Товары в корзине: 0 шт Оформить заказ
Стр. 1 

9 страниц

Купить бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Цена на этот документ пока неизвестна. Нажмите кнопку "Купить" и сделайте заказ, и мы пришлем вам цену.

Распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль"

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

Способы доставки

  • Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
  • Курьерская доставка (7 дней)
  • Самовывоз из московского офиса
  • Почта РФ

 Скачать PDF

Оглавление

1. Принцип методики

2. Реактивы

3. Приборы, материалы и посуда

4. Подготовка реактивов

5. Ход определения

6. Техника безопасности

Стр. 1
стр. 1
Стр. 2
стр. 2
Стр. 3
стр. 3
Стр. 4
стр. 4
Стр. 5
стр. 5
Стр. 6
стр. 6
Стр. 7
стр. 7
Стр. 8
стр. 8
Стр. 9
стр. 9

нистров СССР по продовольствию и закупкам

ГОСУДАРСТВЕННАЯ КОМИССИЯ СОВЕТА МИНИСТРОВ СССР ПО ПРОДОВОЛЬСТВИЮ И ЗАКУПКАМ

Главное управление ветеринарии

УТВЕРЖДАЮ

Заместитель начальника Главного управления ветеринарии при Госу-дарственной комиссии Совета Ми-


107139. Москва Б-139. Орликов пер., 1/11

МЕТОДИКА

токсина В1 и стеригматоцистина в фуражном зерне


В.Н. Гущин


« 6 » декабря 1989 г.


1.    Принцип методики

I.I. Определение микотоксинов Т-2, Ф-2, афлатоксина В1 и стеригматоцистина в фуражном зерне основано на извлечении микотоксинов хлороформом, двукратной очистке экстракта от примесей жидкостножидкостным распределением в системе водный ацетон-гексан с двукратной переэкстракцией микотоксинов в хлороформ, дополнительной очистке экстракта хроматографией на колонке силикагеля, элюировании, примесей с колонки гексаном и смесью гексана с ацетоном (98:1) элюировании микотоксинов смесью хлороформа с ацетоном (9:1), хроматографирование концентрированных элюатов микотоксинов на пластинках '"Сшгуфол" и обнаружении микотоксинов на хроматограмме соответствующими реагентами.

2.    Реактивы

Бумага лабораторная фильтровальная, ГОСТ 12026-76 Алюминий хлористый, ГОСТ 3759-65, чда Ацетон, ТУ 6-09-3513-82, осч 9-5 (при использовании других марок ацетона его следует перегнать)

Вода дистиллированная, ГОСТ 6709-72 Гексан, ТУ 6-09-3375-68, ч.

Муравьиная кислота 85%-ная, ГОСТ 5848-73, чда Натрий сернокислый безводный, ГОСТ 4166-76, чда Натрий хлористый, ГОСТ 4233-77, хч или чда п-нитрофенилдиазония тетрафтороборат, прочный красный ЖК, стабилизированная соль.

Соляная кислота ГОСТ 3118-77, хч или чда Серная кислота, ГОСТ 4204-77, хч

Силикагель Л, 40-100 мкм, 100-250 мкм, ЧССР для хроматографии или силикагель марки "КСК”

Спирт этиловый ректификованный, ГОСТ 5962-67 Толуол, ГОСТ 5789-78, хч или чда Хлороформ для наркоза после перегонки Этилацетзт, ГОСТ 22300-76, хч или чда

Стандарты микотоксинов стеригматоцистина, Т-2, Ф-2 (рассылает УкрНИВИ, 252020, г. Киев, ул.Донецкая, 30)

Стандарт эфлатоксина Bj (рассылает ВНШВС, 123022, г. Москва, Звенигородское шоссе, 5).

3. Приборы, материалы и посуда.

Аппарат для встряхивания (шуттель-аппарат)

Баня водяная электрическая Вата гигроскопическая медицинская Весы аналитические лаоораторные

Весы лаоораторные общего назначения, ГОСТ 24104-80, класса точности 3 с наибольшим пределом взвешивания 500 г.

Источник ультрафиолетового света Мельница лабораторная Микрошприц на 10 мкл, МШ-Ю Фен электрический

Пластинки для тонкослойной хроматографии "Силуфол", КАУ ЧССР 15x15 см с люминесцентным индикатором Фильтры бумажные, ТУ 6-09-1678-77

Воронки делительные, вместимостью 50,100,150,300,500 мл Воронки химические разного диаметра

Колонки для хроматографирования 50x1,5 см (в качестве колонки можно использовать нижнюю часть бюретки вместимостью 100 мд)

Камера для тонкослойной хроматографии, вместимостью 2 л Чашки выпарительные, фарфоровые, диаметром 45,60,95,120 мм Колбы для отгона, вместимостью 25,50,100,250,500 мл Колбы плоскодонные с притертыми пробками, вместимостью 100,

250, 500 мл.

Роторный испаритель

Цилиндры мерные, вместимостью 50,100,250,500 мл.

4. Подготовка реактивов

4.1. 20%-ный раствор алюминия хлористого, приготовленный на 75%-ном этиловом спирте.

4.2.    20%-ный спиртовый раствор серной кислоты.

11,5 мл серной кислоты с удельной массой 1,84 небольшими порциями при осторожном перемешивании переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл с небольшим количеством этилового спирта (15-20 мл). После охлаждения к раствору в колбе при постоянном перемешивании добавляют до метки этиловый спирт. Раствор в колбе охлаждают при комнатной температуре и окончательно доводят спиртом до метки.

4.3.    I н раствор соляной кислоты. Готовят из фиксаналэ или раз-ведением концентрированной соляной кислоты с удельной массой 1,19.

Для этого 84 мл соляной кислоты отбирают в мерную колбу вместимостью I л и доводят дистиллированной водой до метки.

4.4.    0,05%-ный раствор красного прочного ЖЖ на 50%-ном этиловом спирте готовят перед использованием.

4.5.    Основные стандартные растворы микотоксинов Т-2, Ф-2, стерт мзтоцистина готовят растворением их аналитических стандартов в хлороформе с концентрациями 200, 200 и 2 мкг/мл соответственно, хранят npi температуре 5-7°С не более месяца, а раствор микотоксина Ф-2 не боле( двух недель. В качестве основного стандартного раствора афлатоксина Bj используют его аналитический препарат с концентрацией 10 мкг/мл.

4.6.    Стандартные растворы смеси микотоксинов: берут по I мл основных стандартных растворов микотоксинов Т-2, Ф-2 и стеригмзтоцисти: и 2 мл афлатоксина и смешивают их.

4.7.    Смесь гексана с ацетоном в соотношении 98:2

4.8.    Смесь хлороформа с ацетоном 9:1

4.9.    Системы растворителей для тонкослойной хроматографии: толуол-этилацетат-мурзвьиная кислота (5:4:1) и хлороформ-ацетон-мура иная кислота (93:7:2).

4.10.    Силикагель. Силикагель Л производства ЧССР используют без предварительной подготовки. Силикагель KGK размалывают на шаровой мельнице и заливают на 18-20 ч соляной кислотой, разбавленной водой 1:1. Затем кислоту сливают и силикагель промывают водой до отсутствк в промывных водах следов иона хлора, что контролируют по отсутствию осадка белого цвета при добавлении к I мл промывных вод I мл 2%-ного раствора азотнокислого серебра и I мл азотной кислоты.

После этого силикагель промывают ацетоном, просушивают под тяго до исчезновения запаха ацетона, а затем высушивают в сушильном шкафу при-температуре 130°С в течение 4-6 ч. Очищенный и высушенный силика гель просеивают через сито. Для заполнения хроматографической колонн используют фракцию, проходящую через сито с размером отверстий 0,105 мм и задерживающуюся на сите - 0,075 мм (150-200 меш).

Силикагель хранят в плотно закрытых сосудах.

5. Ход определения

5.1.    Экстракция микотоксинов. Из среднего образца тщательно измельченного фуражного зерна в колбу с притертой пробкой вместимостью 500 мл отбирают пробу массой 25 г и заливают 200 мл хлороформа. Колбу помещают на шуттель-аппарат и встряхивают в течение 1,5 ч.

Экстракт фильтруют через химическую воронку с бумажным фильтром в колбу для отгона или в выпарительную чашку.

Осадок зерна с фильтра вновь переносят в колбу со 100 мл хлороформа и продолжают встряхивание в течение 30 мин. Экстракт фильтруют и фильтрат присоединяют к основному отфильтрованному экстракту

Колбу и осадок на фильтре промывают дважды хлороформом (по 25мл Промывные порции хлороформа присоединяют к основному экстракту и объединенный экстракт концентрируют на роторном испарителе или водянок бане при температуре 50-55°С до объема 2-3 мл, затем до получения сухого остатка - под вакуумом или в вытяжном шкафу при комнатной температуре.

5.2.    Очистка от примесей

5.2.1. Обезжиривание экстракта гексаном.

Сухой остаток растворяют в ацетоне и количественно переносят в делительную воронку вместимостью 300-500 мл (ооъем ацетона - 100мл К раствору в делительной воронке приоавляют 50 мл гексена, перемешивают и доозвляют 100 мл воды. При нечетком разделении слоев и образовании эмульсии к смеси дооавляют 500 мг хлористого натрия. После разделения слоев, водно-ацетоновую фракцию (нижний слой) сливают в колбу или выпарительную чашку, а гексановую фракцию (верхний слой) удаляют. Содержимое колбы или чашки (водно-ацетоновая фракция) переносят в делительную Еоронку и повторно экстрагируют 25 мл гексана встряхивая воронку в течение 2 мин. Если интенсивность окраски гексановой фракции не ослаоевает, эту процедуру повторяют ещё раз, каждый раз удаляя гексановую фракцию.

5.2.2. Переэкстракция микотоксинов в хлороформ.

К водно-ацетоновой фракции в делительной воронке дооавляют 4 г хлористого натрия, после растворения хлористого натрия в воронку вносят 50 мл хлороформа и смесь встряхивают в течение 2 мин. После разделения слоев хлороформный слой (нижний) сливают в колоу для отгона или выпарительную чашку (экстракт №1).

К оставшейся водно-ацетоновой фракции в делительной воронке дооавляют 8 мл I н раствора соляной кислоты и 25 мл хлороформа и

-    5    -

смесь встряхивают 2 мин. После разделения слоев хлороформный экстракт присоединяют к первому экстракту. Экстракцию хлороформом по 25 мл повторяют дважды, присоединяя хлороформные экстракты к экстракту №1. Объединенные хлороформные экстракты концентрируют на роторном испарителе или водяной бане при температуре 50-55°С до объема 2-5 мл,затем до получения сухого остатка - под вакуумом или в вытяжном шкафу при комнатной температуре.

5.2.3.    Повторное обезжиривание экстракта гексаном.

Сухой остаток экстракта растворяют в ацетоне и количественно переносят в делительную воронку вместимостью 100 мл (объем ацетона 20мл прибавляют 12 мл гексана, перемешивают и добавляют 20 мл воды.

5.2.4.    Повторная переэкстракция микотоксинов в хлороформ.

После разделения слоев гексановую фракцию (верхний слой) удаляют (см.п.5.2.1), а в водно-ацетоновую фракцию в воронке вносят 0,6 г хлористого натрия, после его растворения прибавляют 50 мл хлороформа, воронку встряхивают в течение 2 мин. После разделения слоев хлороформный экстракт (нижний слой) фильтруют в колбу для отгона или выпарительную чашку через бумажный фильтр с 20 г безводного сернокислого натрия,предварительно промытого 10 мл хлороформа (экстракт №2).

В делительную воронку приливают 1,2 мл I н раствора соляной кислоты, добавляют 25 мл хлороформа и встряхивают в течение 2 мин.

Хлороформный слой (нижний) фильтруют через тот же бумажный фильтр с безводным сернокислым натрием. Экстракцию по 25 мл хлороформа повторяют дважды. Отфильтрованные хлороформные экстракты присоединяют к экстракту №2. Бумажный фильтр с сернокислым натрием промывают 15мл хлороформа и промывные порции хлороформа присоединяют к основному экстракту. Объединенные хлороформные экстракты концентрируют на ротор ном испарителе или водяной бане при температуре 50-55°С до небольшого объема, а затем до получения сухого остатка - под вакуумом или при комнатной температуре в вытяжном шкафу.

Концентрированный экстракт с незначительными количествами примесей (наблюдается еле заметный на глаз, в виде налета, осадок) можно непосредственно использовать для хроматографического исследования. Доказательством содержания незначительного количества примесей является также бесцветная или слабо желтая окраска раствора экстракта в 0,3 мл хлороформа. Экстракт с наличием примесей дополнительно очищаю* колоночной хроматографией.

5.2.5.    Очистка колоночной хроматографией.

В нижний конец колонки помещают гигроскопическую вату слоем

- 6 -

I см и в колонку вносят 5 г силикагеля в виде суспензии в гексане.

На силикагель наслаивают 3 г безводного сернокислого натрия. Сухой остаток исследуемого экстракта в колбе или выпарительной чашке растворяют в 3 мл хлороформа, добавляют 30 мл гексана и раствор вносят в хроматографическую колонку. После впитывания раствора в сорбент колбу или выпарительную чашку из-под экстракта обмывают 2 мл хлороформа, затем 20 мл гексана и вносят в ту же хроматографическую колонку. После впитывания раствора в сорбент в колонку добавляют 0,5 г безводного сернокислого натрия и последовательно пропускают 50 мл гексана, 50 мл смеси гексан-ацетон (98:2) и 150 мл смеси хлороформ-ацетон (9:1). Гексановый и гексан-ацетоновый элюаты отбрасывают, а хлороформно-ацетоновый элюат собирают в колбе для отгона или выпарительной чашке и концентрируют на роторном испарителе или водяной бане при температуре 50-55°С до получения небольшого объема, затем концентрирование элюата до сухого остатка проводят под вакуумом или при комнатной температуре в вытяжном шкафу.

С сухим остатком элюата поступают одним из следующих способов:

-    растворяют в небольшом количестве хлороформа, количественно переносят в небольшую пробирку и концентрируют до получения сухого остатка под вакуумом или на водяной бане при температуре 50-55°С в вытяжном шкафу. Сухой остаток вновь растворяют в 0,3 мл хлороформа;

-    переносят также с помощью хлороформа в калиброванную пробирку небольшой вместимости и выпаривают растворитель из пробирки до получения объема раствора - 0,3 мл.

5.3. Определение микотоксинов в пробе хромотографией на пластинках "Силуфол"

5.3.1. Раствор экстракта в объеме по 2; 5; 5; 10 и 15 мкл наносят на каждую из трех пластинок Ш I, 2, 3. Одновременно с исследуемыми пробами на пластинки наносят 2,5; 5,0; 7,5 и 10 мкл стандартного раствора смеси микотоксинов, что соответствует следующему количеству микотоксинов:

Количество стандартного раствора[Содержание микотоксинов

(мкг)

смеси микотоксинов (мкл)

! Т-2

J

! Ф-2 }

5итеригмзто-;цистин

'аошзтоксик ! Bi

2,5

10,1

!0,1

! 0,01

! 0,001

5,0

! 0,2

10,2

1 0,02

I 0,002

7,5

• 0,3

10,3

! 0,03

! 0,003

10,0

юл

10,4

! 0,04

! 0,004

- 7 -

На каждую пластинку в одну из точек нанесения 5 мкл исследуемой пробы вносят по 2,5 мкл стандартного раствора микотоксинов.

Величина площади стартового пятна нанесенных исследуемых проб должна соответствовать площади стартового пятна стандартных проб.

Пробы наносят на расстоянии 1,5 см друг от друга, 2 см от нижнего края пластинки и I см от боковых краев пластинки.

5.3.2.    Пластинки №1 и Ш помещают в хроматографическую камеру и хроматографируют в системе хлороформ-ацетон-муравьиная кислота (93:7:2). После продвижения фронта растворителя на высоту 8 см от линии старта, пластинки извлекают из камеры, подсушивают в вытяжном шкафу, затем хроматографирование повторяют. Пластинку №3 хроматографируют в системе толуол-этилацетат-мурэвьиная кислота (5:4:1) и извлекают из камеры после продвижения фронта растворителя на высоту

12 см, затем высушивают в вытяжном шкафу.

5.3.3.    Для выявления микотоксина Ф-2 пластинку №1 подсушивают

в сушильном шкафу 3 мин при П0°С и просматривают в ультрафиолетово! области света (УФЛ) при длинах волн 254 и 365 нм. При наличии в исследуемых пробах токсина Ф-2 на хроматограмме обнаруживают пятна с голубой флуоресценцией, соответствующие по положению и флуоресценцш пятнам токсина Ф-2 в стандартных пробах.

При выявлении указанных пятен в УФЛ нижнюю часть пластинки "Си-луфол” ниже области расположения пятен микотоксина Ф-2, закрывают полоской плотной бумаги или другой пластинкой. Незакрытую часть пластинки обрабатывают свежеприготовленным раствором красного прочного Ш и помещают в сушильный шкаф при температуре П0°С на 5-7 мин. Микотоксин проявляется в виде желтого пятна в видимой области света.

Р| пятна 0,54.

5.3.4.    Для выявления токсина Т-2 в присутствии Ф-2 с нижней части пластинки №1 снимают прикрытие, пластинку обрабатывают 20%-ны: спиртовым раствором серной кислоты и помещают её в сушильный шкаф при температуре П0-120°С. После небольшого потемнения пластинку извлекают из шкафа, охлаждают и просматривают в длинноволновой обла сти (365 нм) УФЛ. При наличии токсина Т-2 в исследуемых пробах на хроматограмме обнаруживают пятна с голубой флуоресценцией, соответствующие по положению и цвету пятнам токсина Т-2 в стандартных пробах. В? пятна 0,29.

5.3.5.    Для обнаружения стеригматоцистинз пластинку №2 просматривают в УФЛ (365 нм). При наличии в исследуемых пробах стеригматоцистинз в количествах 0,1 мкг и выше на хроматограмме наблюдаются пятна с флуоресценцией красно-кирпичного цвета.

Для выявления малых количеств стеригматоцистинз, меньше 0,1 мк

- 8 -

пластинку обрабатывают 20%-ным спиртовым раствором хлористого алюминия, нагревают при 80°С 5 мин и просматривают в УФЛ (365 нм ) на на ли чие зоны зеленовато-желтой флуоресценции, соответствующей стандарту стеригматоцистина. В? пятна стеригматоцистина - 0,78.

При наличии в исследуемых пробах токсина Ф-2 на пластинке №2 после обработки 20%-ным спиртовым раствором хлористого алюминия обна руживают пятна с синей флуоресценцией, соответствующие по положению и характеру флуоресценции пятнам Ф-2 в стандартных пробах.

5.3.6. Индикацию афлатоксина B-j- проводят на пластинке №3. Пластинку просматривают в УФЛ (365 нм) и при наличии афлатоксина Вр в исследуемых пробах обнаруживают пятна с синей флуоресценцией, соответствующей флуоресценции стандарта афлатоксина Bj*B# пятна зфлаток-сина 0,36.

5.4. Оценка результатов.

5.4.1.    Количество микотоксиков Т-2Х] стеригматоцистина, афлаток сина Bj в исследуемых пробах определяют сравнением интенсивности флуоресценции пятен микотоксинов в исследуемых и стандартных пробах, а микотоксина Ф-2 после обработки пластинки раствором красного прочного И.

5.4.2.    Если содержание микотоксинов в исследуемых пробах превышает содержание микотоксинов в стандартных пробах исследуемый раствор разбавляют хлороформом в два или три раза и полученный раствор снова наносят на "Силуфол" для хроматографического исследования. Разведение учитывают при расчете.

5.4.3.    Расчет результатов анализа.

В*Ур.1000*2,5 Х=---


, где


~ Ур • Д


Концентрацию микотоксинов в мкг/кг зерна вычисляют по формуле:

X - концентрация микотоксинов,мкг/кг;

В - концентрация микотоксинов в хроматографируемой исследуемой пробе (мкг);

Ур - объем хроматографируемой исследуемой пробы - 0,002; 0,005; 0,01; 0,015 мл;

У2 - общий объем исследуемой пробы, приготовленный для хроматографирования - 0,3 мл или объем с учетом разбавления;

Д - масса исследуемой пробы - 25 г;

1000 - пересчет на I кг зерна;

х) Количественное определение токсина Т~ 2 возможно при наличии примесей в небольших количествах.

2,5 - коэффициент, учитывающий потери микотоксинов.

5ЛЛ. Пределы обнаружения микотоксинов: Т-2 500-700 мкг/кг, Ф-2 250-500 мкг/кг, афлатоксина Bj 10-15 мкг/кг, стеригматоцисти-на 80-100 мкг/кг зерна.

6. Техника безопасности

6.1. При проведении исследований необходимо соблюдать общепринятые правила техники безопасности, предусмотренные для работ с органическими растворителями, УФ-светом и токсическими веществами.

X    X

X

Методика разработана ВНИИ ветеринарной санитарии.