ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ЖИВОТНЫХ

ВЕТЕРИНАРНАЯ

МЕДИЦИНА

• САНКТ-ПЕТЕРБУРГ • •МОСКВА-• КРАСНОДАР--2015-

372    Лабораторная    диагностика    вирусных    болезней    животных

................................................................................I...............................................................................................................................................

Схема 5 Определение серотипа вирусов ВВС и БЭС

Компоненты Сыворотки к типам вирусов Без 0-72 Т-75 С-72 А-48 ротки Испытуемый антиген ОД ОД ОД ОД ОД Типоспецифическая сыворотка од од ОД 0,1 - Комплемент од од од ОД од Физиологический раствор - “ - од Водяная баня при 37°С, 30 мин Гемсистема 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 Водяная баня при 37°С, 30 мин Учет результата ++++ - - - -

Учет РСК проводят по 100%-ному гемолизу. Главный опыт ставят по схеме 5.

Учет результатов проводят по схеме 6.

3.4. Положительной РСК считается в том случае, когда наблюдается 100%-ная или 75%-ная задержка гемолиза (четыре-три креста) в присутствии одной из типоспецифических сывороток и антигена из испытуемого материала при полной задержке гемолиза в контрольных пробирках с соответствующими специфическими антигенами и сыворотками и при полном гемолизе в пробирках с контрольным — нормальным антигеном и гетерологичными сыворотками.

При получении сомнительного результата (один-два креста) РСК повторяют.

При получении повторного сомнительного результата реакцию считают положительной.

При получении отрицательного результата в РСК (тепловой вариант с учетом по 100% -ному гемолизу) проводят постановку модифицированной РСК с регистрацией результатов фотоэлектроколориметрией.

Лабораторная диагностика вирусных болезней животных

lllllllUI|[IUllHIIHIIUMinillllll|nU[IIIIIIIIIIIUHtlllllHIUIIII№lllillltfllinitminnirnHlllMIIIIIIIIH«HllllllltlllllHIIIIUMIIWHIIIIi|ll

4, Модифицированный метод РСК с учетом результатов фотоэлектроколориметрии.

4.1.    Данный метод используют для исследования проб патологического материала (везикул и везикулярной жидкости) с низкой комплементсвязывающей активностью. Метод основан на учете результатов гемолиза на спектрофотометре (фотоэлектроколориметре) с нефелометром.

4.2.    Компоненты реакции;

■    испытуемый антиген, приготовленный, как указано в п. 2.2;

а два типоспецифических КС антигена вируса ВВС (0-72 и Т-75);

■    два типоспецифических КС антигена вируса ВЭС (С-72 и А-46);

■    контрольный (отрицательный) антиген;

Я две типоспецифические КС сыворотки к вирусу ВВС (0-72 и Т-75);

Я две типоспецифичеекие КС сыворотки к вирусу ВЭС (С-72 и А-48);

■    три типоспецифичеекие сыворотки к вирусу ящура типов А, О и С;

■    две типоспецифические сыворотки к вирусу везикулярного стоматита типов «Индиана» и «Нью-Джерси»;

■    контрольная (отрицательная) сыворотка;

■    гемолизин;

■    комплемент;

■    эритроциты барана, приготовленные на вероналовом буфере;

Ш физиологический раствор.

4.3.    Приготовление стандартной суспензии эритроцитов. Эритроциты барана 3...4 раза отмывают и из осадка готовят 0,6.,.0,7%-ную взвесь на вероналовом буфере. Стандартную взвесь готовят по следующей схеме:

№ пробирок	Суспензия отмытых эритроцитов <№|)	Веронало-вый буфер (мл)	Физиологический раствор	Оптическая плотность
1	0,26	1,76	3,0	0,51
2	0,26	1,76	3,0	0,60
3	0,26	1,76	3,0	0,49

5. Болваны свиней    375

.....................................................................................................................................................................................

В РСК используют взвесь эритроцитов, в которой средний показатель оптической плотности должен быть равен 0,50,

4,3.1, Примечание: Состав вероналового буфера:

■    барбитуровая кислота — 2,875 г;

■    барбитурат натрия— 1,875 г;

■    сернокислый магний 0,616 г;

■    хлористый кальций —- 0,080 г;

Я хлористый натрий — 45,5 г;

Я дистиллированная вода — 2 л.

Вначале в мерной колбе на 2 л растворяют барбитуровую кислоту в 500 мл подогретой дистиллированной воды, а затем все остальные компоненты с добавлением воды до метки. Раствор стерилизуют автоклавированием при 110°С в течение одного часа. Хранят до 2 мес. при 4°С, Перед употреблением разбавляют 2:3 дистиллированной водой.

4.4.    Гемолитическая система. Готовят разведение гемолизина соответственно удвоенному его титру в обычной РСК, Смешивают равные объемы раствора гемолизина и стандартной суспензии эритроцитов. Смесь выдерживают в течение 15 мин при комнатной температуре.

4.5.    Титрование комплемента проводят трехкратно. Комплемент разводят 1:200 и титруют по следующей схеме:

Комплемент 1:200	0,20	0,25	0,30	0,35	0,40	0,45	0,50	0,55	0,66
Веронал овый буфер	1,3	1,76	1,20	1,16	1,10	1,05	1,00	0,95	0,90
30 мин при 5Т6С на водяной бане
Гемсистема	0,5
Физ. раствор	3,0

Учет результатов.

Полученные результаты наносят на миллиметровую бумагу и находят точку, соответствующую 50% -ному гемолизу эритроцитов (ОП = 0,25). В опыт берут 1,2 СН₅₀ комплемента.

4.6. Постановка основного опыта. Готовят двукратные разведения испытуемого антигена от 1:5 до 1:400, а далее

376    Лабораторная    диатостика    вирусных    болезней    животных

HlllllllllllHllllllllll^ll1lllllllUllllliniMllinilllHIIIHIUllJiHIIIUIIt1H|l|IJnitrillllllilll1illllllttl|llllll|[|j|IIIIIJlllMll«talllllllllllllhllllJinillllllllllllHlllJJIIIIICr|k|ll«llliyilinil(ll!IIIHMIIIII^IU^lll

в зависимости от примерной исходной активности антиге-на. Разливают по 0,5 мл каждого разведения антигена. Количество пробирок зависит от числа специфических сы-вороток, взятых в опыт. Вносят по 0,5 мл рабочего разведения сывороток согласно титру в обычной РСК. Добавляют комплемент в рабочем разведении и инкубируют при 37°С в течение 30 мин. Затем вносят по 0,5 мл гемсисте-мы, выдерживают снова 30 мин при 37°С и проводят учет реакции.

4.7.    Учет реакции. В левый кюветодержатель ФЭКН-57 ставят кювету с буфером, а в правый кюветодержатель — кювету с измеряемой пробой. Вращением правого барабана устанавливают стрелки прибора на нуль. Проводят отсчет показания прибора по правому барабану. Разница показания прибора на 0,15 и более между опытной пробиркой и контрольной — на антикомплементарность антигена + сыворотки, принимается за положительный результат. Разница 0,10...0,14 — за сомнительный, 0,10 и ниже — за отрицательный результат.

4.8.    Настройку прибора ФЭКН-57 и измерение проводят по инструкции, прикладываемой к прибору.

Для измерения использует фотоэлектроколориметр с нефелометром. Учет результатов проводят с использованием кюветы на 10 мм при переключении на нефелометриче-ское измерение с красным светофильтром (№ 8).

При малых объемах материала объем каждого реагента можно уменьшить до 0,25 мл, добавить физраствора 1,6 мл. Измерение при этом проводят в кюветах на 5 мм.

5. Выявление типослецифического антигена в патологическом материале методом РДП.

5.1. Для постановки РДП используют 1,5%-ный агар, приготовленный на дистиллированной воде с добавлением 1,6% хлористого натрия. Для сохранения агара к нему добавляют 10% -ный раствор фенола из расчета 50 мл раствора на 1 л агара и 0,03 г мертиолята. Такой агар хранится в течение двух месяцев. Перед постановкой реакции его разливают в чашки Петри и штампом делают лунки (диаметр лунок 5 мм, расстояние между лунками 5 мм).

6. Болезни сейма    377

шл1№1»иимш1Н№1 niiiiiiH iHi« пин гпнипнпши ........ мини

5.2.    Компоненты реакции:

■    испытуемые антигены, приготовленные, как указано в п. 2.2;

■    два контрольных типоспецифических антигена штаммов ВБС (0-72 и Т-75);

Л контрольный типоспецифический антиген штамма ВЭС (С-72);

к две типоспецифические сыворотки к штаммам ВБС{0- 72 и Т-75);

■    типоспецифическая сыворотка к штамму ВЭС (С-72);

■    типоспецифические сыворотки к 7 типам вируса ящура.

5.3.    Постановка реакции. В центральные лунки вносят испытуемый и контрольный антигены, в периферические — типоспецифические сыворотки. Чашки инкубируют при 37°С. Учет реакции проводят через 24, 48 и 72 ч.

5.4.    Учет реакции. Положительная реакция характеризуется образованием четкой, белого цвета одной или двух линий преципитации между антигеном и гомологичной сывороткой.

Возбудитель относят к тому виду (типу), с сывороткой которого испытуемый антиген дает положительную реакцию.

6. Выделение вируса в культуре клеток.

6.1. Для выделения вируса используют перевиваемую (ПП) или первично-трипсинизированную культуры клеток почки поросенка. Для заражения используют 10%-ную взвесь из стенок везикул, приготовленную, как указано в п. 2.3.

Одной исследуемой пробой заражают не менее 4...6 пробирок или флаконов с культурой клеток, внося в каждую пробирку по ОД мл (во флакон — по 0,5 мл) взвеси, предварительно удалив из пробирок питательную среду и промыв культуру клеток раствором Хенкса.

Пробирки выдерживают в течение 60 мин при комнатной температуре, после чего в них добавляют поддерживающую питательную среду (0,9 мл в пробирки, 10 мл — во флаконы) и инкубируют в течение 3...5 сут, не меняя

Лабораторная диагностика вирусных болезней животных

среды. Для контроля оставляют 4...6 пробирок с незара-женной культурой клеток.

6.2.    Поддерживающая среда состоит из раствора Хенкса с 0,5% -ным гидролизатом лактальбумина с добавлением по 200ЕД/мл пенициллина и стрептомицина, с pH 7,2,..7,4.

6.3.    Учет реакции. Для выявления цитопатического действия вируса в зараженных культурах их ежедневно просматривают под малым увеличением микроскопа в течение

3...5 дней. При наличии вируса ВВС или БЭС в исследуемом материале ЦПД обнаруживается через 24...48 ч. Оно характеризуется мелкоклеточной деструкцией по всему мо-нослою с последующим образованием мелких конгломератов и отслоением от стекла. Для вируса ВЭС характерно появление светопреломляющих округлых клеток по всему монослою с последующим образованием гроздевидных скоплений, которые затем также отслаиваются от стекла.

6.4.    При наличии ЦПД-вируса на два креста (деструкция 50% клеток) проводят его идентификацию в РСК (как описано в п. 3) или в реакциях нейтрализации и иммунофлуоресценции.

7. Идентификация выделенного вируса с помощью метода иммунофлуоресценции (прямой вариант).

7.1.    Метод иммунофлуоресценции используется только для идентификации вируса ВЭС,

7.2.    Выделенный вирус выращивают в культуре клеток на покровных стеклах. При появлении ЦПД (через 6..,8 ч инкубации) покровные стекла вынимают из пробирок и многократно отмывают фосфатно-буферным раствором, затем стекла подсушивают на воздухе и фиксируют метиловым спиртом в течение 5 мин.

7.3.    Для выявления вируса ВЭС используют специфическую флуоресцирующую сыворотку в рабочем разведении. Для контроля используют нормальную флуоресцирующую сыворотку в том же разведении.

7.4.    Проведение реакции. Фиксированные препараты многократно отмывают фосфатно-буферным раствором, высушивают на воздухе в течение 10...20 мин и обрабатывают флуоресцирующей сывороткой. Для контроля одно-

5. Болезни свиней    379

......................................................................................................................................................................................

типные препараты обрабатывают нормальной флуоресцирующей сывороткой. Препараты помещают во влажную камеру и выдерживают в течение 30 мин при 37°С. Окрашенные препараты многократно промывают фосфатно-буферным раствором, высушивают на воздухе, покрывают эабуференным глицерином (9:1) и покровным стеклом и микроскопируют.

7.5.    Оценка результатов. Положительной считается реакция, при которой в препарате наблюдается специфическое флуоресцирующее свечение клеток или цитоплазмы клеток не менее чем на два креста в трех и более полях зрения.

7.6.    В сомнительных случаях окончательный диагноз на ВЭС ставят по результатам PH.

8. Идентификация и серотипирование выделенного вируса ВВС и ВЭС в реакции нейтрализации.

8.1.    Идентификацию и серотипирование выделенного вируса проводят с помощью типоспецифических вирусней-трализующих сывороток:

■    две сыворотки к вирусам ВВС (к штаммам 0-72 и Т-75);

■    две сыворотки к вирусам ВЭС (к штаммам С-72 и А-46).

8.2.    При необходимости дифференциации выделенного вируса от вируса ящура и вируса везикулярного стоматита в PH дополнительно используют сыворотки к указанным вирусам.

8.3.    Постановка реакции. Выделенный вирус в культуре клеток отстаивают при комнатной температуре (20°С), затем центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин и иадосадочную жидкость используют для постановки PH, Из надосадочной жидкости готовят десятикратные разведения (от 10^-1 до 10~^б) на 0,5%-ном гидролизате лактальбу-мина и к 0,5 мл каждого разведения добавляют такой же объем типоспецифической сыворотки. В реакции используют в четырехкратном титре сыворотки, инактивированные при температуре 57°С в течение 30 мин. Смесь встряхивают, выдерживают при комнатной температуре в течение 60 мин. Затем по 0,2 мл каждой смеси вносят в пробирки с культурами и доливают в них поддерживающую среду до

Лабораторная диагностика вирусных болезней животных

объема 1 мл. Перед заражением проводят однократное от* мывание монослоя поддерживающей средой.

8.3.1.    Контроли:

■    незараженная культура клеток;

и культура клеток, зараженная выделенным вирусом в

разведении от 10"¹ до 10 ^е;

■    культура клеток, в которую внесены типоспецифиче-

ские сыворотки в разведении 1:10.

Культуры клеток инкубирует при 37°С и ежедневно просматривают под микроскопом.

8.4. Учет реакции. Культуры просматривают в течение 3...5 дней до выявления ЦПД в пробирках с культурой, зараженной вирусом.

По выявлении ЦПД определяют титр инфекционности выделенного вируса (предельное его разведение, которое вызывает ЦПД в 50% зараженных пробирок не менее, чем на два креста).

Предельное разведение вируса, дающее ЦПД, обозначают как одну дозу ТЦД_Б0 (титр высчитывают по методу Рида и Менча). Индекс нейтрализации высчитывают по разности показателей ТЦД₅₀ выделенного вируса в присутствии типоспецифических сывороток и определяют серотиповую принадлежность вируса.

0. Ретроспективная диагностика.

9.1.    Для ретроспективной диагностики исследуют парные или однократко отобранные сыворотки переболевших животных. Сыворотки исследуют на наличие антител с помощью типоспецифических антигенов в РСК, РДП или PH.

9.2.    Реакция связывания комплемента. РСК проводят в варианте длительного связывания.

Компоненты реакции:

■    типоспецифические антигены ВВС (штаммы 0*72 и Т-75);

■    типоспецифические антигены ВЭС (штаммы С-72 и А-48);

■    контрольный отрицательный антиген;

■    типоспецифические сыворотки к штаммам (0-72, Т-75,

С-72 и А-48);

■    контрольная отрицательная сыворотка;

■    испытуемые сыворотки, инактивированные;

5, Башни свиней    381

UiU№i|jUIUItniWllUIUILIUlLUIIILllU4Lll4l(UUU4IIUtlllbHIUUIIllllllllUIIUiLUUkHIUIIHI№tkUtllHIUIM1UIHnilUllaHI4mHI]tkU№ilMHIItUI№l)l|^lllimilUnillllhlMltlllHiaMmtnlllltlUHlllll

■    гемолизин к эритроцитам теленка;

■    комплемент.

9.3.    В РСК используют 3%-ную взвесь эритроцитов теленка и гемолизин соответственно к ним. Комплемент использует биофабричного производства, Тшюспецифические антигены предварительно титруют с соответствующими типоспецифическими сыворотками для определения рабочего разведения, как указано в п. 3.7.

9.4.    Для дифференциации везикулярного стоматита и ящура при исследовании сывороток используют соответствующие антигены.

9.5.    Схема постановки главного опыта при ретроспективной диагностике.

Ингредиенты	Количество <мл)
Испытуемая сыворотка в двукратных разведениях, начиная с 1:4 до 1:32	од
Антиген в рабочем разведении	ОД
Комплемент в рабочей дозе	ОД
Выдерживают при 4°С в течение 18 ч
Гемсистема	0,2
Выдерживают на водяной бане при ЗТ*С 30.-40 мин
Учет реакции J

9.6. Схема учета главного опыта при ретроспективной диагностике.

Ингредиенты		Разведение сывороток
Сыворот ки	Антигены	1:4	1:8	1:16	1:32
От больного животного в остром периоде	1. Типоспецифический антиген штамма 0-72	++++	-и-	0	0
	2. ТипоспецифическиЙ антиген штамма Т-76	++	+	0	0
	3. Типоспецифический антиген штамма С-72	0	0	0	0
	4. Типоспецифический антиген штамма А-48	0	0	0	0

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ЖИВОТНЫХ

Составители:

П. И. Барышников,

В. В. Разумовская

Издание второе, исправленное

ДОПУЩЕНО

Министерством сельского хозяйства РФ в качестве учебного пособия для студентов вузов, обучающихся по направлению подготовки ('специальности,) «Ветеринарий»

ДОПУЩЕНО

УМО вузов РФ по образованию в области зоотехнии и ветеринарии в качестве учебного пособия для студентов вузов_г обучающихся по направлению подготовки (специальности) «Ветеринарий» (квалификация (степень) «Ветеринарный врач»)

ЛАНГ

• САНКТ-ПЕТЕРБУРГ • МОСКВА * КРАСНОДАР * •2015-

382    Лабораторная    диагностика    вирусных    болезней    животных ........................................................................................................................................................ Itlllf...............................

Ингредиенты Разведение сывороток Сыворот ки Антигены 1:4 1:8 1:16 1:32 Б. Контрольный (отрицательный) антиген 0 0 0 0 6. Без антигена (контрольная сыворотка на антикомплементарность) 0 0 0 0 От рекон- валес- 1. Типоспецифический антиген штамма 0-72 ++++ ++++ ++++ ++ цента 2. Типоспецифический антиген штамма Т-76 ++++ ++++ ++ 0 3, Типоспецифический антиген штамма С-72 0 0 0 0 4. Типоспецифический антиген штамма А-48 0 0 0 0 б. Контрольный (отрицательный) антиген 0 0 0 0 6. Без антигена (контрольная сыворотка на антикомплементарность) 0 0 0 0

Ретроспективный диагноз считается положительным при двукратном нарастаний титра специфических антител к вирусу ВВС или ВЭС.

9.7,    Реакция диффузионной преципитации. Для исследования в РДП используют парные пробы сывороток и типоспецифические антигены ВВС (штаммы 0-72 и Т-75), ВЭС (штаммы С-72 и А-48), ящура (А, О, С, Сат-1, Сат-2, Сат-3 и Азия-1), а также контрольные положительные и контрольные отрицательные сыворотки. Постановку и учет РДП проводят, как указано в пп, 4,3 и 4.4.

9.8.    Реакция нейтрализации. Для реакции нейтрализации используют парные сыворотки свиней и вирусы ВВС (штаммы 0-72 и Т-75), ВЭС (штаммы С-72 и А-48) и вирусы ВС и ящура (7 серотипов). Испытуемые сыворотки инактивируют и разводят от 1:8 до 1:64, Вирусы предварительно титруют в культуре клеток и используют в PH в дозе 1000 ТЦД₅₀ в 1 мл. Постановку реакции проводят общепринятым методом.

ББК 48.7я73 Л 12

Л12 Лабораторная диагностика вирусных болезней животных / Сост, П. И. Барышников, Б. В. Разумовская: Учебное пособие. — 2-е изд., испр. — СПб,: Издательство «Лань», 2015.— 672с,: ил, — (Учебники для вузов. Специальная литература).

ISBN 978-5-8114-1882-4

Учебное издание содержит действующие методические указания, наставления и инструкции по лабораторной диагностике вирусных болезней животных, утвержденные Министерством сельского хозяйства СССР, РФ и Россельхознадзором РФ. Документы систематизированы по видам животных, в большинстве прошли многолетнюю аппробацию в Алтайской краевой ветеринарной лаборатории и включены в «Перечень нормативной документации, разрешенной для использования в государственных ветеринарных лабораториях при диагностике болезней животных, рыб, пчел, а также контроля безопасности сырья животного и растительного происхождения» (по состоянию на июль 2011 г.). Приводятся предметный указатель и библиографический список.

Предназначено для студентов, обучающихся по специальности «Ветеринария» и направлению «Ветеринарно-санитарная экспертиза», ветеринарных врачей и лаборантов ветеринарных лабораторий.

ББК 48.7я73

Рецензенты:

Я. Я. ГУСЛАВСКИЙ — доктор ветеринарных наук, профессор кафедры микробиологии, эпизоотологии, паразитологии и ВСЭ Алтайского государственного аграрного университета;

В. Я. ПЛЕШАКОВА — доктор ветеринарных наук, профессор, зав. кафедрой ветеринарной микробиологии, вирусологии и иммунологии Омского государственного аграрного университета им. П. А. Столыпина;

В. А СИНИЦЫН — доктор ветеринарных наук, зав. отделом ФГБУ «Новосибирская межрегиональная ветеринарная лаборатория*.

Обложка © Издательство «Лань», 2015 Е. А. ВЛАСОВА © Коллектив авторов, 2015 © Издательство «Лань»,

художественное оформление, 2015

366    Лабораторная    диагностика    вирусных    болезней    животных

IlNlllllllllll.................................................................................................................................................IIIIHII.....II............................................

ВЕЗИКУЛЯРНАЯ БОЛЕЗНЬ И ВЕЗИКУЛЯРНАЯ ЭКЗАНТЕМА

5.13,

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

по лабораторной Диагностике

ВЕЗИКУЛЯРНОЙ БОЛЕЗНИ И ВЕЗИКУЛЯРНОЙ ЭКЗАНТЕМЫ СВИНЕЙ (утверждены 16 июня 1979 г., б/н)

1. Общие положения.

1.1. Лабораторная диагностика везикулярной болезни (ВВС) и везикулярной экзантемы синей (ВЭС) заключается в:

■    обнаружении антигена в патологическом материале (везикулы, везикулярная жидкость) методами реакции связывания комплемента (РСК), реакции диффузионной преципитации (РДП);

■    выделении возбудителя из патологического материала в культуре клеток и его идентификации в серологических реакциях: иммунофлуоресценции (ИФ), РСК или реакции нейтрализации (PH);

■    выявлении антител в крови больных и переболевших животных (ретроспективная диагностика) в одной из серологических реакций РСК, РДП, PH;

я биологической пробе;

я исследовании физико-химических свойств выделенного вируса.

367

I III 1111 МИН j)l Hill II III! I Hill lillllfl ШИН Hill ......Illllllllllllllll

1.2.    При диагностике везикулярной болезни и везикулярной экзантемы проводят дифференциацию везикулярного стоматита и ящура в РСК или РДП и биологической пробе с использованием сопутствующих каждой инфекции диагностических наборов, выпускаемых биологической промышленностью.

1.3.    Лабораторный диагноз на везикулярную болезнь и везикулярную экзантему свиней ставят на основании положительных результатов исследования патологического материала на обнаружение антигена с помощью одной из'серологических реакций (РСК, РДП) или выделения возбудителя в РСК или PH или установления двукратного нарастания титра антител в организме животных с учетом эпизоотоло-гических и клинических данных.

1.4.    Для постановки лабораторного диагноза методом обнаружения антигена в патологическом материале требуется 1...3 дня, для выявления вируса и его идентификации — до 10 дней, для выявления прироста антител в крови животных — от 2 до 4 недель,

2. Взятие и подготовка материала для исследования.

2.1.    В лабораторию для исследования направляют стенки невскрывшихся везикул и везикулярную жидкость от

2...5 больных животных в количестве не менее 2 г. Везикулы от свиней берут с кожи «пятачкавенчика, мякишей или вымени, предварительно промыв эти участки кожи водой с антибиотиками (1000 ЕД пенициллина и стрептомицина на 1 мл). Стенки везикул срезают ножницами, помещают во флакон или пробирки, опечатывают и в термосе со льдом направляют в лабораторию с нарочным.

Для ретроспективной диагностики на исследование направляют пробы крови от 5... 10 переболевших животных.

2.2.    В лаборатории везикулы отмывают физиологическим раствором, растирают в ступке и добавляют 1:5 фосфатно-буферный раствор с pH 7,2...7,4. После двукратного замораживания и оттаивания взвесь центрифугируют при 10 000 об/мин на холоде в течение 30 мин. Надосадочную жидкость исследуют в РСК на наличие антигена. Для РДП используют неразведенную везикулярную жидкость из

Лабораторная диагностика вирусных болезней животных

невскрывшихся везикул или 35...50%-ную взвесь на физиологическом растворе из стенок везикул.

2.3. Для выделения вируса в культуре клеток готовят 10%-ную взвесь из везикул на фосфатно-буферном растворе или питательной среде и, не подвергая замораживанию и оттаиванию, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин. В надосадочную жидкость добавляют антибиотики по 1000 ЕД/мл пенициллина и стрептомицина и используют для заражения.

3. Обнаружение типоспецифического антигена в патологическом материале в РСК.

3.1.    Компоненты реакции:

■    испытуемый антиген, приготовленный, как указано в п. 2.2;

■    два типоспецифических комплементсвязывающих (КС) антигена вируса ВВС (0-72 и Т-75);

■    два типоспецифических КС антигена вируса БЭС (С-72 и А-48);

■    контрольный (отрицательный) антиген;

■    две типоспецифических комплементсвязывающих сыворотки к вирусу ВВС (0-72 и Т-75);

■    две типоспецифических КС сыворотки к вирусу БЭС (С-72 и А-48);

■    контрольная (отрицательная) сыворотка;

■    гемолизин;

■    комплемент;

■    эритроциты барана (2% -ная взвесь).

3.2.    Испытуемый антиген исследуют в двукратных разведениях, остальные антигены и сыворотки — в удвоенном титре.

3.3.    Постановка реакции: реакцию ставят в пробирках, титрование гемолизина и комплемента проводят в объеме 2,5 мл, а основной опыт — в объеме 0,5 мл.

РСК проводят в четыре этапа: титрование гемолизина, титрование комплемента, титрование антигенов и сывороток в присутствии комплемента и постановка главного опыта.

369

lltlllHIIIIIIIIIIIIIIIIIIILIIIIIJIfllllllllllllllllllFIIIIIIIII»l|IHIHIIIiri1|l1MNII1IHlV|ll7«lltlirNljlllllllllllHIIIIIIJIIIIIIIIIinilllllllllllH!lllirillllllllClllllli|F|l|||||

3.3.1. Титрование гемолизина. Для титрования гемолизина готовят основное его разведение 1:100 (0,2 мл гемолизина и 9,8 мл физиологического раствора, с учетом того, что гемолизин в ампуле разведен глицерином), затем — раз-ведение 1:1000 и из этого разведения готовят все последующие по схеме 1.

Титром гемолизина считают наивысшее его разведение, дающее полный гемолиз эритроцитов.

Рабочим разведением гемолизина считают четырехкратную концентрацию его предельного титра с учетом консервирования глицерином.

Например, если предельный титр гемолизина 1:4000, рабочее разведение его составит 1:1000, то берут его в соот-

Схема 1 Приготовление разведений гемолизина

Необходи мые ч. разведения Компоненты 1:1500 1:2000 1:3000 1:4000 1:5000 1:6000 Гемолизин 1:1000 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Физиологический 0,5 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 раствор

Схема 2

Титрование гемолизина

Разведение ^гемолизина Компоненты 1:1000 1:1500 1:2000 1:3000 1:4000 1:5000 Гемолизин 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Физиологический раствор 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Комплемент 1:20 0,5 0,5 0,5 0,5 0.5 0,5 Эритроциты 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 -Встряхивают, помещают на водяную баню при 37° С на 30 мин Учет степени гемолиза 0 0 0 0 + ++++

Примечание: 0 — полный гемолиз; ++++ — полная задержка.

Лабораторная диагностика вирусных болезней животных

ношении 2:1000 (0,2 мл гемолизина и 99,8 мл физиологического раствора).

Для приготовление гемсистемы используют гемолизин в рабочем разведении и смешивают с равным количеством 2%-ной взвеси эритроцитов и выдерживают при комнат-ной температуре в течение 10...15 мин.

3.3.2. Титрование комплемента. Комплемент титруют в разведении 1:20 в различных дозах по схеме 3.

Схема 3 Титрование комплемента

Компоненты реакции Процентное содержание комплемента в дозах 0,6 I 1,6 2 2,6 3 3.6 4 Комплемент 1:20 0,06 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 Физиологический раствор 1,45 1,4 1,35 1,3 1,25 1,2 1,15 U Гемолизин в рабочем разведении 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Эритроциты 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Выдержать на водяной баке при 37°С 15 мин Учет результата ++++ ++ + 0 0 0 0 0

Титром комплемента считают наименьшее его количество, при котором наступает полный гемолиз эритроцитов. Для титрования антигенов, сывороток и постановки главного опыта используют 2 дозы комплемента, которые соответствуют пробирке, находящейся через одну пробирку вправо от последней пробирки с полным гемолизом.

По схеме 3 полный гемолиз дают 2% комплемента, следовательно, рабочей дозой комплемента является разведение с содержанием 3% комплемента. Разведение готовят из цельного комплемента.

Например, по схеме 3 в опыт на 100 пробирок требуется 10 мл разведенного комплемента, для этого берут 0,3 мл цельного комплемента и добавляют 9,7 мл физиологического раствора.

371

......................................

3.3.3. Титрование типоспецифических антигенов. Титрование антигенов проводят с целью установления рабочей дозы антигена по схеме 4. Типоспецифические сыворотки используют в двойном титре.

Схема 4 Титрование типоспецифических антигенов

X. Разведение \ антигенов Компоненты 1:2 1:3 1:4 1:6 1:8 1:10 1:12 1:16 Антиген типоспецифический 0,1 ОД ОД ОД од од од од Сыворотка типоспецифическая од од ОД од од од од од Комплемент од од од од од од од од Водяная баня при 37°С 30 мин Гемсистема 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 Водяная баня при 37°С 30 мин Учет результата ++++ ++++ +++ + + 0 0 0

Титром антигена считают его наибольшее разведение, давшее со специфической сывороткой задержку гемолиза не менее чем на три креста.

Рабочим разведением антигена считается удвоенный титр антигена. По схеме 4 рабочее разведение антигена будет равно 1:2.

3.3.4. Титрование типоспецифических сывороток проводят по схеме 4, используя разведения их до предельного татра, а антигены — в рабочих разведениях.

3.3.б. Постановка главного опыта РСК. Реакции связывания комплемента ставят в объеме 0,5 мл. Первую фазу реакции (фазу связывания комплемента) проводят на водяной бане при температуре 37°С в течение 20...30 мин. Вторую фазу (фазу выявления) также проводят на водяной бане при температуре 37°С в течение 20...30 мин.