т
. "УТВЕРВДАЮ"
* Начальник Главного управления ветеринарии MCI CUCF
МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА СССР
ГЛАВНОЕ УПРАВЛЕНИЕ
ВЕТЕРИНАРИИ (с Государствекиой ветеришрздй инспекцией)
МЕТОДИКА Ь__ ль_
Москва
Г
Индикации бактерий рода "Протеус" в кормах живот:
ГО происхождения
Настоящая методика предназначена для ве-
Шршарннх лабораторий» лабораторий ОПЕК мясокомбинатов и других учреждений, с целью индикации бактерий рода "Протеус" в сухих животных кормах.
I. Порядок проведения исследовании.
1.1. Первый день исследования. 50 г корт помещают в колбу с 0UO мл стерильного физиологического раствора шш О»If стерильном йептонной вода и тщательно встряхивают на шуттель-шшарате в течение 30 минут. Для количественного учета и получешя чистой культуры первичный, посев исследуемого материала производят по 1,0 ш до разведения 1СГ^ в конденсационную воду свежескошенного агара Сме-*од Щукевича) шш ТТХ-агара (Даниленко И.И.) и но 0,5 мл на поверхность питательных сред Плоскирева или висмут-сульфат агар. Посевы помещают в термостат при температуре 37°С на 18-24 часа.
1.2. Второй день исследования.
1.2.1 просматривают титрационные посевы на скошенном МПА или П'Х-агаре. Если регистрируют "ползучий" нежный вуадеобразнык рост Сна МПА) км нежно-розовый (на ТТХ-агаре), то определяют титр по наименьшему количеству засеянного материала, в котором обнаружен рост бактерий рода "Протеус";
1*2.2 просматривают чашки е посевом и отмечают колонии» подлежащие дальнейшему исследованию. На среде Плоскирева бактерии растут в виде прозрачных колоний, зона роста которых окрашивается в желтоватый цвет; на висжут-сулъфит агаре черев 24-48 часов -н виде изолированных колонии темно-коричневого цвета* окраска среды не изменяется. Если рост 18-24 часовой культуры однородный» то
2.
jura дальнейшего изучения используют не менее 4-х колоний, npf росте различных колони! - не менее шести;
1*2*3 для определения родовой принадлежности изучаемого штамма Изолированные колонии отвивают в пробирку с МПБ, из которого после 4-5 часовой инкубации при 37°С производят пересев на следующие среды: /приложение Is I/
- агар с фенилаланином для определения фермента фенжяаданжг-дезаминазы;
- бульон шш педтонную воду для определения индола;
- среду с мочевиной для определения фермента уреазы;
- среду с 0,5% мальтозы;
- скошенный агар или ТГХ-агар для серологического типирова-иия ш определения патогенности.
Среды помещают в термостат при 37°С на 16-18 часов.
Наличие фермента фенилалашвдезашназы определяют путем наслоения на скошенную поверхность среды 4-5 капель 1®-чтого раствора хлорного железа. Появление интенсивной зеленой окраски свидетельствует о наличии Фермента.
Гидролиз мочевины (наличие фермента уреазы) устанавливают «о изменению цвета среды из желтого в красны!.. Индол определяют на МПБ по специальным индикаторным бумажкам, вложенным под пробку пробирка. Индол можно определять путем наслоения на среду реактива Эрлиха (0,5 мл), при этом появление красного кольца на границе жидкостей через 2-5 шнут свидетельствует о положительном результате.
1.3. Третий день исследования.Учитывают результаты ферментативной активности культур, Грамотрицателъные бактерии, гидролизующие мочевину, дезаминирущие фенилаланин, относятся к роду "Протеус". На основании способности к индодообразованию и ферментации мальтозы определяют принадлежность к одной из биохимических груш: штаммы, ферментирующие мальтозу ж образующие индол, относятся к £?. УиЦй1-1$> ; штаммы, не ферментирующие мальтозу и не образующее индол г к Рг. mhaSiC/i. .
1.4. Серологическое тидировяше. Штампы, отнесенные на основании биохимических свойств к роду "Протеус", подвергают серологическому титрованию при помощи диагностических поливалентных
и типовых 0- и Е- сывороток в реакции агглютинации на стекле. Идя тишровалия используют суточную агаровую культуру. Первоначально культуру испытывают поливалентны® 0- сыворотками. В случае.
если культура агглютинируется одной из поливалентных сывороток, продолжают серсшогичеекую идентификацию типовыми сыворотками, входящими в состав поливалентном. При нечетких результатах, полученных в РА на стекле с живой культурой, проводят реакцию аг-юттинацщ в пробирках ила на стекле с прогретой (I час-100°С), отцентрифугированном культурой.
После установления принадлежности к той. или иной О-грунпе определяют Н-антиген с поливалентными Н-снворотками, а затем типовыми. Серологический вариант определяют в соответствии со схемой Кауфмана, и Перча (приложение 2).
I. 5. Определение патогенности. Патогенные свойства бактерий определяют путем постановки биологической пробы на белых мышах. С этой целью внутрмбрш&о заражают не менее трех мышей несом I6-X8 г. смывом суточной агаровой культуры ижш суточной бульонной культурой в дозе 500 млн. микробных клеток. Концентрацию бактерий устанавливают по бактерийному стандарту. Культуру признают патогенной в случае гибели одной или более мышей в первые двое суток после заражения.
II. Оценка кормов животного пшиехождения.
2.1. Корма животного происхождения используют сельскохозяйственным животным и птице при отрицательных результатах исследования на знтеропатогенше варианты бактерий рода "Протеус" при условии соответствия кормов по другим показателям действующих стандартов.
2.2. При обнаружении энтеропатогенных вариантов бактерий рода "Протеус" сухие корма жиеотного происхождения подвергают повторной термической обработке путем проварки при температуре не менее 100°С в течение 1,5 часа или стерилизации в вакуум-го-ризонталыжх котлах - при температуре 120°С в течение 30 минут.
XXX
Методика разработана Всесоюзным научно-исследовательским институтом ветеринарной санитарии.
Рецепты сред I. Агар с фенш^аланином
Дрожжевой экстракт dt - фенилаланин или is - фенилаланин
мв^Ш04: 12Н20 KaCI
Агар
Вода дистшшрованная
Ингредиенты растворяют в воде при подогревании, фильтрует К разливают в пробирки по 2-3 ш» стерилизуют при 120°С в течение 10 минут, после пего агар в пробирках скашивают. Одновременной готовят 1СЙ-НЫЙ раствор хлорного железа,
2. ТТХ - агар
К 100 мл расплавленного ШШ добавляют I мл I^-го раствора ИХ /трмфенжлтетразолии хлорид/. Агар перемешивают, разливают В пробирки и готовят скошенный агар.
3. Бульон с мочевиной.
К 100 мл МПБ добавляют 1,0 г.мочевины и 0,2 мл индикатора-1,6^-ного стартового раствора креэолового красного. Стерилизуют текучим паром в течение 3-х дней. Готовая среда имеет желтый цвет.
5.
Приложение № 2,
Упрощенная алтигенно-диагностическая схема бактерий рода "Протеус" (Кауфман, Перча, 1948).
|
Ьй ген |
! Н-автиген |
|
I 0-антиген |
! Н-антиген |
|
Р* *“ 1 |
I |
|
|
|
26 |
-5 3; 6 |
|
2 |
I |
|
|
|
27 |
2; 3 |
|
3 |
I; |
2 |
|
|
28 |
2; .3 |
|
4 |
I; |
8; |
16 |
|
29 |
13 |
|
Ь |
I; |
3 |
|
|
30 |
I; 2; 4; 13; 15 |
|
G |
I; |
2; |
3 |
|
31 |
I; 2 |
|
V |
I; |
3; |
4 |
|
32 |
I; 3; 5 |
|
И |
I |
|
|
|
33 |
3 |
|
1) |
I» |
2 |
|
|
34 |
6 |
|
III |
I; |
2; |
3; |
4; 5 |
35 |
2 |
|
IJ |
I; |
2; |
3; |
6 |
36 |
3; 7 |
|
|
I; |
2 |
|
|
37 |
17 |
|
13 |
I; |
2; |
3; |
4 |
38 |
I; 2 |
|
14 |
I; |
3 |
|
|
39 |
18 |
|
ЕГ> |
I; |
7 |
|
|
40 |
4 |
|
|С |
1; |
9; |
14 |
|
41 |
I; 2 |
|
т |
I; |
10 |
|
|
42 |
I |
|
Р |
I |
|
|
|
43 |
2 |
|
in |
I; |
3; |
II |
|
44 |
II; 19 |
|
р |
I; |
2 |
|
|
45 |
II |
|
t |
I |
|
|
|
46 |
17 |
|
ig |
I |
|
|
|
47 |
I |
|
я |
1; |
2; |
з; |
12 |
48 |
I |
|
т |
I; |
3; |
4; |
13 |
49 |
2 |
|
р |
I |
|
|
|
|
|
