МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

по диагностике, лечению и специфической профилактике инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота, вызванного бактериями Moraxella bovis и Moraxella bovoculi

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

по диагностике, лечению и специфической профилактике инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота, вызванного бактериями

Moraxella bovis и Moraxella bovoculi

Москва 2017

ных последовательностей штамма «СХ-Ч6 №-ДЕП» Moraxclla bovoculi с последовательностями микроорганизмов, представленных на базах данных нуклеотидных последовательностей Gen Bank. При этом была установлена наибольшая гомология анализируемых последовательностей с геном 16S рРНК Moraxclla bovoculi (99,9%).

На штамм получен патент РФ на изобретение № 2521651 от 12.05.14. он признан производственным и предназначен для изготовления вакцины против ИКК КРС и диагностикумов. Штамм характеризуется следующими свойствами:

•    клетки штамма при культивировании в течение 24 ч при температуре 37°С на кровяном мясопсптонном агаре с содержанием 6-10% дефибринированной крови барана формируют колонии белого цвета 0 < 1 мм. круглые, выпуклые, с ровными краями, влажной поверхностью и зоной (3-гемолиза (рис. 3);

•    в мазках, окрашенных по Граму, представляют собой грамотри-цательные диплококки, с редко встречающимися кокками, диаметр клеток 0.7-1,3 мкм. смежные стороны клеток уплощены (рис. 4).

Рис. 3. Колонии бактерий Moraxella bovoculi после 24-часовой инкубации на кровяной агаре

10

Рис. 4. 24-часовая культура бактерий Moraxella bovoculi. Окраска по Грану (*320)

Moraxella bovoculi - факультативный аэроб, нс ферментирует сахаров. нс образует индол, нс разжижает желатин, даст положительную реакцию на оксидазу и отрицательную - на пробу с лакмусовым молоком. Активно образует эндотоксин, переходящий в анатоксин под действием тепла и формалина. Продуцируемый токсин обладает гемолитическим и некротическим действиями. LD^ для белых мышей составляет 5x10^х микробных клеток. Инактивированная формалином культура при подкожном введении индуцирует у телят образование специфических антител к бактериям Moraxella bovoculi, а также формирование специфического иммунитета.

Основные культурально-морфологические и биохимические свойства мораксслл представлены в табл. 2.

Таблица 2 Ку. 1ыура.’ и» но-морфо. югичсск’ие н биологические свойства бактерин рода Moraxella

Momxella bovis Moraxella bovoculi Морфология Палочки, ди-плобациллы Кокки, диплококки Тип колоний (R) S Подвижность - (дергающаяся) - Гемолиз + (+) Каталазная активность (+) +

Продолжение табл. 2

Moraxella bovis Moraxella bovoculi Оксндазная активность + + Разжижение желатина + - Редукция нитратов (-) (+) Сахаролитические свойства - - Гидролиз твнна 80 (+) + Урсазная активность - - Цитрат - - Фенилаланин дезаминазная активность - + Ферментация в лакмусовом молоке + -

Примечание + - положительные. (+) - большинство положительные: — отрицательные. (-) - большинство отрицательные.

3. эпизоотология

Заболевание обычно начинается весной, достигает максимальной интенсивности в начале лета и несколько уменьшается к осени, а отдельные случаи могут быть и зимой, что обусловлено снижением резистентности организма, нарушением зоогигиснических условий содержания животных.

Бактерии Moraxella bovis и Moraxella bovoculi обычно обнаруживаются в конъюнктивальном мешке глаз и выделениях из носа крупного рогатого скота, пораженного инфекционным кератоконъ-юнктивитом. Источником инфекции являются больные или инфицированные животные. Некоторые здоровые особи крупного рогатого скота являются носителями бактерий Moraxella в зимние месяцы. Жизнеспособные бактерии сохраняются в глазных и носовых выделениях в течение многих месяцев после клинического выздоровления |6, 7, 20|.

Перемещение инфицированного скота или жиbothых-носителей возбудителя из одного хозяйства в другое - обычный путь распространения заболевания. Возбудитель ИКК крупного рогатого скота легко переносится внутри стада на восприимчивых животных - механически с экссудатом и выделениями из пораженных глаз. В весенние и летние месяцы домашние мухи и мухи-жигалки, поедая

12

слезную жидкость из инфицированных глаз и перелетая на здоровых животных, увеличивают вероятность распространения заболевания. Фактором передачи могут слу жить также носовые истечения: инфицированные капельки при усиленном дыхании и кашле попадают в воздух и на глаза других животных. Использование общих корму шек и поилок способству ет непрямому контакту и распространению возбудителя заболевания среди животных.

По проведенным исследованиям и наблюдениям ветеринарных специалистов наиболее подвержены болезни молодые и с непигмен-тированной кожей вокруг глаз животные шортгорнской, голштино-фризской и гсрсфордской пород.

Установлено, что в свежих очагах энзоотия ИКК протекает остро и в течение 20-35 дней охватывает 50-80% поголовья. В стационарно неблагополучных очагах заболевают не все животные, а только телята. родившиеся в текущем году и вновь посту пившие в хозяйство. Молодые животные, переболевшие острой и хронической формами ИКК. резистентны к повторному заражению в старшем возрасте [4. 8. 9]. Следовательно, у переболевших животных формируется иммунитет, который предотвращает рсинфскции или обу словливает, по меньшей мерс, легкую форму болезни.

4. ПАТОГЕНЕЗ

Бактерии Moraxella bovis и Moraxella bovoculi проникают через эпителий конъюнктивы и вызывают серозно-катаразьный воспалительный процесс, который быстро переходит на поверхность роговицы. Нарушение целостности эпителиальных клеток создает условия для вторичной инфекции, вызванной гноеродными и другими микроорганизмами. Интенсивность развития инфекционного процесса среди скота, находящегося на пастбище и открытых вы-гулах, зависит от степени облучения животных экстремальным потоком солнечных УФ-лучсй: чем она больше, тем тяжелее протекает •заболевание. При этом УФ-лучи, очевидно, предрасполагают конъюнктиву и сетчатку глаза для внедрения и размножения возбудителя ИКК - бактерий Moraxella bovis (рис. 5).

Пили (фимбрии), внешние мембранные белки, липополисахари-

13

ды (ЛПС). капсула являются важными факторами вирулентности бактерий Moraxella bovis.

Клеточная стенка Moraxella bovis - типичная для грамотрица-тельных бактерий, состоит из липополисахаридов и белков. Являясь микробными эндотоксинами, липополисахарид Moraxella bovis представляет собой один из ключевых факторов патогенеза инфекций. Липополисахариды распознаются клетками адаптивного иммунитета (в первую очередь макрофагами) и вызывают сильный иммунный ответ с секрецией воспалительных цитокинов.

Определенную роль в патогенезе играет наличие капсул. Прежде всего - это противодействие механизмам фагоцитарной адгезии. Основные функции капсул в качестве фактора патогенности:

•    экранируют иммуноактивные структуры бактериальной клетки;

•    вещества, входящие в состав капсулы, обладают, как правило, сильными гидрофильными свойствами: чем гидрофильное обл>ект. тем труднее он поддается фагоцитозу. Таким образом, гидрофиль-ность. обусловленная капсулой, защищает бактерию от фагоцитоза;

•    капсула может защищать клетку возбудителя от токсических продуктов респираторного взрыва, гидролитических ферментов лизисом и гранул лейкоцитов.

Для успешной реализации инфекционного процесса очень важен, особенно на ранних стадиях, этап колонизации, при котором происходит прикрепление возбудителя к клеткам соответствующей ткани хозяина. За это отвечают специальные молекулы, которые располагаются на поверхности и способны специфически узнавать молекулы поверхности колонизируемых клеток и прикрепляться к ним. Обычно такое узнавание совершается по типу углевод-бел ко вое взаимодействие. Сущность этого процесса заключается в том. что белки (гликопротсины) способны специфически связывать определенные угле вод содержащие остатки (манозы. фруктозы и др.). Такие белки в составе определенных образований (фибрилл, фимбрий и др.) располагаются на поверхности возбудителя и выступают в качестве лигандов. Так. на поверхности моракселл в течение первых 20 ч культивирования видны тонкие нитевидные структуры - фим-брии (пили). Они позволяют бактерии прикрепляться к эпителиальным клеткам и препятствуют ее захват) нейтрофилами.

Пили бактерий Moraxella bovis - это нитевидные белковые образования (6,5 нм в толщину и 8,5 нм в длину), которые словно бахромой покрывают поверхность бактерий. Располагаются псрстрихи-ально. Иногда короткие участки этих структур переплетаются. Часто рядом с клеткой можно обнаружить отдельные пили, что подтверждает их недолговечность.

Получено немало данных, указывающих на участие гемолизина данного микроорганизма в развитии заболевания. Наряд) с фимбри-ями. которые необходимы для прикрепления, патогенность бактерий Moraxella bovis во многом зависит от продуцируемого ими гемолизина. Гемолизин Moraxella bovis - это термолабильный белок, вырабатываемый бактериями в течение логарифмической фазы роста. В основном он связан с клеткой, но при определенных условиях культивирования может высвобождаться как экзотоксин.

Функционирует гемолизин посредством вставки в плазматическую мембран) хозяина и формирует в ней поры, изменяющие проницаемость мембраны, что приводит в итоге к осмотическом) лизису клетки. Образовавшиеся поры обеспечивают маленьким молекулам и ионам двухстороннее движение, что в конечном итоге приводит клетку к вздутию и гибели от осмотического шока.

15

УДК 619:617.711-002.1-022:636.22/.28 ББК 48.73:46.0 М 54

Авторы:

Г.Н. О три. (опок. ив. лаб. бактерийных инфекций, д-рбиол. наук;

Х.З. Гаффаров, ш. науч. сотр. лаб. вирусологии и хламидийных инфекций, д-р вет. наук, проф.; А.И. Ники i ни. директор, канд. вет. наук,

К.Х. Папунидн, зам. директора, д-р вет. наук, проф.;

Л. В. Валенная, ст. нау ч. сотр. лаб. бактерийных инфекций, канд. биол. нау к; А.Н. Чернов, зам. директора, д-р биол. наук; Л.Ш. Дун.лева, ст. науч. сотр. лаб. бактерийных инфекций, канд. биол. наук; А.Г. Спиридонов, сг. науч. сотр. лаб. бактерийных инфекций, канд. биол. нау к;

Х.Н. Макаев, зав. отд. биобезопасности, д-р вет. наук, проф.

Рецензенты:

А.К. Галиуллин, зав. каф. микробиологии и виру сологии Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана, д-р вет. наук, проф.; Р.А. Хамзин, директор ассоциации ветеринарных врачей Респу блики Татарстан, д-р вет. наук Ответственный за выпуск:

В.Н. Боровой, заместитель директора Депветеринарии Минсельхоза России

Методические рекомендации по диагностике, лечению и спсцнфнчс-^ ^ ской профилактике инфекционною кератоконъюнктивита крупною рогатого скол а, вызванною бактериями Moruxella bovis и Moraxella bovoculi - М.: ФГБНУ «Росиформагротех», 2017. - 36 с.

ISBN 978-5-7367-1205-2

Представлена система специальных протавоэпизоотических мероприятий но профилактике инфекционного керато конъюнктив ига крупного рогатого скота и оздоровлению от него стад, ферм, хозяйств, населенных пунктов и административных территорий с применением специальных средств и методов диагностики и профилактики болезни.

Рекомендации предназначены для специалистов государственной ветеринарной слу жбы субъектов Российской Федерации, ветеринарных лабораторий, научных сотрудников, специализирующихся в области инфекционной патологии, студентов и слушателей курсов повышения квалификации.

Рекомендовано к изданию секцией ветеринарии Научно-технического совета Минсельхоза России (протокол № 17 от 19 октября 2016 г.).

УДК 619:617.711-002.1-022:636.22/.28 ББК 48.73:46.0 О Минсельхоз России. 2017

СОДЕРЖАНИЕ

Введение.............................................................................................4

1.    Общие сведения о болезни............................................................5

2.    Этиология.......................................................................................5

3.    Эпизоотология................................................................................12

4.    Патогенез........................................................................................13

5.    Клинические признаки..................................................................16

6.    Диагноз............................................................................................20

7.    Лечение инфекционного ксратоконъюнктивита. вызываемого бактериями Moraxella bovis и Moraxella

bovoculi.................................................................................................27

8.    Профилактика инфекционного ксратоконъюнктивита. вызываемого бактериями Moraxella bovis и Moraxella bovoculi .. 28

9.    Литература......................................................................................32

3

ВВЕДЕНИЕ

Успехи в борьбе с инфекционными заболеваниями сельскохозяйственных животных несомненны - наука вооружила практик) многочисленными новыми методами диагностики, средствами борьбы и эффективными специфическими препаратами. Ряд инфекционных болезней уже полностью ликвидированы, другие - утратили былое значение. Однако появляются болезни, значение которых все более возрастает, а ущерб, причиняемый ими. постоянно увеличивается. К одной из таких болезней относится инфекционный кератоконъ-юнктивит (ИКК). зарегистрированный во многих странах мира как выскоконтагиозное заболевание глаз крупного рогатого скота |4, 7, 19). В недалеком прошлом возбудителем болезней глаз крупного рогатого скота одни исследователи считали бактерии Moraxella bovis, другие - риккетсии, хламидии, герпесвирусы. а также нематоды из рода Thelazia.

В России первые сообщения об эпизоотических вспышках инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота, имевших место в хозяйствах Гомельской области и Северо-Западной зоне РСФСР, появились в 1970-1980-е годы [1, 2, 3|. Однако авторами были описаны лишь клинико-эпизоотологичсскис особенности, в них нс были представлены данные по выделению, идентификации возбудителя, т.е. отсутствовали доказательства его этиологической роли в возникновении болезни.

Разноречивость взглядов среди исследователей в отношении этиологии болезни. отс\тствис методов и средств диагностики и специфической профилактики ИКК. завоз племенного поголовья крупного рогатого скота из стран Западной Европы - возможного носителя возбудителя, перемещение инфицированного скота из одного хозяйства в другие привели к появлению в отдельных регионах Российской Федерации стационарно неблагополучных очагов и сохранению тенденции дальнейшего распространения этой болезни.

4

1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О БОЛЕЗНИ

Инфекционный кератоконъюнктивит (ИКК) или «pink еуе» (розовый глаз) - острое контагиозное заболевание, характеризующееся слезотечением, гиперемией сосудов конъюнктивы, светобоязнью, серозно-гнойным истечением, помутнением и изъязвлением роговицы. деформацией глазного яблока в виде ксратоглобуса или кера-токонуса, частичной или полной потерей зрения пораженного глаза животного |4, 111

Болезнь поражает крупный рогатый скот всех возрастов и пород, по некоторым данным лошадей, овец, свиней и собак, имевших контакт с больными животными, но у них болезнь проявляется спорадически. Заболевание имеет тенденцию широкого распространения в крупных животноводческих комплексах с высокой концентрацией и плотностью поголовья животных и причиняет таким хозяйствам большой экономический ущерб из-за выбраковки животных, потерь племенной ценности, снижения удоев и прироста массы тела, иногда падежа, а также высоких затрат на проведение лечебных и оздоровительных мероприятий.

2. ЭТИОЛОГИЯ

Причиной инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота является сочетание физического фактора и биологического возбудителя. Ведущая роль при его возникновении принадлежит гемолитическим бактериям Moraxella bovis и Moraxella bovoculi, относящимся к роду Moraxella, семейств) Moraxe/laceae, на фоне солнечного ультрафиолетового облучения или других возможных предрасполагающих факторов. В качестве сопутствующей микрофлоры часто встречаются р-гемолитические стрептококки, стафилококки, осложняющие инфекционный процесс. На течение болезни как у отдельных животных, так и у всего поголовья неблагополучного стада влияют недостаток витамина А. интенсивное УФ-облучснис (солнечный свет), пыль и высокая трава на пастбище, травмирующая глаза. Возбудитель выделяет эндотоксин, который при попадании в роговиц) глаза вызывает типичные для кератоконъюнктивита изменения.

Согласно определителю бактерий Берджи (1984) род Moraxella, предложенный LwofF (1939). относился к семейству Neisseriaceae. Однако с современных позиций таксономии, на основе изучения 16S рРНК и анализа рРНК-ДНК гибридизации, в настоящее время род Moraxella отнесён к семейству Moraxellaceae. Известно 20 представителей этого рода, большинство которых связаны с болезнями человека. Относительно недавно признанный новый вид-Moraxella bovoculi был выделен при ИКК у молочных коров калифорнийскими учеными |15]. Вероятно, бактерии Moraxella bovoculi существовали в популяции крупного рогатого скота в течение долгого времени. Все грамотрицатсльныс кокки, выделяемые ранее от крупного рогатого скота при ИКК. которые определяли как «Moraxella ovis», фактически являлись Moraxella bovoculi. Благодаря современным методам молекулярного анализа удалось различить Moraxella ovis и Moraxella bovoculi (табл. 1).

Таблица 1 Вилы Moraxella, выделенные от животных

Вид Резервуар Moraxella bovis Больной или переболевший инфекционным кс-ратоконъюнктивитом крупный рогатый скот Moraxella bovoculi Больной или переболевший инфекционным кс-ратоконъюнктивитом кру пный рогатый скот Moraxella ovis Больные конъюнктивитом овцы Moraxella oblonga Ротовая полость овец Moraxella can is Здоровые собаки и кошки Moraxella boevrei Носовой проход здоровых коз Moraxella caprae Носовой проход здоровых коз Moraxella ca\>iae Зев здоровых морских свинок Moraxella cuniculi Носоглотка кролика Moraxella equi Больные конъюнктивитом лошади

На кровяном агаре бактерии Moraxella bovis через 20-24 ч культивирования формируют рассеянные колонии диаметром до 1 мм с зоной Р-гемолиза шириной 0,5-1 мм (рис. 1). Колонии круглые, выпуклые в центре, блестящие, полу прозрачные, серовато-белые, слегка вросшие в среду [11, 14|.

6

Рис. 1. Колонии бактерий Moraxella bovis после 24-часовой инкубации на кровяном агаре с зоной р-гемолиза

На триптозо-соевом бульоне через 48-72 ч инкубации при 37°С наблюдается скудный рост, который по мере старения становится слегка мутноватый, но образуется осадок, который при взбалтывании разрушается на грубые частицы. При инкубации в условиях реактора бульон становится мутнее через 24 ч с образованием небольшого количества осадка. В дальнейшем рост усиливается при добавлении в 5%-ном объеме сыворотки кролика или крупного рогатого скота.

На мясопсптонном агаре бактерии Moraxella bovis формиру ют два типа колоний. Колонии R-типа обычно преобладают у свсжевы-деленных культур, они имеют шероховату ю поверхность и неровный край, отчетливу ю зону Р-гемолиза. При переносе колонии на ее месте остается небольшое у глубление, обусловленное разжижением среды. При последу ющих субкультивированиях, после четырех-пяти пассажей на иску сственных питательных средах, наблюдается уменьшение колоний в диаметре до 0.5-0.8 мм («карликовые колонии»). Спонтанная диссоциация происходит даже при оптимальных условиях инкубирования.

Бактерии Moraxella bovis - это короткие толстые грамотрицатсль-ные палочки (1.0-1.5 х 1.5-2,5 мкм) с округленными концами, чаще расположены парами или в виде коротких цепочек (рис. 2). Характерен полиморфизм. Клетки свежевыдсленных культур бактерий мо-

7

гут быть окружены капсулой. Неподвижны, но благодаря наличию полярных фимбрий (пилий) на плотных средах для бактерии характерно движение рывками, так называемая «дёргающаяся» подвижность.

Рис. 2. 24-часовая культура бактерии MoraxeUa bovis, выделенная от крупного рогатого скота больного ИКК (окраска по Грому) х 320

Биохимическая активность у бактерий Moraxella bovis слабо выражена. что создаст трудности при идентификации. Они нс ферментируют сахаров, нс восстанавливают нитраты, нс образуют индола из триптофана разжижают желатин, т.с. обладают протеолитической активностью, на оксидазную пробу дают положительный результат. При 24-часовой инкубации в лакмусовом молоке образуют темную синюю полосу в верхней части пробирки, а при дальнейшей инкубации среда прогрессивно становится более щелочной. В течение шести дней появляются отчетливо выраженные три зоны: в верхней части - темно-синяя жидкость, средняя зона - лилового цвета. творожистая по консистенции, а нижний слой - коагу лированный казеин бледно-лилового цвета.

Долгое время считали, что возбудителем ИКК бактериальной этиологии являются только Moraxella bovis. Однако нс всегда применение вакцин на основе антигенов данных бактерий было эффективно. Предполагалось, что это связано с тем, что есть другие бактерии, причастные к возникновению ИКК.

8

Летом 2002 г., проводя испытания эффективности антибиотиков на быках и молочных телках в Северной Калифорнии. Angelos J.A. от телят трех-девятимесячного возраста с признаками изъязвления роговицы глаз выделил гемолитические грамотрицатсльные кокки 115, 16]. Чтобы определить, связаны ли гемолитические грамотрицатсльные кокки с известными представителями рода Moraxella. были проведены довольно обширные бактериологические, биохимические тесты и молскулярно-гснстичсскис анализы. Исследование последовательности 16S рРНК и филогенетические анализы позволили отнести их в группу, объединяющую Moraxellci bovis и Moraxella ovis. Процент гомологии между выделенными грамотрицательными кокками и бактериями Moraxella bovis и Moraxella ovis был высок - 96%. Angelos J.A. с соавторами предложили отнести их к новому виду Moraxella bovoculi, номенклатура которого опубликована 5 апреля 2005 г.

Инфекционный кератоконъюнктивит крупного рогатого скота, вызванный бактериями Moraxella bovoculi, наблюдали в одном из молочных комплексов Республики Татарстан. Клинические признаки болезни были схожи с таковыми при поражении с бактериями Moraxella bovis. При бактериологическом исследовании смыва из конъюнктивального мешка глаза семимесячного больного теленка с признаками острого кератоконъюнктивита выделены гемолитические изоляты бактерий, идентифицированные в дальнейшем как бактерии Moraxella bovoculi. Результаты изучения морфологических, культурально-биохимических, серологических и биологических свойств выделенного штамма позволили депонировать его во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов. используемых в ветеринарии и животноводстве (Россия. 123022, Москва. Звенигородское шоссе. 5, ФГБУ «ВГНКИ») под регистрационным номером: «Штамм Moraxella bovoculi «СХ-Ч6 №-ДЕП» инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота». Предварительно была определена нуклеотидная последовательность фрагмента 16S рРНК штамма (с 246 по 1121 п.н. по полной нуклеотидной последовательности данного гена). С помощью программы Blast был проведен сравнительный анализ нуклеотид-