ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ

- САНКТ-ПЕТЕРБУРГ --МОСКВА-‘КРАСНОДАР-■ 301Б -

6, Волыни свиней    303

^miilimniMiLULuwHani'iniiiKMauiMiiiuiNiMMiMinniUiW'iKWiMiinUilMNJillhffiniiknuiitoiHIIHIilUiirtwriH niMiiimu nUri

Так как общий объем комплемента на 100 пробирок должен быть 100 ■ ОД - 10 мл, то к полученному числу неразведанного комплемента добавляют 9,04 мл физиологического раствора. Аналогичным методом высчитывают 1,5 дозы комплемента.

2.4,5. Постановка главного опыта РСК, Реакцию ставят в объеме 0,5 мл. Первую фазу реакции (фазу связывания комплемента) проводят при 4...8°С в течение 16,.,18 ч; вторая фаза (фаза выявления) проходит на водяной бане при температуре 37..,38^аС в течение S0...40 мин (до наступления полного гемолиза эритроцитов в контрольных пробирках).

Разведение компонентов реакции готовят на 0,85% -ном физиологическом растворе. Сыворотки используют в реакции без инактивации.

Для обнаружения антигена классической чумы свиней используют специфическую сыворотку к вирусу этой болезни. В качестве контрол ей используют специфический и нормальный (отрицательный) антигены в рабочих разведениях.

Двукратные разведения испытуемых и контрольных антигенов разливают по 0,1 мл в три ряда пробирок (по 5 в каждом ряду). Затем в пробирки одного ряда добавляют специфическую, а в пробирки другого ряда — нормальную сыворотку по 0,1 мл, В третий ряд пробирок вместо сыворотки наливают по 0,1 мл физиологического раствора. Затем во все пробирки добавляют по 0,1 мл комплемента (1,2 в рабочей дозе), Параллельно ставят необходимые контро-ли (см, схемы 5, 6).

После проведения фазы связывания комплемента при температуре 4„,8*С в течение 18...20 ч добавляют гемолитическую систему по 0,2 мл и выдерживают на водяной бане при температуре 37...38^fiC до наступления полного гемолиза в контрольных пробирках (30...40 мин).

Положительным результатом РСК считают полную задержку гемолиза (+-М-+) или задержку его на три креста (-МН-) испытуемым антигеном в присутствии специфической сыворотки при полном гемолизе в ряду с нормальной сывороткой.

304    Лабораторная    дащностихй    вирусных    бслегней    зкмеошых

*« hll9№|IIUWIHI|IHI^IIIIIIIIIIHIIMU IWUllllWIIMlHIItHUIklHIillkMMM IMIlMlIiailMSaUMIIIUIIiaiHMlHJMMdbmWnmmumHNi

Cite j* £2 5

Схема главного опыта РСК

Антиген к разведениях (по 0>1 мл)	Специфическая сыворотка а раз-ведений 1:16	Нормальная сыворотка в разведен ИИ 1:16	Физиологический раствор (вместо сыворотки)
Испытуемый а нтигсн N® 1
1;2	ОД	ОД	ОД
1:4	од	ОД	од
1:8	од	од	ОД
1:16	од	од	од
1:32	од	ОД	од
Испытуемый антиген Ne 2
1:2	од	ОД	од
1:4	од	од	ОД
1:8	од	од	од
1:16	од	од	од
1:32	0,1	од	од
Специфический антиген в рабочем разведении (1:4)	од	од	од
Нормальный антиген (1:4)	0.1	од	од
Физиологический раствор	од	од	од

Схсжа 6

Примерная схема учета РСК

	Специфическая сы-Коротка ■ разведении 1:16		Нормальная сыворотка в разведении 1;16		Антиген без сыворотки
	Комплемент в рабочих Дола к
	1Д		1,*	1.6	1Л	1.5
Испытуемый ннтш'ен Ni> 1
1:2
1:4
1:8
1:16
1:32

5. Болезни свиней    306 №ЯШЮТЫ№|1ШН||ИН В1ЫИИЩ1 11*1 l4]lk«MIMI1IMIMtiailUlllJ АМЛГ HWtlWINMIJM<HI IMMHmilINHIBIHtHMIlMI II■II1Ш)1II■IIII НИМ Продолжение сА'^л ti ff

Специфическая см* вороткаР раЭъедекшт 1:1В Нормальная сыворотка В разведении 1:1В Антиген ПОЗ СыиоротнН Комплемент а рабочих дозах и* 1,6 1.2 1,6 1,2 Испытуемый антиген Nfi 2 1:2 1:4 j — 1:8 1:16 1:32 Специфический антиген 1:4 Нормальный антиген 1:4 Сыворотка без антигена Контроль комплемента Контроль гсмсисгемы

Сомнительным результатом РСК считают задержку гемолиза испытуемым антигеном в присутствии специфической сыворотки на два (++) креста. При получении сомнительного результата реакцию ставят повторно. При получении дважды сомнительных результатов реакция считается положительной.

3. Биологическая проба.

3.1.    Биопробу проводят для подтверждения диагноза.

3.2.    В каждом отдельном случае на проведение биопробы необходимо иметь разрешение ветеринарного отдела областного (краевого) управления сельского хозяйства, министерства сельского хозяйства автономной республики или главного управления ветеринарии министерства сельского хозяйства союзной республики, не имеющей областного деления,

3-3. Биоиробу проводят под методическим руководством областной (краевой, республиканской) ветеринарной лаборатории в условиях, исключающих возможность рассеивания инфекции и спонтанного заражения опытных свиней.

3,4. Для биопробы отбирают две группы животных: 1-я группа — три подсвинка из благополучного хозяйства, где

Лабораторная диагностика вирусных Селезней животных

животные не вакцинировались против чумы в течение пос-лед них двух лет; 2-я группа — три подсвинка, вакцинированные против чумы за 30 и более дней до постановки на них биопробы,

3.5.    В качестве материала для заражения используют 10%-ную суспензию на физиологическом растворе из органов вынужденно убитых больных животных. В суспензию добавляют антибиотики (пенициллин и стрептомицин по ЮООЕД/мл), выдерживают при температура 2,..4*С в течение Зч, затем дважды ее центрифугируют (первый раз при 3000 об/мин в течение 30 мин, второй — при 8000... ЮОООоб/минв течение 1 ч), Надосад очной жидкостью заражают подсвинков 1-й и 2-й групп (неиммунных и иммунных к вирусу чумы), внутримышечно в объеме 10 мл. За подопытными животными наблюдают в течение 21 дня.

3.6.    Биопробу считают положительной, если все неим-муиные подсвинки (1-я группа) после введения патологического материала заболели и пали, а иммунные (2-я группа) остались здоровыми.

Материал от вынужденно убитых животных биопробы в случае необходимости исследуют в РСК и методом ИФ с целью обнаружения в нем антигена вируса классической чумы свиней.

С утверждением настоящих Методических указаний утрачивает свою силу Временное наставление по лабораторной диагностике чумы свиней методом иммунофлуорес-ценции от 26 января 1971 г.

Печ. цех МСХ СССР, тираж 500 экз.* заказ Ms 1088.

■ШЖ1П11»1П1111111НПШП1Ш1НН1П1Ш1И1НПН1П1Ш11№1П1ШШ111111111И1Н111П11

КРАТКИЙ СЛОВАРЬ ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ВЕТЕРИНАРНЫХ ТЕРМИНОВ

Антигены (нити + греч. genes — порождающий) — чужеродные для организма высокомолекулярные органические вещества коллоидной структуры (белки* белково*липидные и белково-полисахаридные комплексы)* способные при поступлении (вне' дении парентерально) вызывать синтез особых глобулинов-антн-тел и вступать в специфическое взаимодействие с ними.

Антитела (анти. + тело) — противотела — специфические белки (иммуноглобулины)* образующиеся в организме под воз-действием антигенов. Они накапливаются в сыворотке крови и тканях, вступают в специфическую связь с соответствующими антигенами и разрушают или обезвреживают их.

Биологическая проба (биопроба) — один из методов диагностики инфекционных болезней с помощью заражения патологическим материалом подопытных животных (куриных эмбрионов, культур клеток) и их исследования.

Вирцон ~ полноценная внеклеточная вирусная частица.

Вирусовыделение — выделение возбудителей инфекции из организма больного животного или вкрусоносителл.

Внрусоносительство — наличие возбудителя инфекции в определенных органах и тканях клинически здорового животного, не сопровождающееся иммунологической перестройкой организма.

Вирусы (лат. virus — яд) — облигатные внутриклеточные паразиты, отличающиеся от растительных и животных организмов малыми размерами, отсутствием клеточного строе-ния и автономного метаболизма* наличием только одного типа нуклеиновой кислоты и дезъюннтивным способом размножения.

Краткий саоеиръ использованных ветеринарных терминал шннн*wiiUHNHMMitoHiiiMiiiiiiHiiHiiiiaiiiHiMiiiMMiinHiii ikuhihi мы мшшн iuhimii

В. беэоболочечные — вирусы, в структуре которых отсутствует липопротеидная оболочка,

В. оболочечные — вирусы, в структуре которых присутствует липопротеидная оболочка,

Енрусоскопия (вирусы I- shopeo — смотрю, наблюдаю) — метод микроскопического изучения морфологии вирусов,

Гемагглютинация (греч. haitna — кровь +■ agglutinatio — склеивание) — склеивание и выпадение в осадок эритроцитов под воздействием вирусов, бактерий, токсинов идр., способных адсорбироваться на поверхности эритроцитов, а также ге* м агглютининов,

Гептадсорбция {греч. halma — кровь + ad$vrbtto — поверхностное поглощение) — способность культур клеток, зараженных вирусами, адсорбировать эритроциты различных животных, что объясняется включением в плазматическую мембрану синтезирующихся вирусных белков.

Диагностика (греч. diagnoatihoe — способный распознавать) — раздел клинической ветеринарии о методах исследования животных для распознавания их болезней и состояния организма с целью назначения необходимого лечения и профилактических мероприятий.

Диагностический набор — набор стандартных препаратов, используемых для постановки диагноза (антиген, специфическая и контрольная сыворотки идр.).

ДНК-эоидов метод — метод генодиагностики, основанный на способности меченой однсцепочечной молекулы ДНК взаимодействовать с комплементарной ей молекулой нуклеиновой кислоты определенного вируса с образованием двух цепочечной структуры.

ДИК-содерисащие вирусы — вирусы, имеющие один тис нуклеиновой кислоты — ДНК, у большинства она представлена двухцелочечной структурой, у некоторых — одной цепью.

Идентификация (лат. tdenttftco — отождествляю) — признание тождественности, опознание-определение видовой (типовой) принадлежности микроорганизма на основании всестороннего изучения его свойств.

Иммуноферментный анализ — группа методов, позволяющих выявлять комплекс антиген — антитело с помощью субстрата, который расщепляется ферментом {пероксидапой, щелочной фосфатазой идр.)с появлением окрашивания.

Инактивация вирусов (лат, inactivuv — неактивный) — уничтожение инфекционной активности вирусов путем повреждения генома физическим или химическим воздействием.

656    Лабораторная    диагностика вирусных болезней животных

*|НПШ||«ШВ№Ч1Ч*>№1Ш1ЛвиЦМИ1 UH шпмпинтякинпц Р» M4IPHM|liailllLHWHMini|IIUH>H| HMIMIIII 1| IIHIIDIMIinaillMIU

Индикация возбудителя инфекции (лат. indtcatio — указание) — выявление к идентификация патогенных микроорганизмов в различных объектах.

Инокуляция возбудителя (лат. tnaculatio — прививка) — введение возбудителя путем инъекции (искусственное заражение или внесение его в организм животного членистоногими переносчиками при укусах).

Консервирование вирусов (лат. conservare — сохранять) — общее название методов воздействия физическими и (или) химическими факторами на какие-либо объекты с целью длительного сохранения в них вирусов.

Контаминация (лат. contaminatio — смешение) — обсеменение поверхности тела животного, предметов ухода, почвы, воды, кормов, биопрепаратов и других объектов патогенными микроорганизмами.

Культивирование вирусов — выращивание вирусов в искусственных условиях.

Культуры клеток (клеточные культуры) — клетки многоклеточного организма, живущие вне его в искусственно созданных условиях среды.

Куриный эмбрион — оплодотворенное куриное яйцо, выдержанное в инкубаторе.

Лабораторные животные — животные, используемые в лабораториях при проведении исследований (мыши, крысы, кролики, морские свинки, хомяки, голуби и др.).

Лиофнлизация (греч. 1уо — растворяю + phileo — люблю) — высушивание предварительно замороженного материала в глубоком вакууме.

Моноклональные антитела — строго специфические антитело, способные выявить минимальные различия в химическом составе и пространственной конфигурации молекул, являются продуктом отдельных клонов антителопродуцирующих клеток.

Парные сыворотки — сыворотки, взятые в самом начале заболевания и 2...3 недели спустя. Повышение титра антител в 4 раза и более считается основой положительной реакции.

Пассаж (фр. passage — переход) — последовательное заражение восприимчивых объектов (животные, куриные эмбрионы, культуры клеток) микроорганизмами.

Полимеразная цепная реакция (от англ. Polymerase Chain Reaction, ПЦР) — метод генодиагностики, основанный на многократном увеличении копий строго определенных фрагментов

Краткий словарь использованных ветеринарных терминал    657

* щипании II iiniHUimmiHHHUiii nmwiiiwMi>»iim4niHiM^iin^HMiiii<i iinT«i—ичии-и»^—1К.1ЦИ14 ч. h_ipwhihiw

молекулы ДНК вируса при помощи фермента термостабильной ДНК-палимеразы-

Реакция гемагглютинацин (РГА) — метод обнаружения и идентификации вирусов, основанный на способности многих вирусов, обладающих тканевым тропизмом, агглютинировать эритроциты определенных видов животных.

Реакция иммунофлуоресцсиции (РИФ) (лат. fluoresce ns — светящийся) — серологическая реакция, основанная на взаимодействии антиген — антитело, при этом один из компонентов, участвующий в реакции, связан с флуоресцирующим красителем.

Реакция нейтрализации (PH) — метод идентификации вируса, основанный на феномене потери им ияфекционности в результате взаимодействия со специфическими антителами.

Реакция связывания компементя (РСК) — метод Серологического исследования, основанный на способности образующегося комплекса антиген — антитело связывать комплемент, что выявляется по отсутствию гемолиза при добавлении гемолизина и эритроцитов.

Реакция торможения гемагглютинацин (РТГА) — метод идентификации вируса или выявления противовирусных антител в сыворотке крови, основанный на феномене отсутствия агглютинации эритроцитов вирусом, в присутствии специфических к нему антител.

РНК-содержащие вирусы — вирусы, имеющие один тип нуклеиновой кислоты — РНК, у большинства она представлена одной цепью, у некоторых — двухцепочечной структурой.

Серонариаит — самостоятельная группа внутри определенного вида и серогрулпы (серотипа) микроорганизмов, обусловленная наличием антигенов, отличающихся от антигенов других микроорганизмов этого вида и серогруппы (серотипа), что выявляется с помощью серологических реакций.

Серогруппа (серотип) — самостоятельная группа внутри определенного вида микроорганизмов, обусловленная наличием антигенов, отличающихся от антигенов других микроорганизмов этого вида, что выявляется с помощью Серологических реакций.

Серологические реакции — реакции, широко используемые при постановке диагноза инфекционных болезней, методы обнаружения антител и антигенов в крови и других тканях.

Сыворотка крови (лат, serum — сыворотка + sanguis — кровь) — составная часть крови, представляющая собой плазму, из которой удалены форменные элементы и фибрин в процессе свертывания крови.

Лабораторкал диагностика вирусных болезней животных

Тельца включения — своеобразные морфологические образования* обнаруживаемые в цитоплазме или ядрах клеток определенных тканей при некоторых вирусных инфекциях и состоящие из скопления вирионов н вирусных белков.

Термолдбилышсть (греч, thermos — теплый + лат, labilis — нестойкий) — неустойчивый к тепловому воздействию, изменяющийся при нагревании.

Термостабильность (греч, thermos — теплый + лат, stefrtffs — неизменный) — сохраняющий свои свойства при нагревании.

Титр вируса — концентрация инфекционных единиц вируса в определенном объеме материала.

Цитопатогенное действие вирусов (ЦПД, цитопатический эффект) — специфическая морфологическая деструкция (разрушение) и функциональная патология зараженных вирусами клеток в культурах.

Штамм (нем. stamm ■— род, корень) — культура микроорганизмов одного вида с одинаковыми морфологическими и биологическими свойствами.

Элементарные тельца — см. Вир ион (2, 3).

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ

СПИСОК

1* Лабораторные исследования в ветеринарии. Вирусные, риккетсиозные и паразитарные болезни : справочник / под рсд. Б. И, Антонова. — М. : Агропромиадат, 1987. — 240 с,

2,    Банулое, И. А Эпизоотологический словарь-справочник / И, А. Бекулов. Г. Г. Юрков, В* А. Ведерников {и др.]. — М.: Россе льхозиз дат, 1986,

3,    Нымм, Э. М. Словарь ветеринарных микробиологических и вирусологических терминов / Э. М. Нымм, К, А. Петерсон, Э. А. Аавер [и др,]. — М.: Росагропромиздат, 1689.

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ЖИВОТНЫХ

Составители:

IL И* Барышников,

В, В. Разумовская

Издание второе, исправленное

ДОПУЩЕНО

Министерством. сельского хозяйства РФ в качестве учебного пособил для студентов врэов< обучающихся по направлению подготовки fcriei+u ильное mu J *Й£1п«!ринарид'»

ДОПУЩЕНО

УМО oi/sofl РФ ло образованию о области зоотехнии и ветеринарии в качестве учебного пособия для студентсо вузов, обучающихся по направлению по&ютовки (специальности} иВегяерииорил»

{квалификация {степень} ^Ветеринарный врач* }

1я&

■САНКТ-ПЕТЕРБУРГ * МОСКВА * КРАСНОДАР ■ •£016■

ПРЕДМЕТНЫЙ

УКАЗАТЕЛЬ

Агар мясо-пептонный (МПА) 101, 109, 126, 326, 387, 444, 466, 476, 483, 542, 688 Альбумин бычий 7, 226, 51S Аппарат Кница 126, 480 Бульон мясо-пептонный (МПБ) 78, 101, 109, 126, 826, 444, 45ff, 475, 455, 496, 542, 555 —    триптозо-фосфатный 5JP Буфер вероналовый 55, 375 —    борат ни й 148 —    фосфатно-солевой 174, 315, $28, 561, 604 —    к а лиЙ'фосфатный ВЫ, 236, 407 —    карбонатно-бинарбонатный 835, 561, 604, 618 Гемолизин 25, 114„ 300, 369,507 Гемолитическая система (гемсистема) 25, 116,216 Жидкость Руге 106, 446 —    Карнуа 108 Иммуноасцитическая жидкость (ИАЖ) 84 Комплемент 27, 116, 216, 300, 370, 607

Метод вирусоскошш 99, 443, 548 —    Кербсрв 66 —    иммуноферментного анализа (ИФА) 88, 159, 173, 228, 233,244, 314,328,336, 349, 406, 409, 436, 561, 603, 609, 617 —    кофал-теста 514 —    перекрестного иммунитета 64 —    полимеразной цепной реакции (ПЦР) 180, 253, 307, 342, 416, 425, €25 —    Рида и Менча 66, 242, 297, 324, 380, 394, 500, 523, 552, 656 —    электронной микроскопии 327, 593 Окраска гнстопрепаратов по Ленцу 80 —    Турбиной 584 —    Турввичу 81,584 —    мазков по Борману “ Гайнуллиной 74 —    Михину 74 —    Морозову 100, 446 —    Муромцеву 73 ” Пашену 100, 447 —    Селлерсу 74 Перевиваемая линия почки свиньи (СПЭВ) 70, 386, 392

---

ББК 48,7я73 Л 12

Л 12 Лабораторная диагностика вирусных болезней животных / Сост. 1L И. Барышников, В. В. Разумовская; Учебное пособие, — 2-е изд„ испр. — СПб,: Издательство «Лань», 2015.— 672с,1 ил.— (Учебники для вузов. Специальная литература).

ISBN 978-5-8114-1882-4

Учебное издание содержит действующие методические указа-пня, наставления и инструкции по лабораторной диагностике вирусных болезней животных, утвержденные Министерством сельского хозяйства СССР, РФ и Россельхоанадзором РФ, Документы систематизированы по видам животных, в большинстве прошли многолетнюю аппробацию в Алтайской краевой ветеринарной лаборатории и включены в «Перечень нормативной документации, разрешенной для использования в государственных ветеринарных лабораториях при диагностике болезней животных, рыб, пчел, а также контроля безопасности сырья животного и растительного происхождения» (по состоянию на июль 2011 г.). Приводятся предметный указатель и библиографический список.

Предназначено для студентов, обучающихся по специальности «Летеринария» и направлению «Ветеринарно-санитарная &чс-перги за*, ветеринарных врачей и лаборантов ветеринарных лабораторий.

ББК 48.7я73

Рецензенты:

И. И. ГУС Л АВС И И Й — доктор ветеринарных наук, профессор кафедры микробиологи», эпизоотологии, паразитологии н BCS Алтайского государственного аграрного университета;

В. И. ПЛЕШАКОВА — доктор ветеринарных паук, профессор, зав. кафедрой ветеринарной микробиологии, вирусологии и иммунологии Омского посударственного аграрного университета им. П. А. Столыпина;

В. А СИНИЦЫ И — доктор ветеринарных наук, зав. отделом ФГБУ «Новосибирская межрегиональная ветеринарная лаборатория*,

Обложка © Издательство «Лань* ,2015 Е. А. ВЛАСОВА © Коллектив авторов, 2016 © Издательство «Лань»,

художественное оформление, 201Ь

5, Беретки свиней    297

«ним tlMMimillHI 1НЧИ11Й1П11 WnMW 111 HllllMMiHI<lBMHWinMirMIIIIIIHMllllllJlklll<>IIHll«l№lll^ll№ltlHI тмими«>мн«

5.2.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ

(утверждены 8 июня 1978 г., б/н)

1. Общие положения.

1.1.    Лабораторная диагностика классической чумы спи-ней заключается в обнаружении в патологическом матери-але специфического антигена методом иммунофлуореоцен-ции, реакции связывания комплемента (РСК), а также в постановке биологической пробы.

1.2.    Лабораторный диагноз на классическую чуму свиней ставят на основании получения положительных результатов ИФ и РСК.

298    Лабораторная    диагностика вирусных болезней животных

Окончательный диагноз устанавливается на основании эпизоотологических, клинических и патологоанатомических данных с учетом результатов лабораторного исследования.

1.3.    Для лабораторной диагностики КЧС в лабораторию направляют патологический материал (кусочки печени* селезенки, подчелюстных, мезентеральных лимфоузлов)* взятый от вынужденно убитых в агональном состоянии животных, у которых в течение 4. „5 дней отмечалось повышение температуры тела. Патологический материал в свежем или замороженном состоянии доставляют в лабораторию. Его можно хранить в замороженном состоянии в течение 8... 10 дней, материал от павших животных к исследованию не пригоден.

1.4.    Метод иммунофлуоресценции и реакцию связывания комплемента для обнаружения специфического антигена в патологическом материале применяют при исследовании материала от невакциннрованных свиней или от свиней, привитых вирус-вакциной против чумы за 30 и более дней до вынужденного убоя* В связи о этик в сопроводительной описи к патологическому материалу указывают дату последней вакцинации свиней.

2. Индикация антигена вируса классической чумы свиней в патологическом материале.

2.1.    Индикация антигена проводится о помощью реакции ИФ (прямой вариант и с применением контрастирующего красителя). Из патологического материала готовят мазки-отпечатки или гистологические срезы. Препараты подсушивают на воздухе и фиксируют метиловым спиртом в течение 3, .,4 мин при комнатной температуре или смесью (1:1) метилового спирта и ацетона, предварительно охлажденной до -10...-204}.

2.2,    Прямой вариант метода ИФ, Флуоресцирующую сыворотку разводят растворителем или забуференнъш физиологическим раствором до рабочего титра н наносят на препараты, которые помещают во влажную камеру (чашка Петри с увлажненным дном) при 37*С на 30 мин. Затем препараты промывают забуферекным физиологическим раствором, подсушивают, наносят забуференный глицерин.

5, Вымани свиней mxiniuiiuiiJili«iwiiniiiaii|HiiiMmiiiMh'MiiiwiwirfiiiiiunHi

Ш 1НШ1|«И11111М1№Н1«111Р11||*[||1Ш1|*№Ш1|НМ|1ЛИ11М111Ч111т

---

покрывают покровным стеклом и исследуют под люминесцентным микроскопом, используя объектив 00, окуляр 5, светофильтры ЗС7-2, ФС8-2, ФС1-2.

2.2.1.    Оценка результатов, ИФ считается положительной при наличии в препаратах округлых клеток с ярко-зеленым свечением цитоплазмы или цитоплазмы и ядра. Специфическое свечение должно быть обнаружено в препарате не менее чем в трех полях зрения при наличии в каждом из них 3,,,5 и более светящихся клеток,

Не учитывают свечения дегенеративно измененных клеток и лейкоцитов, которые отличают по структуре ядра и выраженной гранулярной флуоресценции цитоплазмы.

2.2.2.    Для контроля специфичности свечения наносят на препараты специфическую к вирусу сыворотку с последующей окраской флуоресцирующей сывороткой, а также окрашивают препараты нормальной меченой сывороткой. В контрольных препаратах свечение не отмечается.

2.3.    Реакция ИФ с применением контрастирующего красителя, На препараты накосят смесь флуоресцирующей сыворотки и раствора Эванса голубого (3части сыворотки и 1 часть 0,25%-кого раствора синьки Эванса) и выдерживают при комнатной температуре во влажной камере в течение 10.. Л 2 ч, Затем препарат погружают в подогреты й до60,., 70°С 20%-ный раствор триэтиленгликоля на 30..,90с до появления нежно-голубого оттенка, промывают, подсушивают, заключают в забуференный глицерин под покровное стекло и просматривают под люминесцентным микроскопом.

2.3.1. Оценка результатов. Реакция ЙФ считается положительной, если на оранжево-красном фоне препарата наблюдается светло-зеленое свечение цитоплазмы. Контрольные препараты дают красное свечение. Некротические участки ткани, клеточный детрит светятся зеленовато-желтым цветом, но они отличаются от специфического свечения отсутствием у них клеточной структуры,

2.4.    Реакция связывания комплемента. Для обнаружения в патологическом материале КС-антигена готовят из растертых в ступке органов 20% -ную суспензию на забуфе-ренном физиологическом растворе с pH 7. Суспензию экстрагируют при комнатной температуре в течение 2 ч, затем

Лаборатор^д^^яосгшкл вирусных бохмней зеиМ17Ш*ц

трехкратно замораживают при температуре -20°С, центрифугируют при 6000 об/мин в течение 20 мик. Надосадочную жидкость вновь центрифугируют при 10 ООО.. Л5 000 об/мин в течение 30 мин. Полученную надосадочную жидкость используют в РСК как испытуемый антиген.

2.4.1. Титрование гемолизина. Для титрования готовят основное разведение гемолизина 1:100 (0,2 мл гемолизина и 9,8 мл физиологического раствора), а затем готовят все последующие разведения по схеме 1.

Схема 1 Разведение гемолитической сыворотки

Показатели Номера пробирок 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Разведение 1:500 1:400 1;600 1:600 1:700 1:800 1:900 1:1200 1:1600 Гемолити ческая сыворотка 1:100 0,1 0,1 0.1 0,1 0.1 од од 0,1 од Физиоло гический раствор 0,2 0.3 0,4 0,5 0,6 0.7 0.8 U 1.6

Схема ?

Титрование гемолизина

Гевдлиамц в разведения» Компоненты 8 « . . S те : S ц> W+ е 1 S ^4 8 OD н е о № Г4 о 3 д н и Гемолизин разведенный 0,1 од од од од од од од од 3% взвесь эритроцитов крупного рогатого скота од ОД од од од од од од од Комплемент 7:10 од од од од од 0,1 од од од Физиологический раствор 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 Водяная баня при 37...3^ С Результат реакции 0 0 0 | 0 0 0 0 0 ++++

Примечание; О«— полный гемолиз; ++ “ частичная задержка гемолиза (50%); ++++ — полная задержка гемолиза.

301

irtMMnmiHWHiiWMUAlBWiniia паи-импинп iiiihuniiih ■ наиштагл jiiiiihi пш iiMiai«i№»iiKia«iaaniiininiiii мигшинг аишка

Гемолизин титруют по схеме 2,

Титром гемолизина считают наивысшее разведение, дающее полный гемолиз эритроцитов. Рабочее разведение гемолизина соответствует четырехкратному титру. Например, если титр гемолизина 1:1200, то рабочее разведение будет равно 1:300 (по схеме 2),

2.4,2. При определении рабочей дозы комплемента его применяют в разведении 1:10 в дозах 0,04; 0,06; 0,08; ОД; 0,12; 0,14; 0Д6; 0,18.

В каждую пробирку добавляют недостающее количество физиологического раствора до конечного объема 0,2 мл. Для удобства приготовлении доз комплемента готовят вспомогательный ряд пробирок, в которых увеличивают количество комплемента в 10 раз (схема 3),

Схема 3 Разведение комплемента

Номера пробирок 1 2 а 4 б В 7 8 Искомые дозы комплемента 0,04 0,06 0,08 од 0Д2 0,14 0,16 0,18 Комплемент 1:10 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1Д 1,6 1,8 Физиологический раствор 1,6 1.4 1,2 1.0 0,8 0,6 0,4 0,2

Содержимое каждой пробирки в объеме 0,1 мл добавляют в пробирки, б которые предварительно разлиты по 0,1 мл специфические, испытуемые и контрольные антигены и сыворотки (каждый компонент в отдельный ряд пробирок) и по ОД мл физиологического раствора.

При титровании комплемента в присутствии гемолизина в пробирки предварительно добавляют по 0,2 мл только физиологического раствора.

После добавления комплемента во все пробирки вно-сет по 0,2 мл сенсибилизированной гемолитической системы (равные объемы 3%-ной взвеси эритроцитов крупного рогатого скота и гемолитической сыворотки кроликов, взятой в четырехкратном титре) и смеси инкубируют при температуре 37°С.

302    Лабораторная    диагностика    вирусньех    селезней    жшютнык

мишка iuuihmimmiiimii 1>л1Ш111Ш11 ни nuinnaiitai ><huNniMiiMil**MHllall luaHMaiHmiMiuMinaiuiiiinNl «iilHiu.....ппшшннмши

Схема 4 Примерный протокол учета титрования комплемента в присутствии антигенов и сывороток

Компоненты Долы комплемента в рабочем рааведошгк 0,04 0,00 0,0В од 0,12 0,14 0,16 0,18 Антиген сиецифиче-скин (в рабочем разводе Янн) ++++ + 0 с 0 0 0 0 Антиген испытуемый 1:2 ++++ +++ 0 0 0 0 0 0 Антиген контроль-ешй (в рабочем разведении) ++++ + 0 0 0 0 G а Сыворотка специфическая (в рабочем разведении) ++++ 0 0 0 0 0 0 0 Сыворотка контрольная (в рабочем разведении) ++++ 0 0 0 0 0 0 0 Титрование комплементе е присутствии гемолизина ++++ 0 G 0 0 0 0 0

2.4.3.    Результаты учитывают через 30 мин по примерной схеме 4.

2.4.4.    В примере» приведенном в схеме 4, одна доза комплемента составляет 0,08 мл его разведения 1:10. В основном опыте используют рабочие дозы» равные 1,2 и 1»5. Затем рассчитывают количество комплемента для всего опыта следующим образом: если доза соответствует 0,08 мл разведения комплемента 1:10, то 1,2 дозы будут равны

0,08-1,2 10 ‘

Полученное число умножают на количество пробирок в опыте, увеличенное на 10...20% (лучше брать с увеличением на 10...20 пробирок). Например» на 100 пробирок это составит