Купить Методические рекомендации — бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее
Цена на этот документ пока неизвестна. Нажмите кнопку "Купить" и сделайте заказ, и мы пришлем вам цену.
Распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль"
Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.
Методические рекомендации предназначены для вирусологических лабораторий центров госсанэпиднадзора и научно-исследовательских институтов
Введение
1. Методы лабораторной диагностики с ипользованием клеточных культур
1. Выделение вируса
2. Метод иммунофлюоресценции (ИФ)
2. Характеристика клеточных культур, рекомендуемых для использования
1. Первично-трипсинизированные культуры
2. Характеристика диплоидных клеточных штаммов, рекомендуемых для работы с ВПГ и ЦМВ
3. Перевиваемые культуры клеток
Заключение
Дата введения | 01.01.2021 |
---|---|
Добавлен в базу | 01.01.2019 |
Актуализация | 01.01.2021 |
28.11.1994 | Утвержден | Заместитель Председателя Госкомсанэпиднадзора РФ |
---|---|---|
Разработан | Екатеринбургский научно-исследовательский институт вирусных инфекций |
Чтобы бесплатно скачать этот документ в формате PDF, поддержите наш сайт и нажмите кнопку:
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ САНШРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
"УТВЕРЖДАЮ"
Заместитель Председателя Госкомсаиэпидиадзора РФ
Г.Г.Онищенко
" 28 " ноября 1994- г.
ШТОЧЕШЕ' КУЛЬТУРУ В ДИАГНОСТИКЕ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ, ШЗЫВАЕШК ВИРУСАМИ ГРУППЫ ГЕРПЕСА
Методические рекомендации
Екатеринбург, 1995 г,
Методические рекомендации разработаны в Екатеринбургском НИИ вирусных инфекций, рассмотрены и одобрены Ученым Советом института.
Авторы-составители: Г.Г.Колесникова, В.К.Саяуинсина, В.П.Устьянцев, А.А.Бахарев, Н.А.Шмелвиа, АЛЬПориваева,
11. П. Глинских
Настоящие методические рекомендации предназначены для вирусологических лабораторий центров госсанэпиднадзора и научно-исследовательских институтов.
Екатеринбургский научно-исследовательский институт вирусных инфекций,
Чувствительность к ЦМВ лолуперевиваемшс штаммов клеточных культур
Таблица 4 | ||||||||||||||||||||||||||||
| ||||||||||||||||||||||||||||
3. Перевиваемые культуры клеток» |
Культура клеток RB.
Получена из рабдосаркомы таза 7-летней девочки в 1968 г*
В ЕНИИВИ поступила из ВСКК (Институт цитологии РАН)* В лаборатории прошла более 20 пассажей. Культура состоит из веретено-видных, полигональных и крупных многоядерных клеток. Ядра овальные, ядрышки мелкие, многочисленные. Цитоплазма светлая, мелкозернистая, границы клеток выражены нечетко.
Доза посадки:
- на пробирки - 100 тыс.кл./мл.;
- на матрасы - 50-70 тыс.кл./мл.
Клетки снимают со стекла смесью версен-трипсин в соотношении 3:1,
Среда культивирования: омесь сред 199 и Игла в равных пропорциях с добавлением IC# эмбриональной сыворотки коров.
Культура чувствительна к ВПГ - инфекционные титры до 6,0 1$ ШД^о/мл и к ЦМВ - инфекционный титр до 5,0 lg ВД^д/мл.
Культура клеток RH,
Получена из ткани почки эмбриона человека, В ЕНИИВИ поступила в 1969 году из МКИИВП; в лаборатории прошла более 100 пассажей, Клетки однородные, полигональные, границы четко выражены. Монослой плотный.
Доза посадки:
- на пробирки - 100 тыс.юг,/мл;
- на матрасы - 40-50 тыс.кл./мл.
Среда культивирования: о ре да 199 о 7-1 (Й сыворотки КРС, беэ антибиотиков.
II
Кратность прироста 5-6 - на 4-е сутки.
Культура чувствительна к В1ГГ типа 2: титр - до 4,0 lg
мл.
Культура клеток Уего .
Получена из почечной ткани африканской зеленой мартышки. В ЕНИИВИ получена в 1983 году из ВСКК (Институт цитологии РАН); в лаборатории прошла Солее 20 пассажей. Фибробластоподобные клетки о мелкозернистой цитоплазмой. В ходе роста возможно образование трехмерных структур.
Доза посадки:
-на пробирки - 100 тыо.кл./мл;
-на матрасы - 50 тыо.кл./мл.
Кратность прироста 5-7 на пятые сутки.
Среда культивирования: среда 199 с Ь% КРС, без антибиотиков.
Культура чувствительна к ВПГ - титр 6,5-7,0 lg ТЦД^/мл, к IWB - титр до 2,0-3,0 lg TLUI^q/мл.
Культура клеток CPU.
Получена из тканей сердца обезьяны циномольгус. В ЕНИИВИ получена в 1970 году. К моменту исследования прошла более 100 пассажей. Клетки вытянутой формы с четкой структурой.
Доза поездки:
- на пробирки - I00-120 тыс.кл./мл;
- на матрасы - 50-70 тыс.кл./мл.
Кратность прироста - 4-5 на 5 сутки роста.
Среда культивирования: смесь сред 199 и Игла в ранних объемах с добавленном 102 сыворотки КРС и антибиотиков по общепринятой схеме. Культура чувствительна к ВПГ - инфекционный титр до 4,5 1 g ТиДп q/ мл .
Культуш клеток Toyрус-1.
Перевиваемый штамм гетероплоидных клеток почки теленка получен во ВНИИ гриппа РАШ в 1992 г. До начала опытов культура прошла в лаборатории ЕНИИВИ 8 пассажей.
Монослой полигональных клеток с четкой архитектоникой. Цитоплазма мелкозернистая, светлая. Ядра округлые, содержащие 2-4 ядрышка.
Доза поездки:
- на пробирки - 45Q-5Q0 тыо.кл./мл;
- на матрасы - 250-300 тыс.кл./мл.
Кратность прироста на 5-7 сутки - 2, митотический индекс
12
на 3 сутки - 23-25#о.
Среда культивирования* среда Игла МЕМ - 90#,сыворотка КРС -10#.Антибиотики - по общепринятой схеме.
Клетки снимают со отекла смесью раствора химопсина и 0,02# раотвора вврсена в соотношении I флакон химопсина на 0,4 литра вароена.
Клетки чувствительны к ВПГ - титр до 4,5-5,0 lg ТЦД^о/мл и к UMB - титр до 5,0-5,б ig ТЦД^о/мд.
В таблицах 5 и 6 представлены данные по исследованию чувот~ вательнооти перечисленных выше клеточных культур к Ш1Г и ЩАВ,
Таблица 5
Чувствительность к ВПГ перевиваемых культур клеток
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
13 |
Проведенные исследования по анализу чувствительности клеточных культур низкотемпературного банка - тдузея ЕНИИВИ к ВИГ и ЦМЗ позволяют рекомендовать культуры клеток, описанные в настоящих рекомендациях, для лабораторной диагностики герпетической и цитомегаловирусной инфекций.
Шея отработанный в точение ряда лет опыт транспортировки клеточных культур на дальние расстояния, Екатеринбургский КИИВИ может обеспечить регулярное снабжение необходимыми культурами практических вирусологических лабораторий Госкомсаиэпиднадзора и Мицздравмедпрома Российской Федерации, что позволит в известной степени упростить и стандартизировать работу по дифференциальной диагностике заболеваний, вызываемых вирусами группы герпеса.
14
Отрывной лист учета эффективности использования методических рекомендаций
Направить в отделение планирования и внедрения Екатеринбургского НИИ вирусных инфекций (620030, г.Екатеринбург, ул.Летняя,23)
1. Методические рекомендации: иКлеточные культуры в диагностике вирусных инфекций, вызываемых вирусами группы герпеса”
2. Заместителем Председателя IK ОЭН РФ Онищенко Г»Г. 26Л1.94г.
3,
{кем и когда утвержден)
(кем и когда получен)
4. Количество центров госсанэпиднадзора в лечебно-профилактичес
ких учреждений, которые внедрили методы, предложенные документом __
5. Формы внедрения (семинары, подготовка и переподготовка специалистов, сообщения и пр.) и результаты применения методов (количество наблюдений за 1 год и эффективность)
Подпись
6. Замечания и пожелания
(должность, лица, заподаизшвго карту)
КЛЕТОЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ В ДИАПЮСТИКЕ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ, ВЫЗЫВАЕМЫХ ВИРУСАМИ ГРЛШЫ ГЕРПЕСА
Методические рекомендации
Лицензия на издательскую деятельность ЛР № 020672 7 декабря 1992 г.
ПОДПИСАНО К ПЕЧАТИ 29.08.95 г. ФОРМАТ 60 X 84 I/I6 О БЬЕМ 0,94 ПЕЧ.Л. ТИРАЖ 150 экз. ЗАКАЗ 811
Цех й 4 АО "Полиграфист", 620219 Екатеринбург.ул.Тургенева,20
ВВЕДЕНИЕ
Лабораторная диагностика герпесвирусных инфекций с использованием легочных культур - это один из основных методов в практической работе, так как морфологические изменения, выявляемые в зараженных культурах, являются специфическими.
Одни штаммы вирусов герпеса вызывают образование гигантских синцитиальных клеток, другие - округление и образование клеточных конгломератов. Очаги щттопатичеоксго действия вирусов проявляются в вило гладких округлых клеток, значительно увеличенных в размера. Спектр клеточных культур, используемых для изучения вирусов группы герпеса, по данным литературы, достаточно обширен. Широко применяются как первично-трипсйниаироьаннне культуры, подученные из различных органов и тканей человека и животных, так я перевиваемые линии клеток - СПЭБ, СОЦ, D-6, Не La и другие.
Для диагностики цитомегаловирусной инфекции (ЦМВ), в основном, используются первичные и диплоидные культуры клеток человеческого происхождения, а перевиваемые клеточные линей, по данным литературы, малочувствительны и для накопления вирусного антигена непригодны, что побуждает исследователей проводить постоянный поиск новых культур.
С целью отбора наиболее оптимальных клеточных культур для накопления герпесвируоов были изучены клеточные линии и штаммы коллекции низкотемпературного банка-музея Екатеринбургского НИИ вирусных инфекций.
Настоящие методические рекомендации обобщат данные литературы и собственный опыт по использованию клеточных культур в лабораторной диагностике инфекций, вызываемых вирусами группы герпеса. Описаны методы выделения вирусов простого герпеса и ци~ томегаловкруса, а также прямой и непрямой иммунофшфесцеитной микроскопии для их индикации в клеточной культуре.
3
I* Методы лабораторной диагностики о использованием клеточных культур
Для выделения вируса простого герпеса (ВГСГ) используют первичные культуры фиброблаотов эмбриона человека (ФЭЧ), диплоидные клетки легкого эмбриона человека (ЛЭЧ)Р перевиваемые клетки почки зеленой мартышки ( Vero), Для изоляции цитомегаловнруоа пригодны культуры ФЭЧ, ЛЭЧ и перевиваемые клетки RD.
Для работы обычно используют 36-48-часовую клеточную культуру с полностью сформированным моноолоем. Конкротные сведения по культивированию и контролю качества клеток для вирусологических исследований изложены в "Методических рекомендациях по стандартизации работы о клеточными культурами для вирусологических исследований" (Свердловск, 1990 г.).
Перед заражением лмвают среду роста, монослой клеток промывают подогретым до 37°С раствором Хенкса или средой поддержания. В каждую пробирку вносят по 0,1 мл исследуемого материала в разведении 1:10 и оставляют его на 60 мин при 37°С для контакта с клетками, после чего сливают, а в пробирки вносят среду поддержания и помещают их в термостат. Наблюдение за клетками ведут ежесуточно, до наступления дегенерации в контрольной культуре. Наибольший интерес представляют клетки, в которых цитопатичео-кое действие (ЦПД) проявляется на 3-5 сутки с момента заражения.
Для приготовления антигена вирус вносят с множественностью заражения 0,01-1,0 TIU^qAui* Через 4-6 часов поело заряжения происходит набухание ядер и ядрышек клеток, а через 24 часа отмечается нарушение структуры монослоя и перераспределение хроматина ядер. В отдельных клетках образуются включения. ЦПД проявляется через 24-48 часов о момента заражения, монослой разрушается, Клетки в процессе дегенерации располагаются отдельными группами, формируя небольшие симлласты. Вирус простого герпеса вызывает маргиналию хроматина ядер и фрагментацию ядрышек, разрежение и лизис цитоплазмы клеток. Через 72 часа на стекле остаются лишь отдельные клетки с поздней стадией дегенерации.
Репликативный цикл ЩШ длительнее, чем ВПГ. При внесении вируссодержащего материала изменения монослоя наблюдаются через 72-96 часов и выражаются в появлении гигантских клеток шарооб-
4
разной формы с типичными эозинофильными включениями, занимающими значительную часть ядра. Ядерные включения окружены светлым ободком, что придает клетке вид "птичьего глаза". Формы таких иш1томогадов" различны: округлые, овально-вытянутые, яйцеобразные, что связано со скоростью размножения вируса. Через 96 часов внутриядерные включения вакуолизируются и распадаются, начинается клеточная деструкция.
Ясродко для выделения инфекционного вируса необходимо проведение хотя бы одного-двух "слепых" пассажей вируса в культуре, прежде чем инфекционная активность порсистирующего вируса проявится в виде типичного цигопатического действия.
2. Метод тллунофлюоресиетт! П4Ф).
Этот метод является одним из экспрессных методов лабораторной диагностики, обладающий рядом преимуществ: достаточно прост, позволяет сократить сроки исследования в 3-5 раз, пс сравнению с общепринятым. По чувствительности и специфичности не уступает другим.
Иглмунофлюоресцентный метод используется в следующих основных вариантах: прямой, непрямой, непрямой метод с добавлением комплемента и "интенсивный" метод флюоресцирующих антител (вариант непрямого метода). Чаще всего применяют первые два варианта.
Прямой метод ш^/тюиЧкюоресценпии. Реакцию иммунофлюоресценции ставят по методу Кунса. Приготовление "клеточных" тест-препаратов осуществляют следующим образом: культуру клеток разливают по I мл в пробирки с покровными стеклам1! и инкубируют при 37°0. После формирования монослоя клетки промываю? дважды стерильным раствором Хенкоа и заражают вируссодэржащш материалом в объеме ОД мл в разведении 1:10 или вирусами БПГ и ЦМВ в дозе 0,01-1,0 ТЦД^о/кл. Через 24 часа инкубирования при 37°С стекла извлекают, ополаскивают в физиологическом растворе, подсушивают, фиксируют охлажденным ацетоном в течение 10 минут и монтируют на предметном отекло с помощью лейкопластыря*
Приготовленные таким образом тост-препараты используют как для прямого, так и непрямого вариантов ИФ. В первом случае непосредственно на тест-препараты наносят люминооцирущие иммуноглобулины к БПГ,или ЦМВ в рабочем разведении, указанном на этикетке, помотают и>: во влажную камеру л выдергивают при 37сС
30 кинут, затек дважды по 10 кинут промывают охлажденным забу~ фореиным физиологическим раотвором (pH 7,2-7,4), ополаскивают дистиллированной водой и подсушивают.
При непрямом варианте вначале наносят и соле дуемую сыворотку, а на втором этапе используют ФИТЦ - конъюгаты против иммуноглобулинов человека или животных, выпускаемые Институтом эпидемиологии и микробиологии мм.Н.Ф.Гамалеи РАМН.
Окрашенные препараты просматривают в люминесцентном микроокопе "Люмам" (фильтры ФС-2, СЗС-7, BB-I5, запирающий №2, объектив Мйх90, окуляр х4), используя масляную (диметилфталат) или водную иммерсию - объектив ВИх70. Интенсивность флюоресценции в препаратах оценивают по общепринятой четырехкреотовой шкале:
4 - (++++) - сияющая флюоресценция включений;
3 - (+++) - яркая флюоресценция включений;
2 - (++) - отчетливая флюоресценция включений меньшой яркости;
I - (+) - слабая, неотчетливая флюоресценция.
При оценке результатов учитывают лишь клетки с сохраненной структурой (ясно различимыми ядром и цитоплазмой) и отчетливой желтовато-зеленой специфической флуоресценцией в виде гранулярных включений в ядре или диффузным свечением цитоплазмы на 2+-. При отрицательном результате наблюдается слабое желтоватое (фоновое) свечение на 1+ и менее.
П. Характеристика клеточных культур, рекошндуемых для использования
I, Певвично-трипсинизированные культуры.
Первично-трипсинизированные культуры являются доступным суб-отратом для выделения и накопления ВПГ и ПМВ,
В таблице I и 2 представлены результаты оценки чувствительности этих культур к указанным вирусам с помощью метода имкуно-флюоресценции.
6
Таблица I
Чувствительность к ВПГ первично-трипсинизирова?шшс культур клеток человеческого и животного происхождения
Клеточная культура |
Время проявления 1ШЛ , (час) |
Титр вируса ( Шзд, ад) |
Выявление ] антигена в |
вирусного Кратность ИФ(час) пассиро- | ||
12 |
24 |
48 | ||||
I |
2 |
3 |
4 |
, Ь |
6 |
7 |
| |||||||||||||||||||||||||||||||||
ЛЭО-клотки легкого эмбриона овцы 48 2,0-2,5 |
+ |
++ Я |
-н-ь+ я ц |
I пассаж |
+ |
я |
+++ я ц |
4 пассажа |
-н- |
++ |
2-3 пас | |
+ |
я |
я ц |
сажа |
+ f |
++ |
3-4 пас | |
+ |
я |
я ц |
сажа |
++ я |
++■+■ Я ц |
2 пассажа | |
4*+ я ц |
-Н-+ |
2 пассажа |
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
3 пассажа |
Обозначение: участки локализации свечения -ц - цитоплазма, я - ядро.
Чувствительность к ЦМВ лервично-тридсшкзирсванных культур
Таблица 2 | |||||||||||||||||||||
|
2. Характеристика диплоидных клеточных штаммов, рекомендуемых для работы с HUT и ИМВ.
Штамм 1130-83 (а.с. 1304403 от 15,12.86).
Штамм лодулеревиваемых клеток почки эмбриона овца (13ЭО-83) подучен в лаборатории клеточных культур ЕНШШ1,ко времени проведения опытов прошел более 50 пассажей. Цитопатяческях агентов в клетках не выявлено. Культура представлена полигональными клетками крупного размера, с выраженными границами и мелкозернистой цитоплазмой. Кратность прироста на 4-5 сутки роста - 5-6 раз, митотический индекс на 3 сутки роста - ЗСМС
Доза посадки:
- на пробирки - 90—100 тыс*кл./мл;
- на матрасы - 50-60 тыс.кл./мл.
Среда культивирования: смесь сред 199 и Игла в равных количествах, с добавлением 7% сыворотки крови КРС, Антибиотики: пе-ншцшгш, стрептомицин в дозе соответственно ТОО и 50 £д/мл. (Снятие клеток со стекла проводят 0,02# раствором вероеиа.
При заражении клеток 1130-33 в дозе P,0I-£,0 TUH^q/ios. специфические включения выявлялись в ядре и цитоплазме через 72 часа. Тите вируса составляет до 5,0 lg гн1г^г/м?.
Штамм Гн{К-8€ (о.с, &4459837,^3 О-13 от Ol.Ofi.6K) .
Штамм полу порогиььэмнх клоток новорожденного кролика иоду-
чон в лаборатории клеточных культур ЕНИИВИ. Культура представляет собой плотный монослой полигональных клеток о выраженной структурой. Цитоплазма клеток светлая, с мелкой эернитостью. Яд-ра округлой формы, содержит 2-6 ядрышек* Кратность прироста на 3-4 сутки - 4,5-5,0 раз. Митотическая активность на третьи сутки роста - 30-34*#.
Доза посадки: на матрасы - 60-80 тыс.кл./мл; на пробирки -I00-120 тыо.кл./мл.
Среда культивирования! смесь равных объемов сред 199 и Игла с добавлением сыворотки КРС - I0SJ. Антибиотики: пенициллин, стрептомицин в дозе соответственно 100 а 50 Ед/мл.
ВПГ штамм Л-2 размножается в клетках, вызывая дегенерацию при первичном заражении через 48 часов, а при пассировании-через 24 часа после заражения. Титр инфекционной активности вируса составляет до 3,0-4,0 lg ТЦД^о/мл*
При иммунофшоорвецентном анализе клеток ПНК-86 через 24 часа после заражения антиген вируса определяется в 5C# клеток*
Штамм ПВО-88 - полупорэвиваемые клетки почки взрослой зеленой мартипки*
Подучен в лаборатории клеточных культур ЕНИИВИ и прошел болев 50 пассажей* Культура формирует монослой полигональных клеток с четкой структурой и мелкозернистой цитоплазмой* Ядра овальные, содержат 3-5 ядрышек.
Доза посадки:
- на пробирки - I0O-IIQ тыо.кл./мл;
- на матрасы - 50-60 тыо.кл./мл*
Кратность рассева 1:5-1:6. Монослой формируется на 3-4 сутки роста. Клетки снимают со стекла смесью вербен-трипсин в соотношении 1:1.
Среда культивирования: смесь равных объемов сред 199 и Игла с добавлением сыворотки КРС - Ъ%щ Антибиотики - по общепринятой схеме.
Культура чувствительна к НПГ:тзтр вируса 4,5-5,0 lg BU^q/w».
Штамм ФЛЭЧ - клетки Фибробластов легкого эмбриона человека,
Подучен в лабораторий клеточных культур ЕКИИВй из ткачи легкого 16-ти недельного эмбриона человека. Клеточная культура представляет собой молослой однородн'ых фибробласте л сдобных клеток, обладающих ориентированным ростом. Цитоплазма светлая, с легкой зернистостью. Ядра содержат от I дс 4 ядрышек.
2
Кариотип клеток соответствует клеткам человеческого происхождения, &?% клеток на 25 пассаже оохраняют диплоидный набор хромосом, относительное количество клеток о аберрациями не превышало 3,5-4#. Клоткп свободны от контаминирующих агентов, не обладают туморогенной активностью.
Доза посадки:
- на пробирки-400 тыс.кл./мл.;
- на матрасн-150-200 тыо.кл./мл.
Кратность прироста - 2,0-2,5 раза на 4-5 сутки роста. Митотическая активность на 4 сутки роста 18-20#*,
Среда культивирования: среда Игла с добавлением 10* сыворотки КРС. Антибиотики - пенициллин, стрептомицин по общепринятой схеме. Клетки снимают со стекла смесью растворов версена и трипсина в соотношении 1:1,
Культура чувствительна к ВПГ - титр до 6,0 ig ТПД^мл и ЦМВ - титр до 5,0 lg ниЦ^/мл,
В таблицах 3 и 4 представлены данные по чувствительности к ВПГ и ЦМВ полулеревиваемых клеточных культур.
Таблица 3
Чувствительность к ВПГ полуперевиваемых штаммов клеточных культур
Клеточная культура |
Время проявления ЦПД (чао) |
Титр ви- Я®Ь>- |
Выявление вирусного на в ИФ (час; |
антиге- | |
12 |
24 |
48 | |||
ПЭО-83 |
48 |
5,0 |
- |
4 |
4+ |
Я |
я Ц | ||||
ПИК-86 |
20-22 |
4,0 |
+ |
4+ |
44*4 |
Я |
Я Ц | ||||
ПВО-88 |
36-48 |
4,5-5,0 |
+ |
44 |
444 |
Я |
Я Ц | ||||
ФЛЭЧ |
20-22 |
4,5-6,0 |
+ |
4+ |
44-+ |
я |
Я Ц |
Я ц |