ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ЖИВОТНЫХ

ВЕТЕРИНАРНАЯ

МЕДИЦИНА

- САНКТ-ПЕТЕРБУРГ • •МОСКВА-• КРАСНОДАР• •2015-

Лабораторная диагностика вирусных болезней животных

iintiiiiiiiiiiiuiiiiiiiHiiiiiiiiuiwittiHifiiNiiHiiiiuiiuiiiiiuiiiiwiiiimwiiiiiiiiwiiiiiuiiiiiuiiuiiHiJiiiiiNiiiiawiiumiMiiiaiiuwiiti

Кожу вентрального бесшерстного участка хвоста подопытных животных обрабатывают 70°-ным этиловым спиртом, затем шприцом внутрикожно в два участка вводят по 0,2 мл надосадочной жидкости исследуемой суспензии (в разведениях 1:20 и 1:200).

Биопробу на оспу считают положительной при появлении у ягнят (козлят) на 6...8-й день после заражения характерных оспенных розеол, папул и пустул.

6.4.    Биопробу на оспу свиней ставят на двух клинически здоровых поросятах в возрасте 2...3 мес. Кожу живота поросят в 4 участках размером 4,0х4,0 см выбривают, обрабатывают спиртом, затем скарифицируют, делая насечки длиной по 3 см. В скарифицированную поверхность кожи каждого участка втирают шпателем по 0,6 мл надосадочной жидкости исследуемой суспензии.

Результат исследования на оспу свиней считают положительным при образовании по ходу насечек через 6...8 дней после заражения характерной узелково-пустулезной сыпи и обнаружении в патматериале с этих мест методом микроскопии вирусных оспенных частиц.

6.4.1. Дифференциацию возбудителя, вызвавшего оспу у свиней, проводят на куриных эмбрионах (п. 5) или на поросятах. С этой целью используют 2 поросят, переболевших оспой (подопытные) и 2 здоровых (контрольные). Подопытным и контрольным поросятам втирают в два участка скарифицированной кожи по 2 капли растворенной сухой оспенной вакцины, изготовленной из вируса осповакцины.

Развитие оспин на скарифицированной коже подопытных и контрольных животных через б...8 дней после нанесения вируса осповакцины указывает на наличие в хозяйстве оспы, вызванной вирусом оспы свиней.

Отсутствие оспенных поражений на коже подопытных животных (при положительной поствакцинальной реакции у контрольных поросят) свидетельствует о наличия у свиней оспы, вызванной вирусом оспы коров или осповакцины.

6.5.    Биопробу на оспу верблюдов проводят на одном верблюжонке (отлученном от матки). Кожу бесшерстного вентрального участка хвоста или бесшерстного участка бедра

L Болезни, общие для всех или нескольких видов шкюгшшх    105

..........................................................................................1111.....mill..........Ilium.....................................ши......................iimiuiuim...............

животного обрабатывают спиртом, затем с помощью шприца внутрикожно в два участка вводят по 0,2 мл надосадоч-ной жидкости исследуемой суспензии в разведении 1:20 и 1:200.

Результат исследования на оспу верблюдов считают положительным при образовании на 5...7-й день после заражения в местах инокуляции суспензии из патматериала папул и пустул, а также обнаружении в них методом виру-соскопии оспенных частиц.

6,5.1. Для дифференциации вируса оспы верблюдов от вируса оспы овец, коров и осповакцины переболевшему оспой и здоровому (контрольному) животным наносят глаз-ной пипеткой на свежескарифицированную поверхность кожи 2...3 капли растворенной сухой оспенной вакцины, изготовленной из вируса осповакцины.

Развитие на месте скарификации кожи на 6...7-й день после нанесения вакцины пустул у подопытного и кон-трольного животных показывает на наличие в хозяйстве оспы, вызванной вирусом оспы верблюдов.

Отсутствие реакции у подопытного животного (при положительной поствакцинальной реакции у здорового контрольного животного) свидетельствует о наличии в хозяйстве оспы, вызванной вирусом оспы коров или осповакцины.

7.    Диагноз на оспу животных считают установленным при получении положительного результата по одному из методов исследования, указанных в п, 1.2.

8.    Срок исследования: вирусоскопического — 1 день; гистологического — 3...4 дня; выделения возбудителя — 6...12 дней; биопробы — 9 дней.

Настоящие Методические указания разработаны Всесоюзным государственным научно-контрольным институтом ветеринарных препаратов (авторы старшие научные сотрудники Е. И. Скалинский, Ю. Ф. Борисович).

ПРИЛОЖЕНИЕ к Методическим указаниям по лабораторной диагностике оспы крупного рогатого скота, овец, коз, свиней и верблюдов от 12 ноября 1985 г.

1, Метод окрашивания элементарных частиц.

106    Лабораторная    диагностика    вирусных    болезней    животных

.................................................................................................................................................................................................................

1.1.    Окраска по Морозову. Для окрашивания по Морозову предварительно готовят три реактива:

■    реактив № 1 (жидкость Руге): 1 мл ледяной уксусной кислоты, 2 мл 40% -ого формальдегида и 100 мл дистиллированной воды;

N реактив № 2:5 г танина, 100 мл дистиллированной воды и 1 мл жидкой карболовой кислоты;

■    реактив № 3: 5 г кристаллического азотнокислого серебра растворяют в 100 мл дистиллированной воды; из этого раствора в отдельный сосуд отливают 20 мл. К 80 мл оставшегося раствора по каплям добавляют 25%-ный раствор аммиака, пока образующийся жел-товато-коричневый, а затем буро-черный осадок не растворяется и не останется лишь легкая опалесценция. Если добавление аммиака вовремя не прекращено, то берут раствор азотнокислого серебра (из 20 мл) и добавляют его по каплям до появления легкой опалесценции. Для окраски препаратов готовый реактив разбавляют дистиллированной водой в соотношении 1:10.

На приготовленные препараты (п. 2.2) наносят реактив

№ 1 (жидкость Руге), который через 1 мин сливают; промывают дистиллированной водой и протравливают реактивом № 2 при подогревания над пламенем спиртовки до появления паров (1...2 мин). Затем после промывания водой препараты покрывают одним слоем фильтровальной бумаги и обрабатывают реактивом № 3 при легком подогревании, пока мазки приобретут темно-коричневую окраску, после чего их вновь тщательно промывают дистиллированной водой, высушивают на воздухе и просматривают под иммерсионной системой микроскопа.

1.2.    Окраска по Пашену. Для окраски по методу Паше-на предварительно готовят раствор для протравы по Леф-флеру, состоящий из 20% -ого водяного раствора танина — 100 мл насыщенного водного раствора сернокислого записного аммиачного железа — 50 мл и насыщенного спиртового раствора основного фуксина — 10 мл.

Перед окраской раствор фильтруют, наносят его на препараты, осторожно подогревают до появления паров и оставляют на несколько минут для остывания, затем смывают

L Болезни, общие для всех или нескольких видов животных    107

llllltMIIIIIIIIIIIIIIIII|llirilllllllllllIIIIIIIIIII)l|l(IIIIIIIIIIIJIII1llllllllll|||tlll|iHINII|ll|JIHIIItl ШИП lljlllllUIIIIMII№IIIM!IIIIHtlllll№IIIIIIIIIIIHnilllUIIIIIIIIIMIIIIIIIIttlllHlllllllllllUIIIJIIII!IIIIIIIN II

дистиллированной водой и наносят на препараты карболовый фуксин Циля; осторожно подогревают до появления паров, оставляют для остывания и снова промывают дистиллированной водой, высушивают на воздухе и просматривают под иммерсионной системой микроскопа.

wmmiHiiiiiiiiiiiiiiiiMmini^aiBiiiiiHiMfH»miuii[iiBiiiii«iiii8iiiiiiiiiMiniiiiiiiiiiiiiiMiiiiimiiiiiiiuaiiijiiflii)Biiinai!iiiiii

КРАТКИЙ СЛОВАРЬ ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ВЕТЕРИНАРНЫХ ТЕРМИНОВ

Антигены (анти + греч. genes — порождающий) — чужерод-ные для организма высокомолекулярные органические вещества коллоидной структуры (белки, белково-липидные и белково-полисахаридные комплексы), способные при поступлении (введении парентерально) вызывать синтез особых глобулинов-антител и вступать в специфическое взаимодействие с ними.

Антитела (анти. + тело) — противотела — специфические белки (иммуноглобулины), образующиеся в организме под воздействием антигенов. Они накапливаются в сыворотке крови и тканях, вступают в специфическую связь с соответствующими антигенами и разрушают или обезвреживают их.

Биологическая проба (биопроба) — один из методов диагностики инфекционных болезней с помощью заражения патологическим материалом подопытных животных (куриных эмбрионов, культур клеток) и их исследования.

Вирион — полноценная внеклеточная вирусная частица.

Вирусовыделение — выделение возбудителей инфекции из организма больного животного или вирусоносителя.

Вирусоносительство — наличие возбудителя инфекции в определенных органах и тканях клинически здорового животного, не сопровождающееся иммунологической перестройкой организма.

Вирусы (лат. virus — яд) — облигатные внутриклеточные паразиты, отличающиеся от растительных и животных организмов малыми размерами, отсутствием клеточного строения и автономного метаболизма, наличием только одного типа нуклеиновой кислоты и дезъюнктивным способом размножения.

Краткий словарь использованных ветеринарных терминов    665

millll|niillll1ll|lllLUIIIlin№nuni|IIIIHHllllllilllllllll№IIHinillllllll|UllinWl|HI1lllllllltl|ilU|lll|IHI1ttl|IIIHIIIII11IUtHUIIIII|HIUll|KIIII|Ullllllini>UI№llUl|lllinilllllllUIIIIIIUIUIIIUIIII1l|ffil

В. безоболочечные — вирусы, в структуре которых отсутствует липопротеидная оболочка,

В. оболочечные — вирусы, в структуре которых присутствует липопротеидная оболочка.

Вирусоскопия (вирусы +■ skopeo — смотрю, наблюдаю) — метод микроскопического изучения морфологии вирусов.

Гемагглютинация (греч. haima — кровь + agglutinatio — склеивание) — склеивание и выпадение в осадок эритроцитов под воздействием вирусов, бактерий, токсинов идр., способных адсорбироваться на поверхности эритроцитов, а также ге-магглютининов.

Гемадсорбция (греч. haima — кровь + adsorbtio — поверхностное поглощение) — способность культур клеток, зараженных вирусами, адсорбировать эритроциты различных животных, что объясняется включением в плазматическую мембрану синтезирующихся вирусных белков.

Диагностика (греч. diagnostikos — способный распознавать) — раздел клинической ветеринарии о методах исследования животных для распознавания их болезней и состояния организма с целью назначения необходимого лечения и профилактических мероприятий.

Диагностический набор — набор стандартных препаратов, используемых для постановки диагноза (антиген, специфическая и контрольная сыворотки идр.).

ДНК-зондов метод — метод генодиагностики, основанный на способности меченой одноцепочечной молекулы ДНК взаимодействовать с комплементарной ей молекулой нуклеиновой кислоты определенного вируса с образованием двухцепочечной структуры.

ДНК-содержащие вирусы — вирусы* имеющие один тип нуклеиновой кислоты — ДНК, у большинства она представлена двухцепочечной структурой, у некоторых — одной цепью.

Идентификация (лат. identiftco — отождествляю) — признание тождественности, опознание-определение видовой (типовой) принадлежности микроорганизма на основании всестороннего изучения его свойств.

Иммуноферментный анализ — группа методов, позволяющих выявлять комплекс антиген — антитело с помощью субстрата, который расщепляется ферментом (пероксидазой, щелочной фосфатазой идр.) с появлением окрашивания.

Инактивация вирусов (лат. inactivus — неактивный) — уничтожение инфекционной активности вирусов путем повреждения генома физическим или химическим воздействием.

656    Лабораторная    диагностика    вирусных    болезней    животных

14Г1||-|1И111Л111|111Г||||1|и IIIIMI ||MI|lllllflJllfllll-lllll|IIINIII[|i||llfflJltEmjfl||l|F| IHIUNIIIMIII |KIIIIIIIII9||IIJIHII(|l|IM|IIILIJIIIf|1l|IMII<JIIHIIII|IIIJIIH-IIICIJ|ISNIUIIIIII 11|11|1|Г11ГГЛ111Л1ШГ111111111Н11С1

Индикация возбудителя инфекции (лат. indicatio — указание) — выявление и идентификация патогенных микроорганизмов в различных объектах.

Инокуляция возбудителя (лат, inoculatio прививка) — введение возбудителя путем инъекции (искусственное заражение или внесение его в организм животного членистоногими переносчиками при укусах).

Консервирование вирусов (лат. conservare — сохранять) — общее название методов воздействия физическими и (или) химическими факторами на какие-либо объекты с целью длительного сохранения в них вирусов.

Контаминация (лат. contaminatio — смешение) — обсеменение поверхности тела животного, предметов ухода, почвы, воды, кормов, биопрепаратов и других объектов патогенными микроорганизмами.

Культивирование вирусов — выращивание вирусов в искусственных условиях.

Культуры клеток (клеточные культуры) — клетки многоклеточного организма, живущие вне его в искусственно созданных условиях среды.

Куриный эмбрион — оплодотворенное куриное яйцо, выдержанное в инкубаторе.

Лабораторные животные — животные, используемые в лабораториях при проведении исследований (мыши, крысы, кролики, морские свинки, хомяки, голуби и др,).

Лиофилизация (греч. 1уо — растворяю + phileo — люблю) — высушивание предварительно замороженного материала в глубоком вакууме.

Моноклональные антитела —- строго специфические антитела, способные выявить минимальные различия в химическом составе и пространственной конфигурации молекул, являются продуктом отдельных клонов антителопродуцирующих клеток.

Парные сыворотки — сыворотки, взятые в самом начале заболевания и 2...3 недели спустя. Повышение титра антител в 4 раза и более считается основой положительной реакции.

Пассаж (фр. passage — переход) — последовательное заражение восприимчивых объектов (животные, куриные эмбрионы, культуры клеток) микроорганизмами.

Полимеразная цепная реакция (от англ. Polymerase Chain Reaction, ПЦР) — метод генодиагностики, основанный на многократном увеличении копий строго определенных фрагментов

Краткий словарь использованных ветеринарных терминов    657

..............................................................................................................................................................................яиц innii iiniiiiutMim ни

молекулы ДНК вируса при помощи фермента термостабильной ДНК-полимеразы.

Реакция гемагглютииацки (РГА) — метод обнаружения и идентификации вирусов, основанный на способности многих вирусов, обладающих тканевым тропизмом, агглютинировать эритроциты определенных видов животных.

Реакция иммунофлуоресценции (РИФ) (лат. fluorescens — светящийся) — серологическая реакция, основанная на взаимодействии антиген — антитело, при этом один из компонентов, участвующий в реакции, связан с флуоресцирующим красителем.

Реакция нейтрализации (PH) — метод идентификации вируса, основанный на феномене потери им инфекционное™ в результате взаимодействия со специфическими антителами.

Реакция связывания компемента (РСК) — метод серологического исследования, основанный на способности образующегося комплекса антиген — антитело связывать комплемент, что выявляется по отсутствию гемолиза при добавлении гемолизина и эритроцитов.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) — метод идентификации вируса или выявления противовирусных антител в сыворотке крови, основанный на феномене отсутствия агглютинации эритроцитов вирусом, в присутствии специфических к нему антител.

РНК-содержащие вирусы — вирусы, имеющие один тип нуклеиновой кислоты — РНК, у большинства она представлена одной цепью, у некоторых — двухцепочечной структурой.

Сероваркант — самостоятельная группа внутри определенного вида и серогруппы (серотипа) микроорганизмов, обусловленная наличием антигенов, отличающихся от антигенов других микроорганизмов этого вида и серогруппы (серотипа), что выявляется с помощью серологических реакций.

Серогруппа (серотип) — самостоятельная группа внутри определенного вида микроорганизмов, обусловленная наличием антигенов, отличающихся от антигенов других микроорганизмов этого вида, что выявляется с помощью серологических реакций.

Серологические реакции — реакции, широко используемые при постановке диагноза инфекционных болезней, методы обнаружения антител и антигенов в крови и других тканях.

Сыворотка крови (лат. serum — сыворотка + sanguis — кровь) — составная часть крови, представляющая собой плазму, из которой удалены форменные элементы и фибрин в процессе свертывания крови.

658    Лабораторная    диагностика    вирусных    болезней    животных

IIIHIIMIinHIIIIIIIHItlllHHIIIIIItMIIMIIHIimi|llll!IIU1lllllllllinHlllllinRMII(lllllllllll1lllllinUilllllllll>(IUIIIinKtlllllNII№lllll!NIIHIIIIIIIMI11llllllHnillRMIIIRIIIIIHIIfflllll(NIJIIIIII№ll

Тельца включения — своеобразные морфологические образования, обнаруживаемые в цитоплазме или ядрах клеток определенных тканей при некоторых вирусных инфекциях и состоящие из скопления вирионов и вирусных белков.

Термолабильность (греч. thermos — теплый + лат. labilis — нестойкий) — неустойчивый к тепловому воздействию, изменяющийся при нагревании.

Термостабильность (греч. thermos — теплый + лат. stabilis — неизменный) — сохраняющий свои свойства при нагревании.

Титр вируса — концентрация инфекционных единиц вируса в определенном объеме материала.

Цитопатогенное действие вирусов (ЦПД, цитопатический эффект) — специфическая морфологическая деструкция (разрушение) и функциональная патология зараженных вирусами клеток в культурах.

Штамм (нем. stamm — род, корень) культура микроорганизмов одного вида с одинаковыми морфологическими и биологическими свойствами.

Элементарные тельца — см. Вярион (2, 3).

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ

СПИСОК

1.    Лабораторные исследования в ветеринарии. Вирусные, риккетсиозные и паразитарные болезни: справочник / под ред. Б. И. Антонова. — М.: Агропромиздат, 1987. — 240 с.

2.    Баку лов, И. А. Эпизоотологический словарь-справочник / И. А, Бакулов, Г. Г. Юрков, В. А. Ведерников [и др.]. -~М.: Россельхозиздат, 1986,

3.    Нымм, Э. М. Словарь ветеринарных микробиологических и вирусологических терминов / Э. М. Нымм, К. А. Петерсон, Э, А. Аавер [и др.]. — М,: Росагропромиздат, 1989,

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ЖИВОТНЫХ

Составители:

П. И. Барышников,

В. В. Разумовская

Издание второе, исправленное

ДОПУЩЕНО

Министерством сельского хозяйства РФ в качестве учебного пособия для студентов вузов, обучающихся по направлению подготовки fcrieiiwaAbHocm-uJ «Ветеринария»

ДОПУЩЕНО

УМО вузов РФ по образованию в области зоотехнии и ветеринарии в качестве учебного пособия для студентов вузов, обучающихся по направлению подготовки (специальности) «Ветеринария»

(квалификация (степень) «Ветеринарный врач»)

ЛАНГ

• САНКТ-ПЕТЕРБУРГ • МОСКВА * КРАСНОДАР • •2015*

ПРЕДМЕТНЫЙ

УКАЗАТЕЛЬ

Агар мяео-пептонный (МПА) 101, 109, 125, 326, 3871 444, 4561 476, 483t 542, 588 Альбумин бычий 7, 226, 618 Аппарат Киппа 126, 466 Бульон мясо-пептонный (МПБ) 7S, 101, 109, 125, 326, 444, 456, 476, 483, 496, 542, 588 —    триптозо-фосфатный 519 Буфер вероналовый 35,375 ~ боратный 148 —    фосфатно-солевой 174, 315, 328, 561, 604 калий-фосфатный 231, 236, 407 ~~ карбонатно-бикарбонатный 335, 561, 604, 618 Гемолизин 25, 114, 300, 369,    507 Гемолитическая система (гемсистема) 25, 116,216 Жидкость Руге 1 Об, 446 —    Карнуа 108 Иммуноасцитическая жидкость (ИАЖ) 84 Комплемент 27, 116, 216, 300, 370,    507

Метод вирусоскопии 99, 443, 548 —    Кербера 66 —    иммуноферментного анализа (ИФА) 88, 159, 173, 228, 233,244,314, 328, 336, 349, 406, 409, 436, 561, 603, 609, 617 —    кофал-теста 514 —    перекрестного иммунитета 64 —    полимеразной цепной реакции (ПЦР) 180, 253, 307, 342, 416, 425, 625 —    Рида и Менча 66, 242, 297, 324, 380, 394, 500, 523, 552, 556 —    электронной микроскопии 327, 593 Окраска гистопрепаратов по Ленцу 80 —    Турбиной 584 ■— Туревичу 81,584 —    мазков по Борману — Гайнуллиной 74 —    Михину 74 —    Морозову 100, 446 —    Муромцеву 73 —    Пашену 100, 447 —    Селлерсу 74 Перевиваемая линия почки свиньи (СПЭВ) 70, 386, 392

---

ББК 48.7я73 Л 12

Л12 Лабораторная диагностика вирусных болезней животных / Сост. П. И. Барышников, В. В. Разумовская: Учебное пособие. — 2-е изд., испр. — СПб.: Издательство «Лань», 2015.— 672с,: ил, — (Учебники для вузов. Специальная литература).

ISBN 978-5-8114-1882-4

Учебное издание содержит действующие методические указания, наставления и инструкции по лабораторной диагностике вирусных болезней животных, утвержденные Министерством сельского хозяйства СССР, РФ и Россельхознадзором РФ. Документы систематизированы по видам животных, в большинстве прошли многолетнюю аппробацшо в Алтайской краевой ветеринарной лаборатории и включены р «Перечень нормативной документации, разрешенной для использования в государственных ветеринарных лабораториях при диагностике болезней животных, рыб, пчел, а также контроля безопасности сырья животного и растительного происхождения» (по состоянию на июль 2011 г.). Приводятся предметный указатель и библиографический список.

Предназначено для студентов, обучающихся по специальности «Ветеринария» и направлению «Ветеринарно-санитарная экспертиза», ветеринарных врачей и лаборантов ветеринарных лабораторий.

ББК 48.7я73

Рецензенты!

И. И. ГУСЛАВСКИЙ — доктор ветеринарных наук, профессор кафедры микробиологии, эпизоотологии, паразитологии и ВСЭ Алтайского государственного аграрного университета;

В. И. ПЛЕШАКОВА — доктор ветеринарных наук, профессор, зав. кафедрой ветеринарной микробиологии, вирусологии и иммунологии Омского государственного аграрного университета им. П. А. Столыпина;

В. А СИНИЦЫН доктор ветеринарных наук, зав. отделом ФГБУ «Новосибирская межрегиональная ветеринарная лаборатория».

Обложка © Издательство «Лань», 2015 Е. А ВЛАСОВА © Коллектив авторов, 2015 © Издательство «Лань»,

художественное оформление, 2015

Лабораторная диагностика вирусных болезней животных

.........................IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIH III II IHJlimilllllll 11 Hllll I llllllllll llllll I lull HUH l ('ПН пни МНЮ I Hill и НИ I l|U IIIIUtllilH IIIIM-t!

ОСПА

1.6.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ ОСПЫ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА, ОВЕЦ, КОЗ, СВИНЕЙ И ВЕРБЛЮДОВ

(утверждены 12 ноября 1985 г„ № 115-6а)

1. Общие положения

1.1. Оспа — контагиозная болезнь животных, протекающая с признаками аутоинтоксикации, лихорадки и узелково-пустулезной сыпи на коже (экзантемы) и на слизи-

стых оболочках (энантемы), проходящей определенные стадии формирования: розеола — везикула — папула — пустула — струп.

1.2.    Оспа у разных видов животных вызывается следующими вирусами:

и крупный рогатый скот — оспы коров или осповакцины;

а овцы — оспы овец;

в козы — оспы коз;

в свиньи — оспы свиней, оспы коров или осповакцины;

в верблюды — оспы верблюдов, оспы коров или осповакцины.

1.3.    Лабораторная диагностика оспы животных включает в себя:

ш обнаружение в патологическом материале оспенных частиц (вирионов) методом вирусоскопии;

К обнаружение цитоплазматических ацидофильных включений в пораженных участках кожи больного или зараженного животного гистологическим методом;

к выделение вируса на куриных эмбрионах (КЭ) с последующей его идентификацией;

ш биологическую пробу (в сомнительных случаях) на естественновосприимчивых животных.

2. Отбор, упаковка и пересылка патологического материала.

2.1.    Патологический материал отбирают не менее чем с 5 участков пораженной кожи. Для сбора и консервирования материала используют стерильные инструменты, посуду и консервирующие растворы.

Материал от больных животных, обработанных моющими или дезинфицирующими растворами (едкого натра и др,), к исследованию не пригоден.

2.2.    Для исследования в лабораторию направляют:

т мазки, сделанные из содержимого везикул больного животного, и мазки-отпечатки с оспенных поражений кожи;

т патологический материал от больных животных (содержимое везикул, целые папулы и пустулы, иссеченные вместе с субэпидермальной отечной тканью).

100    Лабораторная    диагностика    вирусных    болезней    животных

.......................................................................................................................................................................................................................

2.3.    Мазки высушивают на воздухе, складывая так, чтобы они не соприкасались между собой, и упаковывают в целлофан.

2.4.    Везикулярную жидкость собирают в капилляры пастеровских пипеток, которые затем помещают в пробирки с резиновыми пробками.

2.5.    Папулы и пустулы иссекают ножницами вместе с отечной тканью и помещают в два стерильных флакона: один — с 50% -ным раствором глицерина, второй — с 10% -ным раствором формалина,

2.6.    Отобранный материал (пробирки и флаконы с патологическим материалом предварительно обрабатывают снаружи 3% -ным раствором хлорамина) упаковывают в металлические коробки или пеналы и направляют с нарочным в лабораторию. Неконсервированный материал доставляют в термосе со льдом в день отбора.

3.    Вирусоскопическое исследование.

3.1.    Для обнаружения вирусных оспенных частиц (ви-рионов) исследуют мазки и мазки-отпечатки из патологического материала окрашенные по методу Морозова или Пашена (см. приложение 1).

При микроскопии в препаратах обнаруживают множество мелких частиц кокковидной формы, расположенных поодиночке, парами или в виде скоплений. При окраске по Морозову оспенные частицы имеют темно-коричневый цвет, по Пашену — темно-красный.

3.2.    Результат исследования считают положительным только при обнаружении вирионов в массовом количестве (в виде россыпей). При отрицательном результате вирусоскопического исследования, а также при обнаружении единичных вирионов проводят дальнейшие исследования.

4.    Патогистологические исследования.

4.1.    Из фиксированных формалином проб кожи на замораживающем микротоме готовят срезы, которые окрашивают гематоксилин-эозином.

4.2.    При исследовании папул в дерме находят гиперемию, серозный отек и клеточный пролиферат, состоящий из лейкоцитов, гистиоцитов (макрофагов) и фибробластов, в эпидермисе — гиперплазию и некроз кератоцитов.

В везикулах обнаруживают скопление серозного экссудата или полиморфноядерных лейкоцитов, лизис клеток дермы, в пустулах — наличие гнойных телец.

При оспе в эпителиальных клетках эпидермиса, а у овец и коз также в гистиоцитах сосочкового слоя дермы находят цитоплазматические ацидофильные включения.

4.3.    Патологогистологический диагноз на оспу свиней и оспу овец считают положительным при обнаружении, кроме вышеописанных изменений (п. 4.2), внутриядерных вакуолей в кератиноцитах эпидермиса кожи свиней и соответственно, в гистиоцитах собственно кожи (дермы) овец.

4.4.    Оспу овец дифференцируют от контагиозного пустулезного дерматита, при котором устанавливают гиперкератоз, пролиферацию эпителия волосяных фолликулов, а также ацидофильные цитоплазматические изменения в кератиноцитах эпидермиса.

5. Выделение возбудителя на куриных эмбрионах.

5.1.    Пробы исследуемого материала растирают в ступке и готовят 10%-ную суспензию на физиологическом растворе (рН7,2...7,4).

Если патматериал консервирован глицерином, его предварительно отмывают физиологическим раствором.

Суспензию центрифугируют при 2000 об/мин в течение 15 мин. Надосадочную жидкость отсасывают, добавляют к ней антибиотики (из расчета 500 ЕД/мл пенициллина, 250 мкг/мл стрептомицина и 50 ЕД/мл нистатина); выдерживают при 4°С 12 ч. Надосадочную жидкость проверяют на бактериальную загрязненность. При отсутствии в течение суток роста микрофлоры в МПБ и на МПА ее используют для заражения куриных эмбрионов.

5.2.    Выделение вируса оспы коров и осповакцины проводят на куриных эмбрионах 11... 12-дневного возраста* Для заражения их используют надосадочную жидкость в разведениях 1:10 (исходное разведение), 1:100 и 1:1000,

Перед заражением КЭ овоскопируют, отмечают пугу (воздушный мешок) и бессосудистую зону на боковой поверхности хориоаллантоисной оболочки (ХАО). Затем эмбрионы обрабатывают спиртом с содержанием 0,1 % настойки йода и фламбируют.

Лабораторная диагностика вирусных болезней животных

Для заражения эмбриона в скорлупе пробойником де-лают отверстия в центре пуги и сбоку в бессосудистой зоне. Через боковое отверстие на ХАО вводят по 0,2 мл надоса-дочной жидкости в разведении 1:10,1:100 и 1:1000 (по 4 эмбриона на каждое разведение). После введения исследуемую жидкость равномерно распределяют на ХАО осторожным покачиванием яйца. Затем отверстия в скорлупе заклеивают лейкопластырем, яйца укладывают на бок вверх заклеенным отверстием. Для контроля оставляют незаряженными 4 КЭ.

5.3.    Эмбрионы инкубируют при 34,5...35°С в течение 5 сут, ежедневно просматривая. Гибель эмбрионов в первые сутки считают неспецифической. Эмбрионы, погибшие в более поздние сроки, отбирают, охлаждают и вскрывают. По истечении пяти суток инкубации вскрывают все оставшиеся эмбрионы.

5.4.    Вскрытие КЭ проводят в стерильных условиях. Пинцетом в месте заражения удаляют скорлупу и глазными ножницами иссекают всю пораженную часть ХАО, которую затем промывают в физиологическом растворе, помещают в чашку Петри и просматривают с помощью лупы на черном фоне на наличие оспенных поражений.

5.5.    При наличии в патматериале вируса осповакцины к 72-му часу после заражения на ХАО образуются плоские беловатого цвета оспины диаметром З...4мм. Вирус оспы коров образует сходные поражения, но отличающиеся резко геморрагическим характером («красные оспины»), однако отдельные оспины (1...3%) могут быть беловатого цвета.

Из пораженных участков ХАО делают мазки для обнаружения частиц вируса оспы методом серебрения по Морозову или окраски по Пашену (п. 3).

При отсутствии специфических поражений на ХАО, суспензией из ХАО делают второй пассаж на КЭ.

5.6.    Вирусы оспы овец, коз, свиней, верблюдов на ХАО не вызывают образования специфических изменений.

6. Биологическая проба.

6.1. Биологическую пробу проводят на лабораторных или естественновосприимчивых животных, взятых из благополучных по инфекционным болезням хозяйств.

1. Болезни, общие для всех или нескольких видов животных    103

....................................................................................................................................................................................КИШ.............................

6.2, Дифференциацию вируса осповакцины от вируса оспы коров проводят постановкой биопробы на цыплятах, белых мышах или кроликах,

6.2.1,    Биопроба на цыплятах: у 1,5-месячных цыплят в области голени удаляют перья; в свежеобнаженные фолликулы голени одной конечности (вторая— для контроля) стерильным шпателем втирают 0,6 мл исследуемой надоса-дочной жидкости (п. 5.1) или суспензии из пораженной ХАО, в которые предварительно добавляют 20% стерильного глицерина.

Вирус осповакцины вызывает образование у цыплят на

7.. .9-й день после заражения доброкачественного оспенного фолликулита; вирус оспы коров специфических изменений не вызывает.

6.2.2,    Биопроба на белых мышах: пяти белым мышам массой 15... 18 г вводят внутримышечно по 0,2 мл надоса-дочной жидкости исследуемой суспензии (п. 5.1),

Вирус осповакцины гибели мышей не вызывает; вирус оспы коров вызывает гибель мышей на 5...7-й день после заражения.

6.2.3.    Биопроба на кроликах: у двух кроликов массой тела 1,5...2 кг на 4 участках в области живота выстригают шерсть на площади 2,5x2,5 см; кожу обрабатывают 70°-ным этиловым спиртом и острым концом стерильного скальпе-ля делают насечки длиной по 1 см, избегая появления капель крови. В скарифицированную кожу втирают стерильным шпателем по 0,2 мл (на каждый участок) надосадочной жидкости исследуемой суспензии. В суспензию предварительно добавляют 20% глицерина.

Вирус осповакцины на 3...5-Й день после заражения вызывает у подопытных кроликов на скарифицированных участках кожи образование инфильтратов без геморрагии; вирус оспы коров вызывает образование геморрагических инфильтратов.

6.3.    Исследования на оспу овец (коз) проводят на двух клинически здоровых ягнятах (козлятах) в возрасте

2.. .3 мес., взятых от неболевших и невакцинированных против оспы маток.