Товары в корзине: 0 шт Оформить заказ
Стр. 1 

11 страниц

Купить бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Цена на этот документ пока неизвестна. Нажмите кнопку "Купить" и сделайте заказ, и мы пришлем вам цену.

Распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль"

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

Способы доставки

  • Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
  • Курьерская доставка (7 дней)
  • Самовывоз из московского офиса
  • Почта РФ

 Скачать PDF

Оглавление

Иммунофлуоресцентный метод диагностики

Методика постановки реакции иммунофлуоресценции при диагностике инфекционной энтероксемии овец и анаэробной дизентерии ягнят в патологическом материале

     Обнаружение возбудителей инфекционной энтеротоксемии овец и анаэробной дизентерии ягнят в патологическом материале

     Определение возбудителей инфекционной энтеротоксемии и анаэробной дизентерии в культуре

     Непрямой метод

     Окрашивание мазков прямым методом

     Микроскопия мазков

     Оценка результатов

 
Дата введения01.01.2021
Добавлен в базу01.01.2019
Актуализация01.01.2021

Этот документ находится в:

Организации:

15.02.1984УтвержденГлавное управление ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР
ИзданРоссельхозиздат1984 г.
Стр. 1
стр. 1
Стр. 2
стр. 2
Стр. 3
стр. 3
Стр. 4
стр. 4
Стр. 5
стр. 5
Стр. 6
стр. 6
Стр. 7
стр. 7
Стр. 8
стр. 8
Стр. 9
стр. 9
Стр. 10
стр. 10
Стр. 11
стр. 11

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА СССР

Российская сельскохозяйственная академия

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ ИНФЕКЦИОННОЙ ЭНТЕРОТОКСЕМИИ ЖИВОТНЫХ И АНАЭРОБНОЙ ДИЗЕНТИРИИ ЯГНЯТ

Москва 1984

ББК 4G.6I

G36.3 Л 94

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ ИНФЕКЦИОННОЙ ЭНТЕРОТОКСЕМИИ ЖИВОТНЫХ И АНАЭРОБНОЙ ДИЗЕНТИРИИ ЯГНЯТ

Утверждены Главным управлением ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР 15 февраля 1984 г.

„40902—87    (С)    Россельхозиздат,    1984    т.

У М 123 (О^БГ

ОГЛАВЛЕНИЕ

Иммупофлуоресцсктныи метод диагностики    3

Методика постановки реакции иммулофлуорссцснции при диагностике инфекционной эитсротокссмин опец

н анаэробной дизентерии ягнят......7

Обнаружение возбудителей инфекционной энтсротокссмин овец н анаэробной дизентерии ягнят в патологическом

материале    ......7

Определение возбудителей инфекционной эптеротокссмии

и анаэробной дизентерии в культуре.....8

Непрямой метод    .....8

Окрашивание мазков прямым методом.....9

Микроскопия мазков    ...    *    9

Оценка результатов    .....10

ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ МЕТОД ДИАГНОСТИКИ

Одним -из важнейших резервов в овцеводстве, особенно в условиях отгонно-пастбищного содержания поголовья, наряду с укреплением кормовой базы, улучшением кормления и условий содержания овец, является снижение заболеваемости и падежа животных опт различных инфекционных, инвазионных и незаразных болезней. Анализ причин падежа овец в ДАССР показал, что от анаэробных заболеваний {энтеротоксемия овец, дизентерия япнят) гибнет животных больше, чем от всех инфекционных болезней вместе взятых.

Возбудителями -анаэробных болезней являются микроорганизмы группы Кл. перфрингенс, включающие в себя 6 типов {А, В, С, Д, Е, Г). Бактерии рода клоотридий широко распространены в природе, могут вызывать энтеротоксемию у телят, дизентерию у поросят, злокачественный отек у крупного рогатого скота, овец и свиней, гастроэнтериты у жеребят и цыплят. Нередко эти анаэробы являются виновниками возникновения газовой гангрены, гастроэнтеритов и пищевых отравлений у человека.

Успех лечебно-профилактических мер против указанных клост-ридиозов во многом зависит от точно и своевременно поставленного диагноза. По существующей инструкции он устанавливается в течение восьми суток путем проведения сложных лабораторных исследований с использованием множества белых мышей.

Поэтому перед ветеринарной наукой стоит задача разработать более ускоренные и чувствительные методы диагностики клосТ|риди-оз-oiB и внедрить их в лабораторную практику.

Одним из таких методов является люминесцентно-серологический, сущность которого заключается в соединении меченых флуорохромами антител со специфическими антигенами и выявлении образовавшихся светящихся комплексов при люминесцентной микроскопии.

В настоящее время этим методом диагностируются такие инфекционные заболевания животных, как сибирская язва, туберкулез, лист ери оз, сальмонеллезы, бешенство и др.

На возможность использования реакции иммунофлуоресценции для дифференциации типов Кл. перфрингенс указали Козловский Е, Г. и Ефанова М. И. (1970). Однако исследования Полынико-ва Д. Г. (1969) не дали положительных результатов.

3

В ВИЭВ под руководством профессора И. И. Архангельского и зав. лаб. болезней овец Ю. Д. Караваева выполнены исследования по идентификации микробояз Кл, перфрингенс с использованием реакции иммунофлуоресценции. При этом было установлено, что эта реакция, хотя и вызывает свечение в-сей группы микроорганизмов, но типизировать Кл. перфрингенс не позволяет.

Учитывая перспективность реакции иммунофлуорееценции, мы применили ее для экспресс-дивпностики инфекционной энтероток-семии овец и анаэробной дизентерии ягнят.

Для этого мы изготовили антигены из микробов Кл. перфрингенс пипов А, В, С, Д, а также из mix токсинов. Путем гипериммунизации баранов этими ант*- генами получили противобактериальные и антитоксические сыворотки, глобулиновые фракции, которых после конъюгирования с изотиоционатом флусресцеина использовали для идентификации микробов Кл. перфрингенс методом флуоресцирующих антител.

Сцецифичность окрашивания меченых иммуноглобулинов проверяли на препаратах, приготовленных и.з различных штаммов музейных культур Кл. перфрингенс типа А, В, С и Д, а также Кл. оеде-матиенс и Кл. сепии кум.

Результаты многократно проведенных исследований показали, что полученные антибактериальные флуоресцирующие сыворотки типа А, В, С и Д специфически окрашивают соответствующие гомологичные микробы Кл. перфрингенс. Характерным для них было четкое золотисто-зеленого цвета свечение периферийных участков микробной клетки, тогда как центральная часть выглядела более темной. Такое -свечение микробов считали специфичным и оценивали на три или четыре креста. За счет образования вокруг клеток светящегося комплекса ободка микробы выглядят несколько длиннее и толще, чем при обычной световой микроскопии. Иногда указанные антибактериальные сыворотки, особенно типа А и С, вызывали слабо заметное межтиповое свечение микробов Кл. перфрингенс, оцениваемое на один и, очень редко, на два креста.

При использовании непрямого варианта препараты обрабатывали первоначально немечеными антибактериальными сыворотками (А, В, С и Д), затем — во второй стадии — антмеидовой флуоресцирующей сывороткой.

В этих случаях микробы Кл. перфрингенс светились так же, как и в прямом методе.

При отрицательном результате бактерии просматривались в поле зрения микроскопа в виде слабо заметных серых палочек.

4

Следует отметить, что специфическое окрашивание микробов во многом зависит от правильной техники приготовления препаратов. Для этого мы предварительно готовили взвесь микробов, содержащую 0,5—1 млрд, клеток в 1 мл, из которой затем изготавливали тонкие мазки площадью примерно 0,5 ем2.

В мазке, приготовленном из неразведенной культуры клеток, микробы располагались очень густо и слабо окрашивались, что не давало возможности судить о специфичности свечения.

Мы испытывали различные способы фиксации мазков перед окрашиванием: ацетоном, этиловым и метиловым спиртами, над пламенем спиртовки, а так же соляной кислотой при температуре 4°, 18—20° продолжительностью от 2 до 40 минут.

Установлены хорошие результаты гяри фиксации этиловым или метиловым спиртами при комнатной температуре в течение 7— 10 минут. Оптимальное время окрашивания мазков в термостате при 37° составляло 20 минут, е при комнатной температуре — 40 минут.

При микроскопировании мазков рекомендуется на покровное стекло наносить нефлуоресцирующее иммерсионное масло или же его заменитель — диметилфталат. Исследованиями установлено, что эти дефицитные препараты с успехом можно замернить чистым глицерином или вазелиновым маслом. Положительно окрашенные с использованием глицерина препараты при хранении в холодильнике не теряли специфического свечения в течение восьми месяцев (срок наблюдения). При исследовании таких мазков под микроскопом еще можно увидеть красивую панораму, представляющую собой равномерно расположенные микробы с ярко светящимся золотистого цвета ободком вокруг темного тела клетки.

При постановке люминесцентно-серологической реакции определенное значение имеет и возраст изучаемых культур. Наибольшая интенсивность свечения у Кл. перфрингенс начиналась с 6— 7-часового роста и удерживалась на этом уровне в еченм,е суток, а в последующие сутки снижалась с 4-х крестов до 3-х- Наряду с этим уменьшалось количество специфически окрашенных клеток.

Помимо идентификации музейных штаммов этот метод, параллельно с бактериологическими исследованиями,, испытывали в Республиканской и Кочубейокой ветлабораториях при установлении диагноза на вышеуказанные анаэробные болезни.

В процессе типизации 67 выделенных токоиген1ных культур Кл. перфрингенс антибактериальными флуоресцирующими сыворотками в реакции иммунофлуоресценции в 46 случаях установлен пип Д, в четырнадцати — С, в трех — (В, в двух — А. В то же время микро орган и з м ы двух культур не реагировали ни с одним

б

из меченых глобулинов.

Ценным диагностическим тестом является люминесцентно-микроскопическое исследование мазков-отпечатков из пораженных участков кишечника, брыжеечных лимфоузлов и паренхиматозных органов.

В положительных случаях на препаратах, приготовленных из различных участков кишечника и мезентериальных лимфоузлов, наблюдали большое количество микробов Кл, перфрингенс, ярко окрашенных мечеными глобулинами.

При энтеротоксемии, вызванной типом С, аналогичных микробов обнаруживали также в мазках-отпечатках из печени, селезенки, почек, сердца и надпочечников

В результате исследования препаратов, изготовленных из кишечника и мезентериальных лимфатических узлов овец, павших от других причин, очень редко обнаруживались специфически светящиеся микробы Кл. перфрингенс при просмотре даже в 20—30 и более полях зрения.

Этот тест позволяет не только обнаружить в течение одного-двух часов обеемененность органов микроорганизмами Кл. 'перфрингенс, но и одновременно установить типы возбудителя знте-ротоксемии.

Наряду с испытанием изготовленных в нашей лаборатории антибактериальных и антитоксических сыврроток Кл. лерфрин-генс мы проводили исследования, направленные на /выяснение возможности использования фабричных типоспецифических антитоксических сывороток для люминесцентно-серологической диагностики инфекционной энтеротоксемии овец и анаэробной дизентерии ягнят.

Результаты этих исследований показали, что антитоксичеокие сыворотки типа А, В, С, Д также окрашивали гомолюпичные музей мые штаммы и выделенные культуры Кл. перфрингенс на три и четыре креста. Однако при их использовании нередко отмечалось межтиповое свечение микробных тел, оцениваемое на один или два креста. Это затрудняло точную типизацию культур Кл. перфрингенс, В то же время этот метод позволяет дифференцировать микробы группы Кл. перфрингенс от других видов шю-стридий.

Таким образом, исследованиями уста новлемо, что предлагаемый метод иммунофлуоресцентной дифференциации микроорганизмов группы Кл. перф|рингенс с использованием антибактериальных меченых глобулинов очень удобен прост и весьма эффективен, а главное — требует минимального /времени для пос-танов!ки диагноза на инфекционную эн те р от о ксемию овец и анаэробную дизентерию ягнят*

6

МЕТОДИКА

ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ПРИ ДИАГНОСТИКЕ ИНФЕКЦИОННОЙ ЭНТЕРОТОКСЕМИИ ОВЕЦ И АНАЭРОБНОЙ ДИЗЕНТЕРИИ ЯГНЯТ

Рекомендуется ветеринарным лабораториям Дагестанской АССР.

Метод основан на выявлении различных типов Кл. перфрин-гене в мазках из кишечника и других паренхимато зных .органов, а также из культур, выделенных из патмет-ерлала, путем .иополь-завання реакции и!мму!нофлуоре|С)Це1нции.

Дли проведения исследования необходимо ел ©дующее,:

1. ЛЮМИ1Несцентньi:й микрОс-лок любой марки (МЛ-2, МЛ-4, МЯД, ЛЮМАМ или обычный биологический микроскоп МБИ-1, МБИ-3, МБ'И-4) в сочетании с люминесцентным Осветителем ОИ-17.

2 Меченная люминеоцирующая энтеротоксемийная сыворотка (для прямого метода) или антитоксин ©акне типосшецифи-чес кие сыворотки, флуоресцирующий внтибараний глобулин (для непрямого метода) Набо;р люминесцирующих анпибакте риаль-н.ых сывороток готовится в Дагестанском НИВИ по заказ/ лаборатории

3.    Этиловый или метиловый спирт.

4.    Предметные и покровные стекла.

5.    Смесь глицерича с физиологическим раствором в соотношении 9:1 иш нефЛ'уюреюцир^щее иммерсионное масло.

6.    0,15 или 0,88%-ный раствор хлористого натрия.

7.    Кюветы или чашки Петри,

Обнаружение возбудителей инфекционной энтеротоксемии овец и анаэробной дизентерии ягнят в патологическом материале

Препараты готовят из исследуемых орланов (кишечник, мезентериальный лимфатический узел, печень, селезенка, сердце, пачки и надпочечники) в виде отпечатков или мазков. В последнем случае Органы разрезают на мелке кусочки, которые тщательно растирают б ступке с физиологическим раствором >в соотношении 1 : 5.

После осаждения крупных частиц из разных участков поверхности суспензии .готовят по 3—4 мазка на тщательно обезвреженных предметных стеклах. Для изготовления отпечатков из органов вырезают кусочки размером 1X1 см и слегка

1

фламбируют их над пламенем. Затем стерильными ножницами отсекают часть кусочка и срезом делают на предметных стеклах отпечатки.

Часть мазков и отпечатков окрашивают по Граму и микросюо-пируют для определения микробов Кл. перфрингенс.

Вторую часть отпечатков после высушивания в течение 7— 10 минут фиксируют метиловым или этиловым спиртом.

Определение возбудителей инфекционной энтеротоксемии и анаэробной дизентерии в культуре

Для выделения культур возбудителя, не дожидаясь результатов первичной световой и люминесцентной микроскопии, из патм-атериала делают посевы на общепринятые для этих -возбудителей среды.

Исследуют только чистые или смешанные культуры сразу же после появления макроскопически видимого роста. Обычно такой рост у Кл. перфрингенс типа В наблюдается через 3 часа-, у типа С и Д — через 6 часов. Мазки готовят очень тонкими, чтобы в поле зрения микроскопа было несколько десятков микробных клеток. Густые мазки для исследований непригодны. На одном предметном стекле готовят 3—4 мазка площадью не более 1 смй. Место нанесения микробов очерчивают восковым карандашом, подоуш;ив1ают, маркируют и фиксируют спиртами. После фиксации и испарения спирта мазки ополаскивают физраствором. На слегка подсушенный мазок наносят соответствующую сыворотку, предварительно раз веденную физраствором СрН 7,4), как указано на этикетке ампулы.

Окрашивание .мазков производят прямым или непрямым методами.

Непрямой метод

При непрял ом методе на мазок наносят по 1—2 кашли фабричной типо-специфической сыворотки Кл. перфрингенс тиле А, В, С и Д (каждой в -отдельности). Предварительно устанавливают их красящий титр и рабочее разведение. Красящий питр этих сывороток определяют путем их титрования в разведениях 1 : 1 1 :2, 1 : 4, 1 : 8, 1 : 16 и т. д. с люминесцирующей сывороткой. Затем микроскопией устанавливают максимальное разе едение, которое дает характерное свечение гомологичных микробов Кл. перфрингенс, оцениваемое в три и четыре креста. Это раз-

8

ведение является титром сыворотки, Концентрация рабочего разе едения сыворотки должна быть -в две раза больше «концентрации красящего титра. В дальнейших исследованиях их используют без предварителынюй проверки.

Препараты с антигеном im немеченой иммунной сывороткой в рабочем разведении помещают bio влажную камеру (чашки Петри или кюветы, содержащие увлажненную фильтровальную бумагу или кусочки омоченной водой ваты) и выдерживают в термостате при 37°С «в течение 20 мин. или же при комнатной температуре — в течение 40 минут. Предметные стекла в течение 10 мин. промывают 3 разе фиграетеором, ополаскивают © дистиллированной воде, промокают фильтровальной бумагой и- наносят на них по 1—2 капли люммнеоцирующей сыворотки кролика против глобулинов барана, изготовляемой Всесоюзным институтом эпидемиологии и микробиологии им. И. Ф. Гамалея, в рабочем разведении, указанном на этикетке ампулы. Затем препараты, помещенные во влажную камеру, выдерживают в термостате в течение 20 мин. при 37°С, Далее их промывают и высушивают, как описано выше.

Окрашивание мазков прямым методом

На мазки наносят 1—2 капли флуоресцирующей антибактериальной сыворотки типа В, С и Д каждую в отдельности е рабочем титре, указанном на ампуле, «помещают во влажную камеру (закрытые чашки Петри или кюветы) м 20 мин. выдерживают в термостате при температуре 37°, а «в условиях комнаты —40 мин. Затем предметные стекла в течение 10 мин, тщательно промывают в физио логическом растворе или дистиллированной -воде, препараты подсушивают на воздухе и просматривают под люминесцентным микроскопом.

Микроскопия мазков

На поверхность препаратов, окрашенных прямым или непрямым методом, наносят буферную смесь из 9 частей глицерина и 1 части физраствора, накрывают покровным стеклом. «На покровное стекло наносят ту же буферную смесь или нефлуорес-цмрующее иммерсионное масло и исследуют под люминесцентным микроскопом с использованием светофильтров СЗС-14-4, БС-8-2, ФС-1-2 при силе тока 4А, объективе 90, апертуре 1,25, окуляре 5. Люминесцентный микроскоп устанавливают в затемненной части комнаты.

9

Оценка результатов

Результаты люминесцентной микроскопии оценивают по четырехкрестовой системе:

++ + Н--очень яркая золотисто^зеленого цвета люминесцен

ция по периферии морфологически типичных микробов, четко контрастируемая с телом клетки;

Н“ + + — яркая люминесценция периферии микробной клетки;

“Н- — недостаточно яркое, зеленовато-желтое свечение микробов;

4- — еле заметный светящийся ободок вокруг микробной клетки;

--отсутствие свечения микробных клеток.

При положительных случаях в мазках-отпечатках из кишечника, мезентериальных лимфоузлов, а также в м-азках из вьделенных культур обнаруживается огромное количество Кл. перфрин-генс, светящихся на +++ и ++++ при окрашивании типоспецифическими сыворотками В, С и Д. При свечении микробных тел на ++ и + результат следует считать сомнительным.

Реакцию иммунофлуоресценции необходимо ставить с-о следующим контролем:

1.    Окрашивание м-аз^в одной антибараньей меченой сывороткой {отрицательная реакция).

2.    Окрашивание мазков после присоединения типоопецифи-ческой сыворотки гетерологичной меченой сывороткой (отсутствие свечения).

3.    Окрашивание известных микробов Кл. перфрингенс непрямым методом (положительный контроль).

Таким образом, диагноз на инфекционную энтеротоксемию ец и анаэробную дизентерию ягнят следует считать установленным при наличии к л и н и ко-эни зоот ол отчески х и лаггологоана-томических данных и обнаружении специфически светящихся микробов Кл. перфрингенс в мазках-отпечатках из пораженных органов и свежевыделен1ных культур, окрашенных сыворотками типа В, С и Д. При сомнительном или отрицательном результате реакции иммунофлуоресценции проводят полное бактериологическое исследование.