Купить бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее
Цена на этот документ пока неизвестна. Нажмите кнопку "Купить" и сделайте заказ, и мы пришлем вам цену.
Распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль"
Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.
"Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии в агар с использованием дисков" выпускаются с целью замены соответствующего раздела «Методических указаний» 1976 г.
1. Введение
2. Материалы
2.1. Диски с антибиотиками
2.2. Питательные среды
3. Методика определения чувствительности
3.1. Приготовление чашек
3.2. Приготовление инокулята и нанесение его на поверхность агаровой среды
3.3. Наложение дисков
3.4. Инкубация чашек
3.5. Учет результатов
3.6. Интерпретация полученных результатов
4. Выбор дисков для исследования
5. Контроль воспроизводимости и точности полученных результатов
Заключение
Дата введения | 10.03.1983 |
---|---|
Добавлен в базу | 01.02.2020 |
Завершение срока действия | 04.03.2004 |
Актуализация | 01.01.2021 |
Чтобы бесплатно скачать этот документ в формате PDF, поддержите наш сайт и нажмите кнопку:
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ К АНТИБИОТИКАМ МЕТОДОМ ДИФФУЗИИ В АГАР С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДИСКОВ
Москва — 1983
Разработаны:
Центральным ордена Ленина институтом усовершенствования врачей (Н. И. Гивенталь, В. Р. Соболев, Е. А. Ведьмина, И. В. Власова);
Всесоюзным научно-исследовательским институтом антибиотиков (С. П. Резван, С. М. Чайковская, И. П. Фомина, С. М. Новашин).
Рекомендованы к утверждению Лабораторным Советом при Главном санитарно-эпидемиологическом управлении Министерства здравоохранения СССР.
штаммы, для подавления роста которых требуются концентрации, создающиеся в сыворотке крови при введении максимальных доз препарата. Устойчивыми являются микроорганизмы, рост которых не подавляется препаратом в концентрациях, достижимых в организме при использовании максимально допустимых доз.
Метод диффузии в агар не дает надежных данных при определении чувствительности к плохо диффундирующим по-липептидным антибиотикам — полимиксину, ристомицину. Если эти антибиотики предполагается использовать для лечения генерализованной инфекции, определение чувствительности следует проводить методом разведений.
4. Выбор дисков для исследования
Для сокращения объема испытания целесообразно использовать наборы дисков, составленные с учетом вида выделенного возбудителя и локализации инфекции (табл. 3).
Таблица 3
Диски с антибиотиками |
Предварительное испытание чувствительности микрофлоры путем прямого посева патологического материала |
Испытание чувствительности чистой кольутры возбудителя | ||||
стафилокок |
стрептококки, i пневмококки | |
энтеробактерии (эшери-хии, протей и др.) |
1 псевдомонады | |||
мок рота |
гной моча | |||||
1 |
2 |
3 | 4 | 5 | 6 |
7 |
8 |
Беизнлпеиициллин |
Ж |
+ |
+ | |
Ампициллин |
+ |
+ | ||
Карбенициллнн (25 мкг) | ||||
Карбенициллнн (100 мкг) |
+ | |||
Мстицилл и н-Окса цилл и и |
+ |
+ |
+ | |
Цсфалексин-Цефалотнн |
+ |
+ |
4- |
Основные наборы дисков с антибиотиками, рекомендуемые для определения чувствительности возбудителя в зависимости от патологического материала и вида выделенной культуры
+
Ж
+
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Примечание: (+) — антибиотики, чувствительность к которым следует определять во вторую очередь; (+) * — возможно применение при устойчивости ко всем другим антибиотикам. |
ВОЗ для определения чувствительности к антибиотикам, близким но химическому строению и антибактериальному спектру действия, рекомендует использовать класс-диск, содержащий один из антибиотиков определенной группы.
Так, с помощью диска, содержащего бензилпеницилин, можно определять чувствительность к феноксиметилпеницил-лину и бициллину. Для определения чувствительности к антибиотикам тетрациклииовой группы (за исключением докси-циклина) пользуются диском, содержащим тетрациклин.
Диски с оксациллином можно использовать для определения чувствительности к оксацнллину, метнциллину и дикло-ксациллину. Стафилоккоки, устойчивые к оксациллину, устойчивы и к антибиотикам цефалоспориновой группы. Диск с цефалотином можно использовать для определения чувствительности к цефалоридину и цефалексину.
5. Контроль воспроизводимости и точности полученных результатов
Применение заранее разработанной таблицы для интерпретации результатов возможно только при соблюдении строго стандартных условий постановки опыта и использовании стандартных питательных сред.
Допустимые пределы диаметров зон задержки роста эталонных штаммов при контроле воспроизводимости и точности результатов
Таблица 4 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
Для контроля воспроизводимости и точности процедуры определения чувствительности рекомендуется при каждой постановке теста параллельно с испытуемыми штаммами использовать эталонные штаммы Escherichia coli (АТСС 25922), Staphylococcus aureus (АТСС 25923) и Pseudomonas aeruginosa (АТСС 27853), которые можно получить в ГИСК им. Л. А. Тарасевича.
Эталонные штаммы сохраняют в полужидком питательном агаре под вазелиновым маслом. Пересев производят один раз в 3 месяца.
Диаметры зон задержки роста эталонных штаммов не должны выходить за пределы, указанные в табл. 4. Эталонные штаммы могут быть использованы для проверки качества среды, дисков и правильности методики постановки теста.
Выше было отмечено влияние катионов Саь+ и Mg44" в питательной среде на результаты определения чувствительности. Колебания в содержании указанных катионов особенно сильно отражаются на чувствительности Pseudomonas aeruginosa к гентамицину, что в ряде случаев может привести к неправильной оценке результатов определения. Эталонный штамм Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853 можно использовать для корректировки пограничных значений диаметров зон при определении чувствительности клинических штаммов Pseudomonas aeruginosa к гентамицину. Для этого от диаметра зоны эталонного штамма, установленного в опыте, отнимают 6 и 3 мм. Полученные две цифры характеризуют границы «подвижной» промежуточной зоны, т. е. зоны умеренно устойчивых штаммов. Например, если диаметр зоны эталонного штамма вокруг диска с гентамицином равен 19 мм, то границами промежуточной зоны будут 13—16 мм, а пограничными значениями для устойчивых и чувствительных штаммов станут соответственно ^12 и ^17 мм (см. табл. 2).
Заключение
Разработаны новые «Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии в агар с использованием дисков». Предлагаемая методика основана на измерении диаметров зон задержки роста изучаемых микроорганизмов вокруг дисков с антибиотиками и оценке полученных данных по прилагаемой таблице.
Тир. 500.
Оценочная таблица для интерпретации данных диффузионного теста адаптирована к определенным питательным средам. Внедрение в производство новых питательных сред, антибиотиков и дисков потребует внесения в «Методические указания» соответствующих уточнений и дополнений.
Л-78554 от 28.04.83 г. Зак. 839.
Типография Министерства здравоохранения СССР
УТВЕРЖДАЮ Начальник главного санитарно-эпидемиологического управления Министерства здравоохранения СССР
В. Е. Ковшило 10 марта 1983 г.
№ 2675-83
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ К антибиотикам МЕТОДОМ ДИФФУЗИИ В АГАР С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ дисков
1. Введение
В основе рациональной химиотерапии бактериальных инфекций лежит комплекс лабораторных методов исследований, в частности, выделение и идентификация возбудителя и определение его антибиограммы. У нас в стране определение чувствительности регламентируется «Методическими указаниями», изданными в 1976 г. («Методические указания по применению унифицированных клинических лабораторных методов исследований. Определение чувствительности микроорганизмов к химиотерапевтическим препаратам». Утверждены Приказом Министерства здравоохранения СССР № 250 от 13 марта 1975 г.). Рекомендуемый «Методическими указаниями» метод диффузии в агар с применением бумажных дисков является качественным и не отвечает современным требованиям клиники.
В связи с расширением ассортимента выпускаемых дисков и новыми рекомендациями ВОЗ по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам (28 доклад Комитета экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов, 1980) некоторые положения «Методических указаний» 1976 г. должны быть пересмотрены. В частности, пересмотра требует раздел «Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии в агар с применением бумажных дисков».
Настоящие «Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии в агар с использованием дисков» выпускаются с целью замены соответствующего раздела «Методических указаний» 1976 г.
Предлагаемая настоящими «Методическими указаниями» интерпретация результатов определения чувствительности основана на установлении зависимости между размерами зон задержки роста испытуемых культур вокруг дисков с антибиотиками и значениями МПК соответствующих антибиотиков в отношении тех же культур. Установление такой зависимости позволяет придать интерпретации результатов полу-количественный характер и относить изучаемые штаммы к одной из трех категорий чувствительности: устойчивые, умеренно устойчивые, чувствительные.
В связи с тем, что определяемая in vitro степень чувствительности микроорганизмов к антибиотикам зависит от условий постановки опыта, для получения достоверных и воспроизводимых результатов необходимо точное выполнение требований настоящей инструкции, а также использование стандартных сред и дисков промышленного производства.
2. Материалы
2.1. Диски с антибиотиками
Для определения чувствительности следует использовать диски, выпускаемые ПО «Мосмедпрепараты» им. Л. Я. Карпова. Диски готовят из фильтровального картона (ГОСТ 6723—75), который пропитывают раствором антибиотиков определенной концентрации, сушат и перфорируют. Размер дисков 6±0,5 мм. Содержание антибиотика в диске, указанное на этикетке, соответствует рекомендациям ВОЗ. Диски одного наименования содержат одну дозу антибиотика, за исключением дисков с карбенициллином, которые выпускают с содержанием 25 и 100 микрограмм препарата на диск.
Диски с различными антибиотиками отличаются друг от друга цветом картона или кодом, который представляет собой первую букву названия антибиотика, вытесненную на диске. Перечень дисков и их регистрационные номера приведены в табл. 1.
Диски расфасованы во флаконы по 100 штук. В связи с гигроскопичностью некоторых антибиотиков на дно флакона помещают силикагель — вещество, быстро поглощающее влагу и меняющее при этом свою окраску с синей на розовую. Изменение цвета силикагеля является показателем присутствия влаги во флаконе; диски из флаконов, в которых силикагель окрашен в розовый цвет, использовать нельзя.
Сроки и температура храпения дисков указаны на этикетке упаковки. Диски с просроченным сроком годности исполь-
зовать нельзя. После вскрытия флакон с дисками можно хранить в течение недели при температуре рефрижератора. Перед употреблением флаконы с дисками необходимо выдержать при комнатной температуре в течение 1 часа для предотвращения образования конденсата на внутренней стенке флакона.
Таблица 1 Перечень дисков, выпускаемых ПО «Мосмедпрепараты» им. Л. Я. Карпова | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
* На ряд дисков регистрационные номера не установлены. |
2.2. Питательные среды
Для определения чувствительности могут быть использованы следующие плотные питательные среды:
Среда № 1.
Бульон Хоттингера с содержанием
120—140 мг% аминного азота — 1000 мл
Агар-агар 1 — 15 г
Натрия фосфат двузамещенный pH после стерилизации Среда № 2.
- 3 г
- 7,2-7,4
— 1000 мл
— 15 г
— 3 г
— 7,2—7,4
Мясо-пептонный бульон 1 : 2 Лгар-агар
Натрия фосфат двузамещенный pH после стерилизации
Среда АГВ 2.
Сухая питательная среда, в состав которой входят сухой питательный бульон, агар порошковидный, крахмал растворимый, натрия фосфат двузамещенный. Среду готовят из сухого порошка в соответствии с указанием, имеющимся на этикетке; pH после стерилизации 7,4±0,2.
Для гемофильных микроорганизмов, не растущих на обычных питательных средах, в перечисленные выше питательные среды добавляют 5% дефибринированной или гемолизированной крови.
3. Методика определения чувствительности 3.1. Приготовление чашек
Расплавленную среду разливают по 20 мл в стерильные чашки Петри диаметром 100 мм, расположенные на горизонтальной поверхности. Перед заражением поверхность застывшей среды подсушивают в течение 30—40 минут при комнатной температуре с приоткрытыми крышками. Готовые чашки можно хранить при +10° С не более 7 дней; перед употреблением их необходимо подсушить, как указано выше.
3.2. Приготовление инокулята и нанесение его на поверхность агаровой среды
Инокулят готовят из чистой 18—20 часовой культуры бактерий, выросшей на поверхности плотной питательной среды. Для этого 5—10 изолированных колоний суспендируют в жидкой питательной среде или в изотоническом растворе хлорида натрия. В качестве инокулята можно использовать также чистую 8—20 часовую бульонную кольтуру. Суспензию или бульонную культур разводят изотоническим раствором хлори-
да натрия до мутности оптического стандарта ГИСК им. Л. А. Тарасевича на 10 ЕД (при работе со средой № 1 или № 2) или 5 ЕД (при работе со средой АГВ), а затем полученную взвесь разводят далее еще в 10 раз изотоническим раствором хлорида натрия. Такой инокулят в первом случае содержит 5 -107, а во-втором — 2,5-107 микробных клеток в 1 мл взвеси (различия в плотности используемых инокулятов связаны с большей питательностью среды АГВ).
Инокулят в объеме 1—2 мл сразу после изготовления наносят на поверхность подсушенной агаровой среды и равномерно распределяют путем покачивания чашки. Избыток жидкости удаляют пипеткой. Приоткрытые чашки подсушивают при комнатной температуре в течение 10—15 минут.
В экстренных случаях для получения ориентировочных данных о чувствительности микроорганизмов допускается использование для посева непосредственно испытуемого материала. Плотные субстраты (мокрота, кал, гной и др.) должны быть предварительно тщательно гомогенизированы (растерты). Мочу или экссудат предварительно центрифугируют и посев производят из осадка. Материал наносят на поверхность среды с помощью ватного тампона или петли. После выделения чистой культуры анализ следует повторить.
3.3. Наложение дисков
Диски с помощью пинцета накладывают на поверхность зараженной питательной среды на одинаковом расстоянии один от другого и примерно на расстоянии 2 см от края чашки. На одну чашку следует помещать не более 6 дисков.
3.4. Инкубация чашек
Чашки помещают в термостат сразу после наложения дисков и инкубируют в течение 18— 20 часов при 35—37° С в перевернутом кверху дном положении. При определении чувствительности к метициллину и оксациллину чашки инкубируют при 35° С.
3.5. Учет результатов
Чашки помещают кверху дном на темную матовую поверхность так, чтобы свет настольной лампы падал на них под углом 45° (учет в отраженном свете). Допускается учет результатов в проходящем свете, однако в этом случае отмечается большая субъективность в оценке диаметров зон задержки роста.
Пограничные значения диаметров зон задержки интерпретации |
о
А |
А |
А |
А |
л |
л |
А |
А |
А |
А |
А А |
А |
Л | |
U |
ь- |
U. |
«О |
ЧС |
3 |
= |
8 | ||||||
•— 7 |
*• |
* |
ю 1 |
►3 |
8 |
Г |
Г |
? |
3 |
и т |
•3 |
** 7 | |
ов |
£ |
сь |
с» |
8 |
ов |
5 |
8 |
W |
8 | ||||
V |
V |
V |
V |
V |
V |
V |
V |
V |
V |
V V |
V |
V | |
ов |
о |
5 |
** |
2 |
« |
*ч |
•л |
3 |
S |
3 | |||
А |
Л |
л |
л |
л |
А |
л |
А |
Л |
А А |
л |
л | ||
U |
5 |
<Л |
= |
* |
•в |
а |
о |
8 | |||||
W |
__ |
м | |||||||||||
Г |
и |
■ч |
V» |
т |
— |
*4 |
Г |
У |
Г |
7 |
7 | ||
■Ч |
« |
а |
•о |
9> |
в |
» |
*» |
* |
V) |
£ |
о. |
8 | |
V |
V |
V |
V |
V |
V |
V |
V |
V |
V V |
V |
V | ||
« |
VO |
8 |
VC |
8 |
ч> |
£ |
3 |
- |
3 |
-ч |
3 | ||
V |
V |
V |
V |
V |
V |
V | |||||||
■ |
8 |
1 |
о» |
Й |
Й |
i |
1 |
8 |
а |
а |
! |
1 |
1 |
А |
Л |
л |
Л |
А |
л |
л |
л |
л |
А |
А А |
А |
А | |
О |
О* |
о |
а. |
о |
о |
СаЭ |
8 |
с*. |
ве |
° |
S |
Р |
|
я •- в» - |
н
!
1 |
1 1 |
3 1 |
4 |
Гентамицин |
10 |
белый |
Г |
Сизомицнн |
10 |
белый |
С |
Тетрациклин |
30 |
желтый |
- |
Доксициклпп |
10 |
белый |
д |
Эритромицин |
15 |
красный |
- |
Олсандомнцин |
15 |
бирюзовый |
- |
Линкомицин |
15 |
голубой |
- |
Левомицетин |
30 |
белый |
— |
Рифампицин |
5 |
оранжевый |
р |
Фузидин |
10 |
белый |
ф |
Полимиксин |
300 ЕД |
бежевый |
— |
Рнстомицин |
30 |
черный |
— |
С помощью линейки или измерителя (кронциркуль, штангенциркуль) измеряют диаметры зон задержки роста вокруг дисков, включая диаметр самих дисков, с точностью до 1 мм. Не следует обращать внимание на очень мелкие колонии, выявляемые при определенных условиях освещения в пределах зоны торможения роста. При нерезко очерченных краях зон или зонах с двойными контурами следует измерять диаметр зоны по наиболее четкому контуру, игнорируя мелкие колонии или едва заметный газон у края зоны. При наличии больших колоний по периферии зоны, граница ее определяется местоположением внутреннего края этой группы колоний. Если крупные колонии распределены по всей зоне, культуру следует проверить на однородность, а испытание повторить. Такие колонии при отсутствии загрязнения инокулята посторонней микрофлорой позволяют предположить наличие гетерорезистентной популяции.
При определении чувствительности к некоторым антибиотикам роящихся штаммов протея, зона задержки роста может быть затянута тонкой вуалеобразной пленкой, которая обычно не мешает установлению границы зоны.
<13 |
— |
<13 |
— |
<15 |
16-19 |
<!2 |
13—19 |
<14 |
15-18 |
<12 |
13—17 |
<19 |
20—23 |
<14 |
15—18 |
<9 |
10-12 |
<12 |
13—19 |
<8 |
9-12 |
<9 |
10—11 |
— |
2*16 |
17—21 |
3*22 |
18—21 |
>22 |
17—20 |
5=21 |
20-23 |
5*24 |
16-18 |
2=19 |
13—15 |
>16 |
12—14 |
2*15 |
10—11 |
>12 |
5*14 |
<15 |
>м | |
>20 |
<16 |
2^20 | |
>19 |
<17 |
2*18 |
<16 |
2=24 |
<1Э |
>19 |
<15 |
=*13 |
<12 |
3*20 | |
5г'3 |
<11 |
5*12 |
<9 |
5*6 |
<4 |
>6 |
<4 |
>'2 | |
5*12 | |
S*8 | |
5*8 | |
>8 |
<2 |
>16 |
<8 |
>8 |
<2 |
>16 | |
>50 |
— |
ЕД/мл |
<5 |
3.6. Интерпретация полученных результатов
Оценку результатов проводят по табл. 2, которая содержит пограничные значения диаметров зон задержки роста для устойчивых, умеренно устойчивых и чувствительных штаммов, а также значения МПК антибиотиков для устойчивых и чувствительных штаммов.
Пограничные значения диаметров зон представлены раздельно для сред № 1—2 и АГВ, поскольку эти среды отличаются по ряду параметров, определяющих интенсивность роста микроорганизмов и способность антибиотиков диффундировать в агар.
Полученные значения диаметров зон задержки роста сравнивают с пограничными значениями в таблице и относят изучаемые штаммы к одной из трех категорий чувствительности.
К чувствительным относят штаммы микроорганизмов, рост которых подавляется при концентрациях препарата, обнаруживаемых в сыворотке крови больного при использовании обычных доз антибиотиков. К умеренно-устойчивым относят
1
В связи с наличием в некоторых сортах агар-агара повышенного содержания ионов двухвалентных металлов Са++ и Mg++, существенно влияющих на результаты определения чувствительности к ряду антибиотиков (тетрациклинам, аминогликозидам, полимиксину), для приготовления сред Л? 1 и № 2 рекомендуется использовать агар-агар «Тафуин-екяй» Южно-морского завода Министерства рыбного хозяйства СССР
2
Среда АГВ выпускается Дагестанским НИИ питательных сред.