, патулин, зеараленон, вомитоксин, трихотецены и др.), соли тяжелых металлов, нитриты, нитраты, N-нитрозамины и др.

Настоящий сборник включает в себя ранее изданные Методические указания по определению наиболее приоритетных загрязнителей пищевых продуктов, разработанные научно-исследовательскими институтами медицинского профиля и утвержденные Главным санитарно-эпидемиологическим управлением Минздрава СССР и ГКСЭН РФ.

В соответствии с Постановлением Госкомсанэп ид надзора Российской Федерации от 06.02.92 г. № 1 *0 порядке действия на территории Российской Федерации нормативных актов бывшего Союза ССР в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения» на всей территории Российской Федерации действуют общесоюзные санитарные правила и нормативные акты впредь до принятия соответствующих нормативных актов Российской Федерации в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения.

Сборник предназначен для санитарно-гигиенических лабораторий центров Госсанэпиднадзора, НИИ и учреждений гигиенического профиля, кафедр гигиены питания медицинских институтов и институтов усовершенствования врачей, а также может быть использован лабораториями других организаций, занимающихся исследованиями пищевых продуктов.

Будем признательны за все критические замечания и пожелания, направленные на улучшение данного Сборника или составление аналогичных Сборников по другим разделам исследований пищевых продуктов.

Л. Г. Подунова

МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ Т-2 ТОКСИНА В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ И ПРОДОВОЛЬСТВЕННОМ СЫРЬЕ¹

Оборудование и материалы

1.    Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С по ТУ 64-1-2451-78.

2.    Ротационный испаритель с ловушкой по ТУ 25-11-917-76 (завод «Химлабприбор¹).

3.    Кофемолка ЭКМ-ЗУ.

4.    Хроматограф газовый серии «Цвет-100¹ с детектором постоянной скорости рекомбинации (ДЭЗ); колонка стеклянная 1 м х 0,4 см с жидкой фазой OV-1 или OV-101 на Хроматоне N-cynep («Лахема¹, ЧССР); в качестве самописца — регистрирующий потенциометр КСП-4 модификации 41.130.90.909 или 41.140.90.910 с диапазоном измерений 1 мВ; газ —носитель и продувочный газ — азот особой чистоты.

5.    Прибор для флуоресцентного анализа витаминов в растворе (модель 833) ТУ 64-1-1080-78 или диагностическая лампа ОЛД-41.

6.    Магнитная мешалка любого типа.

7.    Микрошприц МШ-10 на 10 мкл, микрошприц МШ-1 или ♦Газохром-101¹ на 1 мкл.

8.    Камеры для ТСХ с притертыми крышками (например, стеклянные четырехугольные сосуды 195 х 195.х 200 завода «Дружная горка¹).

9.    Пластины для ТСХ «Силуфол¹ размером 20 х 20 см (ЧССР).

10.    Воронки делительные В Д-2-250 по ГОСТ 8613-75.

11.    Колбы плоскодонные конические на 250 мл с НШ 29, тип КнКШ 250-29/32 по ГОСТ 10394-72.

12.    Колбы круглодонные на 250 мл с НШ 29, тип ККШ-250-29/32 по ГОСТ 10394-72.

13.    Колбы грушевидные на 50 мл с НШ 14,5, тип ГрКШ-50-14/23 по ГОСТ 10394-72.

14.    Колбы мерные на 100 мл, тип 2-100-2 по ГОСТ 1770-74.

15.    Цилиндры мерные на 100 мл с притертой пробкой, тип 2-100 по ГОСТ 1770-74.

16.    Распылитель стеклянный с грушей.

17.    Т-2 токсин кристаллический, номер по каталогу Т 4887, фирма «Сигма», США (по поводу получения стандарта Т-2 токсина обращаться в Институт питания АМН СССР).

18.    Ацетонитрил «ч» по ТУ 6-09-3534-74.

19.    Ацетон «чда» по ГОСТ 2603-79.

20.    Бензол «чда» по ГОСТ 5955-75.

21.    Гексан «ч» по ТУ 6-09-3375-78.

22.    Метанол «чда» по ГОСТ 6995-77.

23.    Изопропиловый спирт (пропанол-2) «хч» по ТУ 6-09-402-75.

24.    Кислота серная «чда» по ГОСТ 4204-77.

25.    Калий хлористый «чда» по ГОСТ 4234-77.

26.    Натрий сернокислый безводный «чда» по ГОСТ 4166-76.

27.    Натрий углекислый «чда» по ГОСТ 83-79, свежепрокаленный.

28.    Трифторуксусный ангидрид «ч» по ТУ 6-09-4135-75.

1. Экстракция

При отборе пробы для анализа следует руководствоваться требованиями ГОСТ 12430-66 «Сельскохозяйственная продукция. Методы отбора образцов при карантинном досмотре и экспертизе». Отобранную пробу измельчают в течение 1—2 минут в кофемолке или лабораторной мельнице. Навеску 20 г измельченного продукта помещают в плоскодонную коническую колбу на 250 мл, добавляют 10 мл 4% раствора хлористого калия и 90 мл ацетонитрила. Встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 30 минут. Полученную смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр в мерный цилиндр, отбирают 70 мл фильтрата (аликвота соответствует 14 г исходного образца).

2. Очистка экстракта

2.1. Жидкость — жидкостная экстракция

В делительную воронку на 250 или 500 мл переносят 70 мл фильтрата, добавляют 50 мл гексана (или гептана). После встряхивания и разделения слоев верхний гексановый слой отбрасывают. Нижний ацетонитрильный слой еще дважды встряхивают с 40 мл гексана, каждый раз отбирая верхний гексановый слой. Ацетонитрильный слой разбавляют 17 мл дистиллированной воды и

54

экстрагируют 50 и 25 мл бензола. Верхние бензольные слои отделяют и сушат безводным сернокислым натрием (10—15 г) в течение 0,5 часа. Раствор фильтруют через химическую воронку с кусочком ваты в круглодонную колбу на 250 мл в НШ 29. Сернокислый натрий промывают 10 мл бензола и отфильтровывают бензол в ту же круглодонную колбу. Упаривают бензольный раствор на ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 45—50° С досуха. Остаток растворяют в 200—300 мкл бензола и очищают с помощью препаративной ТСХ (раствор А).

2.2. Очистка с помощью препаративной ТСХ

Пластинку «Силуфол» (20 х 20 см) размечают. В правом и левом нижних углах пластинки на расстоянии 1,5 см от краев наносят по 5 мкл стандартного раствора Т-2 токсина в бензоле (по 500 нгТ-2 токсина). Параллельно нижнему краю пластинки на расстоянии 1,5 см от нижнего края равномерно наносят с помощью шприца на 10 мкл раствор А в виде прямой линии шириной не более 3 мм. После нанесения всего раствора А в круглодонную колбу добавляют еще 100—150 мкл бензола и наносят бензольную промывку на ту же прямую линию. Пластинку помещают в камеру для ТСХ со смесью гексан—изопропиловый спирт (7:2). Развивают пластинку до достижения фронтом растворителя карандашной линии, проведенной в 1,5 см от верхнего края пластинки. Пластинку извлекают из камеры и высушивают. Разрезают пластинку по линиям А и Б. Узкие полоски пластинки с нанесенным раствором Т-2 токсина опрыскивают 20% раствором серной кислоты в метаноле. Пластинки выдерживают в сушильном шкафу при 105° С в течение 1—3 минут и рассматривают в длинноволновом УФ-свете. Пятна Т-2 токсина (бело-голубая флуоресценция, Rf 0,6—0,7) обводят тонкой карандашной линией. Затем узкие полоски прикладывают к пластинке с нанесенным экстрактом и отмечают на этой пластинке зону, соответствующую хроматографической подвижности стандарта Т-2 токсина. Ширина зоны должна быть примерно на 7 мм (с каждой стороны) больше протяженности пятна стандарта Т-2 токсина в направлении развития хроматограммы; зону отмечают в виде 2 карандашных линий, параллельных нижнему краю пластинки. Силикагель из отмеченной зоны соскабливают с помощью скальпеля или шпателя в пробирку на 5 мл, приливают 4 мл смеси бензол-ацетон (1:1) и встряхивают. Суспензию силикагеля фильтруют через химическую воронку с кусочком ваты в грушевидную колбу на 50 мл с НШ 14,5. Силикагель повторно (2x4 мл) промывают смесью бензол—ацетон (1:1). Объединенные бензол-ацетоновые экстракты упаривают досуха на ротационном испарителе. Остаток переносят 200 мкл бензола в пробирку на 5 мл с НШ 14,5 (раствор В).

55

3. Обнаружение, идентификация и определение содержания Т-2 токсина

3.1. Приготовление стандартного раствора Т-2 токсина

Навеску 10 м г кристаллического Т-2 токсина помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки бензолом. Концентрация Т-2 токсина в стандартном растворе составляет 100 нг/мкл или 100 мкг/мл. Раствор хранят в холодильнике при температуре не выше + 5° С. Срок годности стандартного раствора —до 2 лет.

3.2. Получение ТФА производных

а)    получение ТФА производного стандарта Т-2 токсина

В мерную пробирку на 5 мл в НШ 14,5 добавляют 50 мкл стандартного раствора Т-2 токсина в бензоле, добавляют 250 мкл бензола, 30—50 мг свежепрокаленного углекислого натрия и 50 мкл трифторуксусного ангидрида. Пробирку плотно закрывают стеклянной притертой пробкой и перемешивают при 20—25° С в течение 0,5 часа на магнитной мешалке (в пробирку предварительно помещают «гвоздик» для перемешивания — кусочек металлической канцелярской скрепки длиной 3—4 мм, запаянный в стеклянный капилляр). Содержимое пробирки разбавляют бензолом до 1 мл и фильтруют через химическую воронку с кусочком ваты в другую пробирку на 5 мл с 1(Ш 14,5, углекислый натрий на фильтре промывают 0,5 мл бензола. Объединенные бензольные фильтраты упаривают досуха в слабой струе азота (при отсутствии баллона с азотом можно упарить досуха на ротационном испарителе). Остаток растворяют в 200 мкл бензола и анализируют с помощью ГЖХ.

б)    получение ТФА производных экстракта

К 300 мкл бензольного раствора очищенного экстракта (раствор В) добавляют углекислый натрий и трифторуксусный ангидрид и проводят получение ТФА производных аналогично п. 3.2.а.

3.3. ГЖХ анализ ТФА производных

Условия ГЖХ анализа: температура колонки — 200°, температура испарителя — 235°, температура термостата детектора.—270°, скорость газа-носителя — 90—100 мл/мин, скорость продувочного газа —190—200 мл/мин, шкала чувствительности — 2 • 10"¹² А (на блок ИМТ).

В газовый хроматограф с помощью микрошприца на 1 мкл последовательно вносят 0,2 и 0,5 мкл (соответствуют 5 и 12,5 нг Т-2 токсина) раствора ТФА-производного стандарта Т-2 токсина в 200 мкл бензола (п. 3.2А). В каждом случае регистрируют время удерживания (в данных условиях порядка 5—6 минут) и определяют

56

СОДЕРЖАНИЕ

I    МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКОТОКСИНОВ    *

1.    Методика определения афлатоксинов в пищевых продуктах методом тех.................................... 3

2.    Методика определения афлатоксинов в пищевых продуктах с

помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии    ...    11

3.    Методика определения афлатоксинов в продуктах животного

происхождения ................................. 19

4.    Методика определения содержания патулииа в фруктовых и

овощных соках и пюре............................ 26

5.    Методика определения мпкотоксина патулииа в продуктах

переработки плодов и овощей ....................... 31

6.    Методика определения зсарпленопл в пищевых продуктах    ....    37

7.    Методика определения дсзоксинивалспола (вомитокспна) в    зерне

и зернопродуктах................................ 41

8.    Методика определения дсзоксинниллснола и зсараленона в зерне

и зернопродуктах ............................... 45

9.    Методика определения Т-2 токсина в пищевых продуктах и

продовольственном сырье.......................... 53

10.    Методика определения охратоксина А в пищевых продуктах ...    57

11.    Методики определения мпкотокеппои: Т-2 токсина, зсараленона

(Ф-2) и охратоксина А............................ 63

II. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУЖЕРОДНЫХ ВЕЩЕСТВ 77

12.    Атомно-абсорбционные методы определения токсинных элементов в пищевых продуктах и пищевом сырье.............. 77

13.    Методика определения мстил-этилмсркурхлорида в пищевых

продуктах, кулннарно обработанных ................... 93

14.    Методика определения содержания общей ртути в пищевых

продуктах методом беспламенной атомной абсорбции....... 97

15.    Методика по определению хрома в овощных консервах...... 103

16.    Методика определения содержания гистамина в рыбопродуктах

(флуоромстричсский метод)......................... 105

17.    Метод выделения, идентификации и количественного определения

гистамина в рыбопродуктах (колориметрический метод)...... ПО

18.    Методика определения нитратов и нитритов в молоке и молочных

продуктах..................................... 114

19.    Методика определения жиратов и нитритов в плодовоощной

консервированной продукции........................ 124

биологических жидкостях .......................... 133

21.    Методика определения остаточных количеств

Эстрадиола-17/? в продуктах животноводства ............. 138

22.    Методика определения антибиотиков тстрациклинового ряда методом тонкослойной хромато<рафии (качественный анализ) ...    142

23.    Методика определения антибиотиков тетрацикл и нового ряда

<]»луоримстричсским методом (количественный анализ) ...... 143

24.    Определение летучих N-нитрозаминов в продовольственном сырье

и пищевых продуктах........................ .    .    .    ]4<з

Брагина И. В., Орехова II. Л- — специалисты лаборатории физико-химических методов исследований Российского Республиканского информационно-аналитического центра.

Под редакцией: Подуповой JI. Г. — заместители Главного государственного санитарного врача РФ, заслуженного врача РФ.

Подписано к печати. 21.11.94.

Формат 60 х 88/16. Бумага офсетная. Уел. псч. л. 9,8. Уел. кр.-огг. 9,8. Тираж 1000 экз. Зак. 220.

Изготовлено в Московской типографии № 11 Комитета по печати РФ. 113105, Москва, ул. Нагатинская, 1,

1

   —    Методические    указания    по    обнаружению,    идентификации    и    опреде

лению содержания Т-2 токсина в пищевых продуктах и продовольственном сырье, утв. М3 СССР 29 декабря 1984 г. № 3184-84

53