Энзиматическое агар-диффузное определение фосфорорганических инсектицидов в продуктах животного происхождения

Энзиматическое агар-диффузное определение
фосфорорганических инсектицидов в продуктах
животного происхождения

Принцип метода. В основу метода* положен принцип количественного определения антибиотиков, модифицированный Санди для определения остатков фосфорорганических пестицидов в растениях. Фосфорорганические пестициды диффундируют в содержащий холинэстеразу слой агара и угнетают фермент. Затем слой с агаром обрабатывают ацетилхолином, при энзиматическом расщеплении которого образуется уксусная кислота. Она изменяет окраску содержащегося в агаре индикатора - бромтимолового синего. Диаметры или площади участков агара с измененной окраской зависят от концентрации инсектицида в растворе. Сильные ингибиторы холинэстеразы могут быть определены сразу, а слабые (эфиры тио- и дитиофосфорной кислот) - после активации.

________

* А.А. Непоклонов, В.К. Метелица (ВНИИВС)

Реактивы и растворы

Хлороформ

Спирт этиловый 96°-ный

Ацетон ч.д.а.

Агар

Бромтимоловый синий (индикатор)

Едкий натр

Нормальная лошадиная сыворотки

Насыщенный водный раствор брома

0,1 М раствор тиосульфата натрия

Ацетилхолин

Индикаторная бумага (рН 6,6 - 8,1) или рН-метр

Стандартные растворы инсектицидов в этиловом спирте и ацетоне

Приборы и посуда

Гомогенизатор

Водяная баня

Ножницы

Стеклянные воронки

Круглодонные колбы на 25, 50, 100 и 1000 мл

Делительные воронки на 100 мм

Бюксы на 25 и 50 мл с пришлифованными крышками

Стеклянные мерные цилиндры разных размеров

Чашки Петри

Пипетки на 0.1; 1,5 и 10 мл

Пробковые сверла диаметром 8 - 10 мл

Ход анализа. Приготовление среды на основе агара. 16 г агара растворяют при постоянном помешивании в 800 мл кипящей дистиллированной воды. Раствор фильтруют через марлевый фильтр, охлаждают до +50 °С и определяют рН. Обычно pH колеблется от 5,6 до 7,7 и может постепенно снижаться. Для получения более стабильной реакции в среду добавляют 10 %-ный водный раствор едкого натра: при pH 5,6 - 5,9 добавляют 3 мл, при pH 6,3 - 6,7 - 0,5 мл, при pH 7,5 - 7,7 - 0,3 мл. После перемешивания среду оставляют на 20 - 24 ч, затем расплавляют путем подогревания и доводят температуру до +50 °С. Добавляют 100 мг бромтимолового синего, растворенного в 2 мл 0,1 н. едкого натра, и 20 мл лошадиной сыворотки разведенной до 200 мм дистиллированной водой. Измеряют pH среды и доводят до 7,8 - 8,0. Необходимо все время поддерживать температуру среды на уровне +50 °С. Готовую среду разливают в чашки Петри (примерно 35 мл в чашку), чтобы образовался слой толщиной 5 - 4 мм.

Экстракция. Пробы тканей массой 20 г гомогенизируют или тщательно измельчают ножницами, заливают 20 мл хлороформа и экстрагируют в течение 2 ч. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр, остаток заливают 20 мл хлороформа, перемешивают и фильтруют. Хлороформный экстракт выпаривают в вытяжном шкафу или на ротационном испарителе.

Пробы молока, мочи, крови и других жидких биологических субстратов объемов 20 мл экстрагируют без встряхивания 2 ч в делительной воронке 20 мл хлороформа, Экстракт отделяют, остаток промывают 20 мл хлороформа. Обе порции экстракта объединяют, фильтруют и выпаривают. Остаток растворяют в 1 мл этилового спирта или ацетона.

Активация пестицидов. Производные тио- и дитиофосфорных кислот обладают слабым ингибирующим действием на холинэстеразу in vitro, поэтому путем окисление бромом их переводят в сильно ингибирующие дериваты. Для этого к растворенному в 0,5 мл спирта или ацетона экстракту, содержащему инсектицид, добавляют 0,1 мл насыщенного водного раствора брома и оставляют на 30 мин при комнатной температуре. Нейтрализуют излишек брома 0,1 мл 0,1 М раствора тиосульфата натрия, вносят одну каплю 0,05 %-ного раствора бромтимолсинего, растворенного в 0,1 н. растворе NaOH, и добавляют по каплям 0,1 н. раствор едкого натра до появления синей окраски. Общие объем доводят спиртом (ацетоном) до 1 мл.

Проведение анализа. В затвердевшей среде в центре чашки Петри просверливают корковым сверлом отверстие, извлекают высверленный столбик агарового геля и вносят в лунку 0,1 мл раствора экстракта. Чашки накрывают крышками и оставляют на 18 - 20 ч при комнатной температуре или ставят на 6 - 8 в ч в термостат с температурой 38 °С, чтобы инсектицид диффундировал в агар.

В аналогичных условиях определяют также ингибирующее действие чистых инсектицидов, которые используются для построения калибровочной кривой.

После диффузии в чашки Петри наливают по 15 мл 0,5 %-ного водного раствора ацетилхолина. Чашки переносят в водяную баню с температурой +40 °С на 30 мин. Зона диффузии инсектицида в агаре проявляется в виде ровных кругов интенсивно-синего или сине-зеленого цвета на желтоватом фоне остальной части агара. Диаметры кругов измеряют циркулем и по линейке определяют их размер. Если известно, какой инсектицид находится в исследуемой пробе, то проводят его количественное определение, сопоставляя с калибровочной кривой диаметры или площади кругов. В остальных случаях агар-диффузным методом выясняют, имеются ли в экстракте угнетающие холинэстеразу вещества, и для их идентификации применяют хроматографию или другие методы исследования.

В таблице 17 приведены пределы определения 20 фосфорорганических инсектицидов в продуктах животного происхождения. При более высоких, чем указано в таблице, количествах препаратов в экстрактах требуется разведение. Для построения калибровочной кривой диметры или площади кругов откладывают на графике против логарифмов концентраций или количеств действующих веществ.

При определении пестицидов в продуктах животного происхождения вносят поправку на полноту извлечения. Хлороформом указанные в таблице пестициды извлекаются из биоматериала в количестве 30 - 80 %, причем из разных тканей экстракция одного и того же препарата также может быть разной. Поскольку метод высокочувствителен, можно считать, что препараты из биоматериала экстрагируются на 50 %, и соответственно нужно вносить поправку при расчетах.

Таблица 17

Пределы чувствительности определения инсектицидов
энзиматическим агар-диффузным методом, мкг в 0,1 мл пробы

Количество препарата в органах и тканях животных вычисляют по формуле:

Х - количество препарата в 1 кг биологического продукта, мг;

А - количество препарата в исследуемой пробе, определенное по калибровочному графику, мкг,

Р - масса пробы, г;

20000 - коэффициент.