МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ (Миисвльлоа России)

Департамент ветеринарии

107138, Мосхаа, Орлике» п«р„ 1Л1.

Дш» твтфам«« Москва 84 Мкнроссальхох Телекс: 411258 ЗЕРНО Факс; (035) 975-58-50. Тел.: 575^56-50

E-mail: chief@devet-aris.ru

I4.G7.03r, № 13-5-432/0627

На Xi

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

по выделению и количественному учету микроскопических грибов в кормах, кормовых добавках и сырье для производства кормов

L ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

1.1. Методические указания устанавливают метод выделения и количественного учета микроскопических    грибов (плес необразующих,    дрожжевидных,

дрожжеподобных) в кормах и распространяются; на корма и кормовые добавки животного происхождения (мука мясная, мясо-костная, кровяная, костная, гидролизованного пера; полуфабрикат костный; мука кормовая из рыбы, морских млекопитающих, ракообразных и беспозвоночных; молоко сухое обезжиренное, сыворотка сухая, заменитель цельного молока); продукцию микробиологической промышленности (дрожжи кормовые, дрожжи кормовые паприн); корма травяные искусственно высушенные и муку витаминную из древесной зелени; муку и крупку кормовую водорослевую;    продукцию комбикормовой    промышленности

(комбикорма полнорационные, комбикорма-концентраты, премиксы, белкововитаминные и амидо-витаминные добавки; белково-витаминно-минеральные концентраты); сырье для производства кормов и кормовые добавки (отруби, мука кормовая; жмыхи, шроты; корма кукурузные глютеновые).^Х)

Примечание: х) Выделение грибов из силоса и сенажа проводят в соответствии с “Методическими рекомендациями по выделению из силоса микроскопических грибов, имеющих значение в санитарно - микологической оценке его качества” (утв. РАСХН 25.06.01. г.), из зерновых и зернобобовых - а соответствии с “Методическими указаниями по микологическому исследованию фузариозного зерна пшеницы” (утв. ГУЗ МСХ СССР 20.01.89 г.), из грубых кормов - по ГОСТ 18057. В указанных трех документах количественный учет грибов не предусматривается.

1.2.    Метод основан на свойстве микроскопических грибов расти при определенных условиях на специально приготовленных питательных средах.

1.3.    Метод основан на следующих операциях: посев взвесей, приготовленных путем последовательных десятикратных разведений измельченного корма на питательную среду в чашки Петри; инкубация грибов; подсчет выросших колоний для определения общего (суммарного) числа грибов (ОЧГ), выражаемого количеством колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 г исследуемого продукта.

1.4.    Цель проведения испытания - выявление партий кормов, кормовых добавок и сырья для производства кормов, в которых содержание общего числа грибов в 1 г превышает допустимые уровни, что способствует обеспечению безопасности корма для здоровья животных, в первую очередь, профилактики микотоксикозов.

2. ОТБОР ПРОБ КОРМОВ

2.1. Отбор проб комбикормов, премиксов, белково-витаминных и амидо-витаминных. добавок, белково-витаминно-минеральных концентратов, муки кормовой из рыбы, морских млекопитающих, ракообразных и беспозвоночных, дрожжей кормовых, дрожжей кормовых паприн, кормов травяных искусственно высушенных, муки витаминной из древесной зелени, муки и крупки кормовой водорослевой, корма кукурузного глютенового производят по ГОСТ 13496.0. Пробы муки мясной, мясо-костной, кровяной, костной, гидролизованного пера, полуфабриката костного отбирают в соответствии с ГОСТ 17681, пробы отрубей, муки кормовой - по ГОСТ 27668, жмыхов и шротов - по ГОСТ 13979.0., молока сухого обезжиренного, сыворотки сухой, заменителя цельного молока сухого - по ГОСТ 26809,

3. АППАРАТУРА, МАТЕРИАЛЫ, РЕАКТИВЫ

3.1. Для проведения испытаний применяют: автоклав;

шкаф сушильный электрический лабораторный; шкаф вытяжной; бокс для посевов;

ультрафиолетовый облучатель типа УГДЗ с источником излучения -лампы ДРТ 1000 по ГОСТ 20401;

термостат с автоматическим терморегулированием; холодильник электрический бытовой по ГОСТ 16317; мельницу лабораторную электрическую;

весы лабораторные с погрешностью взвешивания не более 0,01 г по ГОСТ 24104;

аппарат для встряхивания жидкостей (шюттель-аппарат);

баню водяную;

потенциометр или рН-метр;

бумагу универсальную индикаторную;

горелку газовую или спиртовую (спиртовые по ГОСТ 25336);

штативы для пробирок;

шпатели металлические или фарфоровые;

чашки стеклянные лабораторные типа чБН (чашки Петри) по ГОСТ 25336 или чашки Петри пластмассовые лабораторные однократного применения диаметром 90-100 мм ТУ 64-2-19-79;

колбы стеклянные вместимостью 50 см3, ЮО см3, 500 см3, i000 см3 _по ГОСТ 25336;

мензурки или цилиндры мерные вместимостью 500 см3, Ю00 см3 _по ГОСТ

1770;

пипетки химические градуированные вместимостью 1 см3, 2 см3 _с ценой деления 0,1 см3 (пипетки типа 1) по ГОСТ 29228;

пробирки стеклянные бактериологические по ГОСТ 25336; воронки стеклянные диаметром 100 мм по ГОСТ 25336; ареометр Баллинга;

вату медицинскую гигроскопическую по ГОСТ 5556;

марлю медицинскую по ГОСТ 9412;

глюкозу по ГОСТ 6038;

сахарозу по ГОСТ;

натрий азотнокислый по ГОСТ 4168;

магний сернокислый по ГОСТ 4523;

калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198;

калий хлористый по ГОСТ 4234;

железо сернокислое закисное по ГОСТ 4148;

агар-агар по ГОСТ 17206;

желчь медицинскую консервированную;

воду дистиллированную по ГОСТ 6709;

воду питьевую по ГОСТ Р 51232;

сусло пивное неохмеленное с 12-14% сахаров;

стрептомицин (стрептомицина сульфат) для инъекций;

пенициллин (натриевая или калиевая соли бензилпенициллина) для инъекций; окситетрациклин для инъекций;

поверхностно-активные вещества: Твин-80, ОП-7, ОГ1-10; аммиак водный по ГОСТ 3760; марганцовокислый калий по ГОСТ 20490; формалин технический по ГОСТ 1625;

4. ПОДГОТОВКА К ИСПЫТАНИЮ

4.L Приготовление питательных сред.

Оптимальными средами для выделения грибов из кормов являются сусловый или картофельно-глюкозный агары, можно использовать также и агар Чапека-Докса. Применяют одну из выше названных сред. Для сокращения скорости роста грибов и предотвращения нарастания колоний- друг на друга и, следовательно, получения

изолированных колоний в питательные среды добавляют медицинскую консервированную желчь, а также антибиотики - для подавления роста бактерий.

4.1.1.    Приготовление суслового агара с желчью.

4.1.1 Л. Неохмеленное пивное сусло, содержащее 12-14% сахаров, фильтруют через тонкий слой ваты или 3-4 слоя марли, разбавляют дистиллированной водой с таким расчетом, чтобы количество сахаров составило 6—7% по ареометру Баллинга, затем добавляют 2-3% агар-агара и 100 мл медицинской консервированной желчи на 1000 мл среды; устанавливают pH среды в пределах 5-5,5. Разливают среду по колбам и стерилизуют в автоклаве при температуре 110-112°С {давлении 0,5 МПа) в течение 20мин.

4.1.2.    Приготовление картофельно-глюкозного агара.

4.1.2.1.    Для приготовления картофельно-глюкозного агара используют 200,0 г картофеля, 15,0 г глюкозы, 20,0 г агар-агара на 1000,0 мл дистиллированной воды.

4.1.2.2.    Очищенный и нарезанный кубиками картофель (не молодой) кипятят в 1000 мл дистиллированной воды в течение 10 мин. Отвар фильтруют через тонкий слой ваты или 2-3 слоя марли. В отваре расплавляют агар-агар, добавляют глюкозу. Вместо глюкозы можно использовать сахарозу, в таком случае будет приготовлен картофельно-сахарозный агар. Полученную среду разливают по колбам, затем стерилизуют при температуре 121°С (давлении 1 МПа.), pH не устанавливают.

4.1.3. Приготовление агара Чапека-Докса с желчью.

4.1.3.1.    В состав агара Чапека-Докса с желчью входят следующие компоненты: сахароза - 30,0 г;

натрий азотнокислый - 2,0 г;

калий фосфорнокислый однозамещенный - 1,0 г;

магний сернокислый - 0,5 г;

калий хлористый - 0,5 г;

железо сернокислое закисное - 0,01 г;

желчь медицинская - 100 мл;

вода дистиллированная - 1000 мл;

агар-агар - 20,0-30,0 г.

pH среды: 5-5,5.

4.1.3.2.    Для приготовления среды берут 20-30 г агар-агара, заливают его 1000 мл дистиллированной воды и вымачивают 2 ч при комнатной температуре. Воду сливают и измеряют ее объем для определения количества воды, впитавшейся в агар-агар, который затем промывают 2-3 раза дистиллированной водой.

Отвешивают остальные компоненты среды, кроме желчи, растворяют в таком объеме дистиллированной воды, который составила-слитая при вымачивании агар-агара вода. К полученному раствору добавляют отмытый агар-агар, после чего варят среду в автоклаве текучим паром в течение 1 ч. Полученную среду фильтруют,, добавляют желчь, разливают по колбам и стерилизуют в автоклаве при температуре L10-112°С (давлении 0,5 МПа) в течение 20 мин.

4.2.    Перед посевом взвеси корма питательный агар расплавляют в водяной бане.

затем после охлаждения его до 45-50°С для .подавления сопутствующей бактериальной флоры добавляют антибиотики - 50000 ЕД пенициллина и 100000 ЕД стрептомицина на 1000 мл среды или 100000 ЕД окситетрациклина на тот же объем среды. Пенициллин и стрептомицин растворяют в стерильной дистиллированной воде, окситетрациклин - в 0,01 н. растворе соляной кислоты также в стерильной дистиллированной воде. После этого агар разливают в стерильные чашки Петри и дают остыть на ровной горизонтальной поверхности. Слой агара должен быть не менее 0,5 см.

4.3. Подготовка проб кормов к посеву.

Прием проб кормов и их регистрацию, взятие навесок для анализа, хранение проб осуществляют в отдельном помещении, оборудованном вытяжным шкафом. Если анализ пробы проводят не в день получения, она должна храниться при температуре не выше + Ю°С не более 48 ч, при этом проба не должна быть заморожена.

4.3.1.    Некоторые виды кормовой продукции, предназначенной для посева (жмыхи, отруби, гранулированный и брикетированный комбикорм и другие виды), следует предварительно измельчить в лабораторной мельнице с тем, чтобы размер полученных частиц не превышал 2 мм в диаметре. Рабочую поверхность мельницы после каждого размола необходимо тщательно очищать от остатков корма и обеззараживать (фломбированием или спиртом).

4.3.2.    Приготовление последовательных разведений корма.

4.3.2.1.    Предварительно готовят 0,1%-ный раствор поверхностно-активного вещества в дистиллированной или питьевой воде (Таин-80, ОП-Ю, ОП-7). Полученный раствор, являющийся разбавителем для получения взвесей кормов, разливают по 100 см3 а колбы вместимостью 500 см^ и по 9 см3 в пробирки, после чего стерилизуют.

4.3.2.2.    Из различных точек анализируемой пробы (не менее 5-и) стерильным шпателем в стерильную колбу емкостью 50 см3 или юо см3 отбирают навеску 10 г. при этом стараясь соблюдать минимальный контакт корма с воздухом помещения для предотвращения дополнительной его контаминации. Навеску помещают в колбу вместимостью 500 см3, содержащую 100 см3 стерильного разбавителя, получают при этом первичную взвесь 1 (разведение !0~') и проводят дезинтеграцию пробы встряхиванием колбы с содержимым в течение 15-20 мин на шюттель-аппарате. Затем из ззвеси 1 готовят последующие разведения, используя стерильные разбавители, разлитые по 9 см3 _в пробирки. Для этого 1 см3 взвеси 1 приливают в пробирки с 9 см3 разбавителя и получают взвесь 2 (разведение 10~-). Из полученной взвеси 2 готовят таким же образом взвесь 3 (разведение 10“3), Перед взятием очередной порции взвеси как для получения последующего разведения, так и для посева, необходимо тщательно перемешивать взвесь пипеткой, а также промывать пипетку во взвеси не менее 5 раз.

4.3.2.3.    Пипетки (типа 1), используемые для приготовления взвесей, вымерены на слив жидкости от верхней нулевой отметки до любой другой отметки; нижняя

отметка соответствует номинальной вместимости, в которую объем сливного кончика не включен. Это позволяет отрезать кончик пипетки для увеличения диаметра выпускного отверстия до 3 мм и дает возможность легко набирать в пипетку исследуемый материал, при этом точность измерения объема не нарушается.

5. ПРОВЕДЕНИЕ ИСПЫТАНИЯ

5.1.    Для посева 1 пробы корма используют 6 чашек Петри с агаром. В каждую из б чашек вносят по 1 см3 тщательно перемешанной взвеси, не давая ей отстояться. В первые 2 чашки вносят взвесь 3 (разведение 10~3), в две другие - взвесь 2 (разведение 10~2), а две оставшиеся - взвесь 1 (разведение 10~~^). Взвесь равномерно распределяют по всей поверхности питательной среды, осторожно наклоняя чашку з разные стороны, стараясь, чтобы она не попала на боковые стенки чашки.

5.2.    Чашки с посевами помещают в термостат, не переворачивая их крышкой вниз. Инкубацию проводят при температуре 22-25°С в течение 5 суток. Рост и спороношение большинства плеснеобразующих грибов становится заметным уже через 2-3 суток, дрожжевидных и дрожжеподобных грибов - через 2 суток.

5.3.    Для предупреждения загрязнения посевов применяемая посуда (чашки Петри, пипетки и др.) и инструменты должны быть стерильными. Стерилизацию стеклянных чашек Петри, пипеток, завернутых в бумагу, проводят а сушильном шкафу при температуре 140-160°С в течение 2-х ч. Все процессы, связанные с разливкой питательных сред в чашки Петри, приготовлением взвесей путем последовательных разведений корма, посевом их на питательную среду, должны проводиться з стерильных условиях - около пламени горелки в специальном боксе. Перед каждой серией посевов проводят контроль зараженности воздуха в боксе спорами грибов седиментационным методом, для чего 1-2 чашки со средой оставляют открытыми в течение 3-х мин.

5.3.1. Стерилизацию бокса, рабочего помещения проводят парами формальдегида с последующей нейтрализацией водным аммиаком. На 1 м^ объема помещения расходуют 45 см3 40%-ного формальдегида, к которому добавляют 20 см3 воды и 30 г марганцовокислого калия. Дезинфекцию проводят в течение 2 ч, после чего для нейтрализации паров формалина применяют водный аммиак из расчета 50% от объема затраченного формальдегида. В целях безопасности целесообразно дезинфекцию провести в конце рабочего дня, -утром следующего дня -нейтрализовать пары формалина. Термостат, холодильник можно дезинфицировать, поместив 2-3 чашки Петри без крышек с формальдегидом на 3 ч, не добавляя марганцовокислый калий, или обработкой их внутренних поверхностей спиртом.

Обеззараживания воздуха бокса, рабочего помещения можно провести также используя ультрафиолетовые облучатели (типа УГДЗ) с источником излучения -лампы ДРТ 1000 с экспозицией 2 ч, Необходимо соблюдать осторожность при

чашках учтено 60 колоний) суммарное число грибов равно:

60    60

-------------=г-------= 30000 KOEJz

0,001 ■ 2    0,002

5.4.1.2. Если в посеве взвеси 1 (разведение 10 а также в последующих разведениях роста грибов не выявлено, то количество КОЕ обозначается как <10 в 1 г корма.

Методические указания разработаны Всероссийским научно-исследовательским институтом ветеринарной санитарии, гигиены и экологии.