Товары в корзине: 0 шт Оформить заказ
Стр. 1 

15 страниц

Купить бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Цена на этот документ пока неизвестна. Нажмите кнопку "Купить" и сделайте заказ, и мы пришлем вам цену.

Распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль"

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

Способы доставки

  • Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
  • Курьерская доставка (7 дней)
  • Самовывоз из московского офиса
  • Почта РФ

"Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии в агар с использованием дисков" выпускаются с целью замены соответствующего раздела «Методических указаний» 1976 г.

 Скачать PDF

Оглавление

1. Введение

2. Материалы

     2.1. Диски с антибиотиками

     2.2. Питательные среды

3. Методика определения чувствительности

     3.1. Приготовление чашек

     3.2. Приготовление инокулята и нанесение его на поверхность агаровой среды

     3.3. Наложение дисков

     3.4. Инкубация чашек

     3.5. Учет результатов

     3.6. Интерпретация полученных результатов

4. Выбор дисков для исследования

5. Контроль воспроизводимости и точности полученных результатов

Заключение

Стр. 1
стр. 1
Стр. 2
стр. 2
Стр. 3
стр. 3
Стр. 4
стр. 4
Стр. 5
стр. 5
Стр. 6
стр. 6
Стр. 7
стр. 7
Стр. 8
стр. 8
Стр. 9
стр. 9
Стр. 10
стр. 10
Стр. 11
стр. 11
Стр. 12
стр. 12
Стр. 13
стр. 13
Стр. 14
стр. 14
Стр. 15
стр. 15

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ К АНТИБИОТИКАМ МЕТОДОМ ДИФФУЗИИ В АГАР С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДИСКОВ

Москва — 1983

Разработаны:

Центральным ордена Ленина институтом усовершенствования врачей (Н. И. Гивенталь, В. Р. Соболев, Е. А. Ведьмина, И. В. Власова);

Всесоюзным научно-исследовательским институтом антибиотиков (С. П. Резван, С. М. Чайковская, И. П. Фомина, С. М. Новашин).

Рекомендованы к утверждению Лабораторным Советом при Главном санитарно-эпидемиологическом управлении Министерства здравоохранения СССР.

штаммы, для подавления роста которых требуются концентрации, создающиеся в сыворотке крови при введении максимальных доз препарата. Устойчивыми являются микроорганизмы, рост которых не подавляется препаратом в концентрациях, достижимых в организме при использовании максимально допустимых доз.

Метод диффузии в агар не дает надежных данных при определении чувствительности к плохо диффундирующим по-липептидным антибиотикам — полимиксину, ристомицину. Если эти антибиотики предполагается использовать для лечения генерализованной инфекции, определение чувствительности следует проводить методом разведений.

4. Выбор дисков для исследования

Для сокращения объема испытания целесообразно использовать наборы дисков, составленные с учетом вида выделенного возбудителя и локализации инфекции (табл. 3).

Таблица 3

Диски с антибиотиками

Предварительное испытание чувствительности микрофлоры путем прямого посева патологического материала

Испытание чувствительности чистой кольутры возбудителя

стафилокок

стрептококки, i пневмококки |

энтеробактерии (эшери-хии, протей и др.)

1 псевдомонады

мок

рота

гной моча

1

2

3 | 4 | 5 | 6

7

8


Беизнлпеиициллин

Ж

+

+

Ампициллин

+

+

Карбенициллнн (25 мкг)

Карбенициллнн (100 мкг)

+

Мстицилл и н-Окса цилл и и

+

+

+

Цсфалексин-Цефалотнн

+

+

4-

Основные наборы дисков с антибиотиками, рекомендуемые для определения чувствительности возбудителя в зависимости от патологического материала и вида выделенной культуры

+

Ж

+

Стрептомицин

(+)

(+)

Неомицин-Мономицин

<+>

Канамицин

+

(+)

+

Гснтамицин-Сизомнцип

+

(+)

(+)

+

Тстрацнклин-Докси-

+

+

+

+

+

циклии

Эрнтромицип-Олсандо-

+

+

+

мнцнн

Линкомицин

+

+

Левомицетин

+

+

4*

Рифампицин

(+)*

(+)*

(+)

Фузидин

(+)

Полимиксии

(+)

+

Риетомицин

(+)

Примечание: (+) — антибиотики, чувствительность к которым следует определять во вторую очередь;

(+) * — возможно применение при устойчивости ко всем другим антибиотикам.

ВОЗ для определения чувствительности к антибиотикам, близким но химическому строению и антибактериальному спектру действия, рекомендует использовать класс-диск, содержащий один из антибиотиков определенной группы.

Так, с помощью диска, содержащего бензилпеницилин, можно определять чувствительность к феноксиметилпеницил-лину и бициллину. Для определения чувствительности к антибиотикам тетрациклииовой группы (за исключением докси-циклина) пользуются диском, содержащим тетрациклин.

Диски с оксациллином можно использовать для определения чувствительности к оксацнллину, метнциллину и дикло-ксациллину. Стафилоккоки, устойчивые к оксациллину, устойчивы и к антибиотикам цефалоспориновой группы. Диск с цефалотином можно использовать для определения чувствительности к цефалоридину и цефалексину.

5. Контроль воспроизводимости и точности полученных результатов

Применение заранее разработанной таблицы для интерпретации результатов возможно только при соблюдении строго стандартных условий постановки опыта и использовании стандартных питательных сред.

Допустимые пределы диаметров зон задержки роста эталонных штаммов при контроле воспроизводимости и точности результатов

Таблица 4

Диаметры ton задержки рост* я* средах М 1 * Л г. км

Ди* метры зон задержки рост* и* среде ЛГВ. мм

Staph, aureus АТСС 25923

С* С 1

8

сч

ъи

ы<

S3

«г

DCS

*8

С.<

ц

эю

г* СЧ

£8

»h

Е. coli АТСС 25922

a

mS

Э CM

£о

и

*'г-

Бснзнлпснициллнн

29-38

Ампициллин

24—35

13-20

30-36

14-20

_

Карбемициллин (25 мкг)

32-38

19-25

Карбемициллин (100 мкг)

21-26

20-24

35—42

23-29

18-24

Метииидлин

—-

22-30

Охсациллнн

27-32

24-34

Цефалотин

24-37

15-22

30-40

15--20

Стрептомицин

17—25

14—22

20-25

14-19

Неомииин

19-27

18-24

20-27

13-17

Кангмицин

20-27

18-26

20-27

15—19

_

Моноиицин

22-30

14-18

1ентамиции

20—28

20-27

16-24

22-32

21-30

16-26

Тетрациклин

20-29

19-26

22—31

17—26

Эритромицин

23-31

22-31

8-15

Олеандоыиции

20-29

22—29

Линкомицин

24-32

24—32

Левомицетин

21-27

23-28

19-25

19-27

Рмфампнцин

26-34

7-11

Полимнксин

12—17

10—20

15-20

Ристомииим

14—18

12-16

Для контроля воспроизводимости и точности процедуры определения чувствительности рекомендуется при каждой постановке теста параллельно с испытуемыми штаммами использовать эталонные штаммы Escherichia coli (АТСС 25922), Staphylococcus aureus (АТСС 25923) и Pseudomonas aeruginosa (АТСС 27853), которые можно получить в ГИСК им. Л. А. Тарасевича.

Эталонные штаммы сохраняют в полужидком питательном агаре под вазелиновым маслом. Пересев производят один раз в 3 месяца.

Диаметры зон задержки роста эталонных штаммов не должны выходить за пределы, указанные в табл. 4. Эталонные штаммы могут быть использованы для проверки качества среды, дисков и правильности методики постановки теста.

Выше было отмечено влияние катионов Саь+ и Mg44" в питательной среде на результаты определения чувствительности. Колебания в содержании указанных катионов особенно сильно отражаются на чувствительности Pseudomonas aeruginosa к гентамицину, что в ряде случаев может привести к неправильной оценке результатов определения. Эталонный штамм Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853 можно использовать для корректировки пограничных значений диаметров зон при определении чувствительности клинических штаммов Pseudomonas aeruginosa к гентамицину. Для этого от диаметра зоны эталонного штамма, установленного в опыте, отнимают 6 и 3 мм. Полученные две цифры характеризуют границы «подвижной» промежуточной зоны, т. е. зоны умеренно устойчивых штаммов. Например, если диаметр зоны эталонного штамма вокруг диска с гентамицином равен 19 мм, то границами промежуточной зоны будут 13—16 мм, а пограничными значениями для устойчивых и чувствительных штаммов станут соответственно ^12 и ^17 мм (см. табл. 2).

Заключение

Разработаны новые «Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии в агар с использованием дисков». Предлагаемая методика основана на измерении диаметров зон задержки роста изучаемых микроорганизмов вокруг дисков с антибиотиками и оценке полученных данных по прилагаемой таблице.

Тир. 500.

Оценочная таблица для интерпретации данных диффузионного теста адаптирована к определенным питательным средам. Внедрение в производство новых питательных сред, антибиотиков и дисков потребует внесения в «Методические указания» соответствующих уточнений и дополнений.

Л-78554 от 28.04.83 г.    Зак. 839.

Типография Министерства здравоохранения СССР

УТВЕРЖДАЮ Начальник главного санитарно-эпидемиологического управления Министерства здравоохранения СССР

В. Е. Ковшило 10 марта 1983 г.

№ 2675-83

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ К антибиотикам МЕТОДОМ ДИФФУЗИИ В АГАР С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ дисков

1. Введение

В основе рациональной химиотерапии бактериальных инфекций лежит комплекс лабораторных методов исследований, в частности, выделение и идентификация возбудителя и определение его антибиограммы. У нас в стране определение чувствительности регламентируется «Методическими указаниями», изданными в 1976 г. («Методические указания по применению унифицированных клинических лабораторных методов исследований. Определение чувствительности микроорганизмов к химиотерапевтическим препаратам». Утверждены Приказом Министерства здравоохранения СССР № 250 от 13 марта 1975 г.). Рекомендуемый «Методическими указаниями» метод диффузии в агар с применением бумажных дисков является качественным и не отвечает современным требованиям клиники.

В связи с расширением ассортимента выпускаемых дисков и новыми рекомендациями ВОЗ по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам (28 доклад Комитета экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов, 1980) некоторые положения «Методических указаний» 1976 г. должны быть пересмотрены. В частности, пересмотра требует раздел «Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии в агар с применением бумажных дисков».

Настоящие «Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии в агар с использованием дисков» выпускаются с целью замены соответствующего раздела «Методических указаний» 1976 г.

Предлагаемая настоящими «Методическими указаниями» интерпретация результатов определения чувствительности основана на установлении зависимости между размерами зон задержки роста испытуемых культур вокруг дисков с антибиотиками и значениями МПК соответствующих антибиотиков в отношении тех же культур. Установление такой зависимости позволяет придать интерпретации результатов полу-количественный характер и относить изучаемые штаммы к одной из трех категорий чувствительности: устойчивые, умеренно устойчивые, чувствительные.

В связи с тем, что определяемая in vitro степень чувствительности микроорганизмов к антибиотикам зависит от условий постановки опыта, для получения достоверных и воспроизводимых результатов необходимо точное выполнение требований настоящей инструкции, а также использование стандартных сред и дисков промышленного производства.

2. Материалы

2.1. Диски с антибиотиками

Для определения чувствительности следует использовать диски, выпускаемые ПО «Мосмедпрепараты» им. Л. Я. Карпова. Диски готовят из фильтровального картона (ГОСТ 6723—75), который пропитывают раствором антибиотиков определенной концентрации, сушат и перфорируют. Размер дисков 6±0,5 мм. Содержание антибиотика в диске, указанное на этикетке, соответствует рекомендациям ВОЗ. Диски одного наименования содержат одну дозу антибиотика, за исключением дисков с карбенициллином, которые выпускают с содержанием 25 и 100 микрограмм препарата на диск.

Диски с различными антибиотиками отличаются друг от друга цветом картона или кодом, который представляет собой первую букву названия антибиотика, вытесненную на диске. Перечень дисков и их регистрационные номера приведены в табл. 1.

Диски расфасованы во флаконы по 100 штук. В связи с гигроскопичностью некоторых антибиотиков на дно флакона помещают силикагель — вещество, быстро поглощающее влагу и меняющее при этом свою окраску с синей на розовую. Изменение цвета силикагеля является показателем присутствия влаги во флаконе; диски из флаконов, в которых силикагель окрашен в розовый цвет, использовать нельзя.

Сроки и температура храпения дисков указаны на этикетке упаковки. Диски с просроченным сроком годности исполь-

зовать нельзя. После вскрытия флакон с дисками можно хранить в течение недели при температуре рефрижератора. Перед употреблением флаконы с дисками необходимо выдержать при комнатной температуре в течение 1 часа для предотвращения образования конденсата на внутренней стенке флакона.

Таблица 1

Перечень дисков, выпускаемых ПО «Мосмедпрепараты» им. Л. Я. Карпова

Антибиотик

Регистрацион-

Антибиотик

Регистрацион-

в диске

ный номер *

в диске

ный номер *

Ампициллин

60119

Олеандомицин

65065

Бензилпеннциллин

60006

Оксациллин

60122

Гентамицин

64136

Полимиксин

64024

Доксициклин

Ристомицин

65073

Канамицин

64108

Рнфампицин

69072

Карбенициллин (25 мкг)

60120

Сизомицнн

Карбенициллин

Стрептомицин

61010

(100 мкг)

60121

Тетрациклин

62015

Лсвомицстин

63003

Фузидин

Линкомицин

64124

Метициллин

60123

Цефалексин

Мономицин

65057

Цефалотин

Нсомицин

64068

Эритромицин

65048

* На ряд дисков регистрационные номера не установлены.

2.2. Питательные среды

Для определения чувствительности могут быть использованы следующие плотные питательные среды:

Среда № 1.

Бульон Хоттингера с содержанием

120—140 мг% аминного азота    —    1000    мл

Агар-агар 1    —    15    г

Натрия фосфат двузамещенный pH после стерилизации Среда № 2.

-    3 г

-    7,2-7,4

—    1000 мл

—    15 г

—    3 г

—    7,2—7,4

Мясо-пептонный бульон 1 : 2 Лгар-агар

Натрия фосфат двузамещенный pH после стерилизации

Среда АГВ 2.

Сухая питательная среда, в состав которой входят сухой питательный бульон, агар порошковидный, крахмал растворимый, натрия фосфат двузамещенный. Среду готовят из сухого порошка в соответствии с указанием, имеющимся на этикетке; pH после стерилизации 7,4±0,2.

Для гемофильных микроорганизмов, не растущих на обычных питательных средах, в перечисленные выше питательные среды добавляют 5% дефибринированной или гемолизированной крови.

3. Методика определения чувствительности 3.1. Приготовление чашек

Расплавленную среду разливают по 20 мл в стерильные чашки Петри диаметром 100 мм, расположенные на горизонтальной поверхности. Перед заражением поверхность застывшей среды подсушивают в течение 30—40 минут при комнатной температуре с приоткрытыми крышками. Готовые чашки можно хранить при +10° С не более 7 дней; перед употреблением их необходимо подсушить, как указано выше.

3.2. Приготовление инокулята и нанесение его на поверхность агаровой среды

Инокулят готовят из чистой 18—20 часовой культуры бактерий, выросшей на поверхности плотной питательной среды. Для этого 5—10 изолированных колоний суспендируют в жидкой питательной среде или в изотоническом растворе хлорида натрия. В качестве инокулята можно использовать также чистую 8—20 часовую бульонную кольтуру. Суспензию или бульонную культур разводят изотоническим раствором хлори-

да натрия до мутности оптического стандарта ГИСК им. Л. А. Тарасевича на 10 ЕД (при работе со средой № 1 или № 2) или 5 ЕД (при работе со средой АГВ), а затем полученную взвесь разводят далее еще в 10 раз изотоническим раствором хлорида натрия. Такой инокулят в первом случае содержит 5 -107, а во-втором — 2,5-107 микробных клеток в 1 мл взвеси (различия в плотности используемых инокулятов связаны с большей питательностью среды АГВ).

Инокулят в объеме 1—2 мл сразу после изготовления наносят на поверхность подсушенной агаровой среды и равномерно распределяют путем покачивания чашки. Избыток жидкости удаляют пипеткой. Приоткрытые чашки подсушивают при комнатной температуре в течение 10—15 минут.

В экстренных случаях для получения ориентировочных данных о чувствительности микроорганизмов допускается использование для посева непосредственно испытуемого материала. Плотные субстраты (мокрота, кал, гной и др.) должны быть предварительно тщательно гомогенизированы (растерты). Мочу или экссудат предварительно центрифугируют и посев производят из осадка. Материал наносят на поверхность среды с помощью ватного тампона или петли. После выделения чистой культуры анализ следует повторить.

3.3.    Наложение дисков

Диски с помощью пинцета накладывают на поверхность зараженной питательной среды на одинаковом расстоянии один от другого и примерно на расстоянии 2 см от края чашки. На одну чашку следует помещать не более 6 дисков.

3.4.    Инкубация чашек

Чашки помещают в термостат сразу после наложения дисков и инкубируют в течение 18— 20 часов при 35—37° С в перевернутом кверху дном положении. При определении чувствительности к метициллину и оксациллину чашки инкубируют при 35° С.

3.5. Учет результатов

Чашки помещают кверху дном на темную матовую поверхность так, чтобы свет настольной лампы падал на них под углом 45° (учет в отраженном свете). Допускается учет результатов в проходящем свете, однако в этом случае отмечается большая субъективность в оценке диаметров зон задержки роста.

Пограничные значения диаметров зон задержки

интерпретации


о


А

А

А

А

л

л

А

А

А

А

А А

А

Л

U

ь-

U.

«О

ЧС

3

=

8

•—

7

*•

*

ю

1

►3

8

Г

Г

?

3

и

т

•3

**

7

ов

£

сь

с»

8

ов

5

8

W

8

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V V

V

V

ов

о

5

**

2

«

•л

3

S

3

А

Л

л

л

л

А

л

А

Л

А А

л

л

U

5

=

*

•в

а

о

8

W

__

м

Г

и

■ч

т

*4

Г

У

Г

7

7

■Ч

«

а

•о

9>

в

»

*

V)

£

о.

8

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V V

V

V

«

VO

8

VC

8

ч>

£

3

-

3

3

V

V

V

V

V

V

V

8

1

о»

Й

Й

i

1

8

а

а

!

1

1

А

Л

л

Л

А

л

л

л

л

А

А А

А

А

О

О*

о

а.

о

о

СаЭ

8

с*.

ве

°

S

Р


ус то Вам*

*

Л

1

г

умереиио

устойчивые

Хт

_

X

ь

к

чувствительные

*

М

**

ж

устоВчсвме

5

с

к

X

умеренно

устойчивые

а

>

о

чувствительнее

э

-

устойчивые

X

а

*

к

5

13

чувствительные

5

я

•- в»

-


si


н

!


1

1 1

3 1

4

Гентамицин

10

белый

Г

Сизомицнн

10

белый

С

Тетрациклин

30

желтый

-

Доксициклпп

10

белый

д

Эритромицин

15

красный

-

Олсандомнцин

15

бирюзовый

-

Линкомицин

15

голубой

-

Левомицетин

30

белый

Рифампицин

5

оранжевый

р

Фузидин

10

белый

ф

Полимиксин

300

ЕД

бежевый

Рнстомицин

30

черный

С помощью линейки или измерителя (кронциркуль, штангенциркуль) измеряют диаметры зон задержки роста вокруг дисков, включая диаметр самих дисков, с точностью до 1 мм. Не следует обращать внимание на очень мелкие колонии, выявляемые при определенных условиях освещения в пределах зоны торможения роста. При нерезко очерченных краях зон или зонах с двойными контурами следует измерять диаметр зоны по наиболее четкому контуру, игнорируя мелкие колонии или едва заметный газон у края зоны. При наличии больших колоний по периферии зоны, граница ее определяется местоположением внутреннего края этой группы колоний. Если крупные колонии распределены по всей зоне, культуру следует проверить на однородность, а испытание повторить. Такие колонии при отсутствии загрязнения инокулята посторонней микрофлорой позволяют предположить наличие гетерорезистентной популяции.

При определении чувствительности к некоторым антибиотикам роящихся штаммов протея, зона задержки роста может быть затянута тонкой вуалеобразной пленкой, которая обычно не мешает установлению границы зоны.

<13

<13

<15

16-19

<!2

13—19

<14

15-18

<12

13—17

<19

20—23

<14

15—18

<9

10-12

<12

13—19

<8

9-12

<9

10—11


2*16

17—21

3*22

18—21

>22

17—20

5=21

20-23

5*24

16-18

2=19

13—15

>16

12—14

2*15

10—11

>12


5*14

<15

>20

<16

2^20

>19

<17

2*18

<16

2=24

<1Э

>19

<15

=*13

<12

3*20

5г'3

<11

5*12

<9


5*6

<4

>6

<4

>'2

5*12

S*8

5*8

>8

<2

>16

<8

>8

<2

>16

>50

ЕД/мл

<5


3.6. Интерпретация полученных результатов


Оценку результатов проводят по табл. 2, которая содержит пограничные значения диаметров зон задержки роста для устойчивых, умеренно устойчивых и чувствительных штаммов, а также значения МПК антибиотиков для устойчивых и чувствительных штаммов.

Пограничные значения диаметров зон представлены раздельно для сред № 1—2 и АГВ, поскольку эти среды отличаются по ряду параметров, определяющих интенсивность роста микроорганизмов и способность антибиотиков диффундировать в агар.

Полученные значения диаметров зон задержки роста сравнивают с пограничными значениями в таблице и относят изучаемые штаммы к одной из трех категорий чувствительности.

К чувствительным относят штаммы микроорганизмов, рост которых подавляется при концентрациях препарата, обнаруживаемых в сыворотке крови больного при использовании обычных доз антибиотиков. К умеренно-устойчивым относят

1

В связи с наличием в некоторых сортах агар-агара повышенного содержания ионов двухвалентных металлов Са++ и Mg++, существенно влияющих на результаты определения чувствительности к ряду антибиотиков (тетрациклинам, аминогликозидам, полимиксину), для приготовления сред Л? 1 и № 2 рекомендуется использовать агар-агар «Тафуин-екяй» Южно-морского завода Министерства рыбного хозяйства СССР

2

Среда АГВ выпускается Дагестанским НИИ питательных сред.