ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ЖИВОТНЫХ

П. И. Барышников, В. В. Разумовская

7. Болезни плотоядных и пушных животных

6. Порядок предъявления рекламаций.

6.1. Рекламацию на качество наборов для выявления антигена ПВЭС, в соответствии с указанием Главного управления ветеринарии «О порядке предъявления рекламации на ветеринарные препараты отечественного производства и закупаемые по импорту¹ № 22-7/28 от 8 мая 1992 г. направляют на предприятие-изготовитель: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, 16, НПО НАРВАК, во Всероссийский государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) по адресу: 123022, г. Москва. Звенигородское шоссе, 5, и ЦНМВЛ (Москва, Оранжерейная, 23).

Наставление разработано НПО НАРВАК,

Одобрено Советом по ветеринарным препаратам Департамента ветеринарии Минсельхозпрода РФ, протокол № 1 от 15 февраля 2000 г., ПВР-1-1.0/-325.

С утверждением настоящего наставления утрачивает силу Наставление по применению набора для выявления антигенов парвовирусного энтерита собак, вирусного энтерита норок и панлейкопении кошек иммуноферментным анализом, утвержденное Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ № 13-7-2/1970 от 24 апреля 2000 г.

КРАТКИЙ СЛОВАРЬ ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ВЕТЕРИНАРНЫХ ТЕРМИНОВ

Антигены (анти + греч. genes — порождающий) — чужерод-ные для организма высокомолекулярные органические вещества коллоидной структуры (белки, белково-липидные и белковополисахаридные комплексы), способные при поступлении (введении парентерально) вызывать синтез особых глобулинов-антител и вступать в специфическое взаимодействие с ними.

Антитела (анти. + тело) — противотела — специфические белки (иммуноглобулины), образующиеся в организме под воздействием антигенов. Они накапливаются в сыворотке крови и тканях, вступают в специфическую связь с соответствующими антигенами и разрушают или обезвреживают их.

Биологическая проба (биопроба) — один из методов диагностики инфекционных болезней с помощью заражения патологическим материалом подопытных животных (куриных эмбрионов, культур клеток) и их исследования.

Вирион — полноценная внеклеточная вирусная частица.

Вирусовьщеление — выделение возбудителей инфекции из организма больного животного или вирусоносителя.

Вирусоносительство — наличие возбудителя инфекции в определенных органах и тканях клинически здорового животного, не сопровождающееся иммунологической перестройкой организма.

Вирусы (лат. virus — яд) — облигатные внутриклеточные паразиты, отличающиеся от растительных и животных организмов малыми размерами, отсутствием клеточного строения и автономного метаболизма, наличием только одного типа нуклеиновой кислоты и дезъюнктивным способом размножения.

Краткий словарь использованных ветеринарных терминов    655

IHIIllllllli1llilllti|ILlllllllHnillMI1l|lllll4HHIIIII1l1IIIIJI№lllllinillllllllUIIIIII№IUIinilllll1llilll|ILFIIHI1IIIIIIIIIIIIIIIIIU1lli1lllll№lllll|HUII№lllllllllllllimiilli|lllinnHlllhllllllliniUMIIIII11l|l»l

В, безоболочечные — вирусы, в структуре которых отсутствует липопротеидная оболочка.

В. оболочечные — вирусы, в структуре которых присутству* ет липопротеидная оболочка,

Вирусоскопия (вирусы + skopeo ~~ смотрю, наблюдаю) — метод микроскопического изучения морфологии вирусов,

Гемагглютинация (греч. haima — кровь + agglutinatio — склеивание) — склеивание и выпадение в осадок эритроцитов под воздействием вирусов, бактерий, токсинов идр., способных адсорбироваться на поверхности эритроцитов, а также ге* магглютининов.

Гемадсорбция (греч. haima — кровь + adsorbtio — поверхностное поглощение) — способность культур клеток, зараженных вирусами, адсорбировать эритроциты различных животных, что объясняется включением в плазматическую мембрану синтезирующихся вирусных белков.

Диагностика (греч. diagnostics — способный распознавать) — раздел клинической ветеринарии о методах исследования животных для распознавания их болезней и состояния организма с целью назначения необходимого лечения и профилактических мероприятий.

Диагностический набор — набор стандартных препаратов, используемых для постановки диагноза (антиген, специфическая и контрольная сыворотки идр,),

ДНК-зондов метод — метод генодиагностики, основанный на способности меченой одноцепочечной молекулы ДНК взаимодействовать с комплементарной ей молекулой нуклеиновой кислоты определенного вируса с образованием двухцепочечной структуры.

ДНК-содержащие вирусы — вирусы* имеющие один тип нуклеиновой кислоты — ДНК, у большинства она представлена двухцепочечной структурой, у некоторых — одной цепью.

Идентификация (лат. identiftco — отождествляю) — признание тождественности, опознание-определение видовой (типовой) принадлежности микроорганизма на основании всестороннего изучения его свойств.

Иммуноферментный анализ — группа методов, позволяющих выявлять комплекс антиген — антитело с помощью субстрата, который расщепляется ферментом (пероксидазой, щелочной фосфатазой идр.) с появлением окрашивания.

Инактивация вирусов (лат. inactivus — неактивный) — уничтожение инфекционной активности вирусов путем повреждения генома физическим или химическим воздействием.

656    Лабораторная    диагностика    вирусных    болезней    животных

...............................................................................................................................................................................................IIIIIIIЦ11ГГ1111М11И1ГН1И lllllll in

Индикация возбудителя инфекции (лат, indicatio — указание) — выявление и идентификация патогенных микроорганизмов в различных объектах.

Инокуляция возбудителя (лат. inoculatio — прививка) — введение возбудителя путем инъекции (искусственное заражение или внесение его в организм животного членистоногими переносчиками при укусах).

Консервирование вирусов (лат. conservare — сохранять) — общее название методов воздействия физическими и (или) химическими факторами на какие-либо объекты с целью длительного сохранения в них вирусов.

Контаминация (лат. contaminatio — смешение) — обсеменение поверхности тела животного, предметов ухода, почвы, воды, кормов, биопрепаратов и других объектов патогенными микроорганизмами.

Культивирование вирусов — выращивание вирусов в искусственных условиях.

Культуры клеток (клеточные культуры) — клетки многоклеточного организма, живущие вне его в искусственно созданных условиях среды.

Куриный эмбрион — оплодотворенное куриное яйцо, выдержанное в инкубаторе.

Лабораторные животные — животные, используемые в лабораториях при проведении исследований (мыши, крысы, кролики, морские свинки, хомяки, голуби и др.).

Лиофилизация (греч. 1уо — растворяю + phileo — люблю) —-высушивание предварительно замороженного материала в глубоком вакууме.

Моноклональные антитела — строго специфические антитела, способные выявить минимальные различия в химическом составе и пространственной конфигурации молекул, являются продуктом отдельных клонов антителопродуцирующих клеток.

Парные сыворотки — сыворотки, взятые в самом начале заболевания и 2...3 недели спустя. Повышение титра антител в 4 раза и более считается основой положительной реакции.

Пассаж (фр. passage — переход) — последовательное заражение восприимчивых объектов (животные, куриные эмбрионы, культуры клеток) микроорганизмами.

Полимеразная цепная реакция (от англ. Polymerase Chain Reaction, ПЦР) — метод генодиагностики, основанный на многократном увеличении копий строго определенных фрагментов

Краткий словарь использованных ветеринарных терминов    657

iiiiiitiiiiiiiiiiitiiiiiiiniii........и.....................................................................................................................................................................................

молекулы ДНК вируса при помощи фермента термостабильной ДНК-полимеразы.

Реакция гемагглютииацки (РГА) — метод обнаружения и идентификации вирусов, основанный на способности многих вирусов, обладающих тканевым тропизмом, агглютинировать эритроциты определенных видов животных.

Реакция иммунофлуоресценции (РИФ) (лат. fluorescens — светящийся) — серологическая реакция, основанная на взаимодействии антиген — антитело, при этом один из компонентов, участвующий в реакции, связан с флуоресцирующим красителем.

Реакция нейтрализации (PH) — метод идентификации вируса, основанный на феномене потери им инфекционное™ в результате взаимодействия со специфическими антителами.

Реакция связывания компемента (РСК) — метод серологического исследования, основанный на способности образующегося комплекса антиген — антитело связывать комплемент, что выявляется по отсутствию гемолиза при добавлении гемолизина и эритроцитов.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) — метод идентификации вируса или выявления противовирусных антител в сыворотке крови, основанный на феномене отсутствия агглютинации эритроцитов вирусом, в присутствии специфических к нему антител.

РНК-содержащие вирусы — вирусы, имеющие один тип нуклеиновой кислоты — РНК, у большинства она представлена одной цепью, у некоторых — двухцепочечной структурой.

Сероваркант — самостоятельная группа внутри определенного вида и серогруппы (серотипа) микроорганизмов, обусловленная наличием антигенов, отличающихся от антигенов других микроорганизмов этого вида и серогруппы (серотипа), что выявляется с помощью серологических реакций.

Серогруппа (серотип) — самостоятельная группа внутри определенного вида микроорганизмов, обусловленная наличием антигенов, отличающихся от антигенов других микроорганизмов этого вида, что выявляется с помощью серологических реакций.

Серологические реакции — реакции, широко используемые при постановке диагноза инфекционных болезней, методы обнаружения антител и антигенов в крови и других тканях.

Сыворотка крови (лат. serum — сыворотка + sanguis — кровь) — составная часть крови, представляющая собой плазму, из которой удалены форменные элементы и фибрин в процессе свертывания крови.

Лабораторная диагностика вирусных болезней животных

Hllltlinll№limi<№llllllllimillllllUllllllllltt(IUIIIIIIKtlllllNII№lllll!NIIIIIIIIIIIMII1llllllHnillRMIIIRIIIIIHIIIMIII(NIJIIIIII№ll

Тельца включения — своеобразные морфологические образования, обнаруживаемые в цитоплазме или ядрах клеток определенных тканей при некоторых вирусных инфекциях и состоящие из скопления вирионов и вирусных белков.

Термолабильность (греч. thermos — теплый + лат. labilis — нестойкий) — неустойчивый к тепловому воздействию, изменяющийся при нагревании.

Термостабильность (греч. thermos — теплый + лат. stabilis — неизменный) — сохраняющий свои свойства при нагревании.

Титр вируса — концентрация инфекционных единиц вируса в определенном объеме материала.

Цитопатогеиное действие вирусов (ЦПД, цитопатический аффект) — специфическая морфологическая деструкция (разрушение) и функциональная патология зараженных вирусами клеток в культурах.

Штамм (нем. stamm — род, корень) — культура микроорганизмов одного вида с одинаковыми морфологическими и биологическими свойствами.

Элементарные тельца — см. Вирион (2, 3).

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ

СПИСОК

1.    Лабораторные исследования в ветеринарии. Вирусные, риккетсиозные и паразитарные болезни: справочник / под ред, Б. И. Антонова, ~ М.: Агропромиздат, 1987. — 240 с.

2.    Баку лов, И. А. Эпизоотологический словарь-справочник / И. А. Бакулов, Г. Г. Юрков, В. А. Ведерников [и др.]. — М.: Россельхозиздат, 1986.

3.    Нымм, Э. М. Словарь ветеринарных микробиологических и вирусологических терминов / Э. М. Нымм* К. А, Петерсон, Э. А. Аавер [и др.]. — М,: Росагропромиздат, 1989.

ПРЕДМЕТНЫЙ

УКАЗАТЕЛЬ

Агар мясо-пептонный (МПА) 101, 109, 125, 326, 357, 444, 456, 476, 433, 543, 533 Альбумин бычий 7, 235, 523 Аппарат Киппа 225, 435 Бульон мясо-пептонный (МПБ) 73, 101, 109, 225, 325, 444, 455, 475, 433, 435, 542, 533 —    триптозо-фосфатный 52 9 Буфер верокаловый 35, 375 —    боратный 243 —    фосфатно-солевой 2 74, 325, 323, 552, 554 “ калий-фосфатный 231, 236, 407 карбонатно-бикарбонатный 335, 561, 604, 618 Гемолизин 25, 224, 355, 369,    507 Гемолитическая система (гемсистема) 25, 116,216 Жидкость Руге 2 06, 446 —    Карнуа 108 Иммуноасцитическая жидкость (ИАЖ) 34 Комплемент 27, 116, 225, 333, 370,    507

Метод вирусоскопии 99, 443, 548 —    Кербера 55 —    иммуноферментного анализа (ИФА) 88, 159, 273, 223, 233, 244, 324, 323, 335, 349, 406, 409, 436,561, 603, 609, 52 7 —    кофал-теста 514 —    перекрестного иммунитета 54 —    полимеразной цепной реакции (ПЦР) 180, 253, 307, 342, 416, 425, 625 —    Рида и Менча 55, 242, 297, 324, 330, 394, 503, 523, 552, 555 —    электронной микроскопии 327, 593 Окраска гистопрепаратов по Ленцу 80 —    Турбиной 584 —    Туревичу 32,584 —    мазков по Борману — Гайнуллиной 74 —    Михину 74 —    Морозову 100, 446 —    Муромцеву 73 —    Пашену 100, 447 *— Селлерсу 74 Перевиваемая линия почки свиньи (СПЭВ) 73, 386, 392

---

Предметный указатель

662    Лабораторная    диагностика    вирусных    болезней    животных

II ИМНШШ1111111IIII1Ш1М1IIIII II ими ИМ.......................................................................................................................................................................................

—    непрямой иммунофлуо-ресценции (РНИФ) 5, 112, 292, 322 —    пассивной гемагглютинации (РПГА) 53 —    подавления иммунофлуоресценции 213, 386 —    радиальной иммунодиффузии (РРИД) 5, 276 —    серозащиты (РЗ) 65 —    связывания комплемента (РСК) 24, 35, 215, 268, 299, 368, 507 —    угнетения связывания комплемента (РУСК) 59 —    торможения (задержки) гемагглютинации (РТГА, РЗГА) 125,135, 144, 221, 262, 265, 272, 357, 361, 399, 448, 457, 477, 597 —    гемадсорбции (РТГАд) 142, 220, 262 —    непрямой гемагглютинации (РТНГА) 225 Среда 199, 323, 386, 486, 518, 540,590 —    0,5% -ногогидролизаталак-тальбумина 18, 70, 110,

240, 323, 386, 486, 518, 540, 589 —    5% -ногогемогидролизата 386 —    Игла 18, 70, 110, 486, 518, 540, 590 —    Игла (МЕМ) 289, 393 —    Китта-Тароцци 326, 542 —    поддерживающая 18, 323, 386, 393, 486, 618, 540, 590 —    ростовая 18, 296, 393, 486, 518, 590 Тельца Бабеша — Негри 74 Термолабильные ингибиторы 126, 403, 449, 480 Термостабильные ингибиторы 126, 480 Тканевая цитопатическая доза (ТЦДНЯ, 70,87,143, 380, 394, 544 Цитопатическое действие (ЦПД) 19, 70, 87,110,143, 219, 241, 324, 380, 388, 394, 486,544 Эритроцитарный диагностикум 55, 83, 325

---

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ЖИВОТНЫХ

Составители:

П, И. Барышников,

В. В. Разумовская

Издание второе, исправленное

ДОПУЩЕНО

Министерством сельского хозяйства РФ в качестве учебного пособия для студентов вузов, обучающихся по направлению подготовки ('специальности,) «Ветеринария»

ДОПУЩЕНО

УМО вузов РФ по образованию в области зоотехнии и ветеринарии в качестве учебного пособия для студентов вузов, обучающихся по направлению подготовки (специальности) «Ветеринария»

(квалификация (степень) «Ветеринарный врач»)

СОДЕРЖАНИЕ

X. Болезни, общие для всех

или нескольких видов животных...................5

Ящур..........................................5

количественному определению антител к вирусу ящура в сыворотке крови животных (утверждены 10 февраля 1983 г., №115-6а)............5

1.2.    Методические указания по выделению и идентификации штаммов вируса ящура (одобрены и рекомендованы

15 октября 1973 г_м б/н) ................20

Бешенство.................*..................72

1.3.    Методические указания

по лабораторной диагностике бешенства

(утверждены 27 февраля 1970 г,, б/н).....72

Болезнь Ауески................................82

1.4.    Методические указания по лабораторной

диагностике болезни Ауески животных (рекомендованы 18 мая 1978 г., б/н)......82

1.5.    Инструкция по применению набора для определения антител к гликопротеину gl

свиней методом конкурентного иммуноферментного анализа

«ZETECT-Серелиэа-АУЕСКИ-Ат»........88

Оспа.........................................98

1.6. Методические указания по лабораторной диагностике оспы крупного рогатого скота, овец, коз, свиней и верблюдов (утверждены 12 ноября 1985 г., № 115-6а) . 98

ББК 48.7я73 Л 12

Л12 Лабораторная диагностика вирусных болезней животных / Сост. П. И. Барышников, В, В. Разумовская: Учебное пособие. — 2-е изд., испр. — СПб.: Издательство «Лань», 2015.— 672с,: ил.— (Учебники для вузов. Специальная литература).

ISBN 978-5-8114-1882-4

Учебное издание содержит действующие методические указания, наставления и инструкции по лабораторной диагностике вирусных болезней животных, утвержденные Министерством сельского хозяйства СССР, РФ и Россельхозиадзором РФ. Документы систематизированы по видам животных, в большинстве прошли многолетнюю аппробацию в Алтайской краевой ветеринарной лаборатории и включены в «Перечень нормативной документации, разрешенной для использования в государственных ветеринарных лабораториях при диагностике болезней животных, рыб, пчел, а также контроля безопасности сырья животного и растительного происхождения» (по состоянию на июль 2011 г.). Приводятся предметный указатель и библиографический список.

Предназначено для студентов, обучающихся по специальности «Ветеринария» и направлению «Ветеринарно-санитарная экспертиза», ветеринарных врачей и лаборантов ветеринарных лабораторий.

ББК 48.7я73

Рецензенты:

И. И. ГУСЛАВСКИЙ — доктор ветеринарных наук, профессор кафедры микробиологии, эпизоотологии, паразитологии и ВСЕ) Алтайского государственного аграрного университета;

В, Я. ПЛЕШАКОВА — доктор ветеринарных наук, профессор, зав. кафедрой ветеринарной микробиологии, вирусологии и иммунологии Омского государственного аграрного университета им. П. А. Столыпина;

В. А СИНИЦЫН —• доктор ветеринарных наук, зав. отделом ФГБУ «Новосибирская межрегиональная ветеринарная лаборатория».

Обложка © Издательство «Лань», 2015 Е. А. ВЛАСОВА © Коллектив авторов, 2015 © Издательство «Лань»,

художественное оформление, 2015

7. Болезни плотоядных и пушных животных

.............................................................................................................

ПАРВОВИРУСНЫЙ ЭНТЕРИТ СОБАК

7.5.

НАСТАВЛЕНИЕ ПО ПРИМЕНЕНИЮ НАБОРА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИГЕНОВ ПАРВОВИРУСНОГО ЭНТЕРИТА СОБАК, ВИРУСНОГО ЭНТЕРИТА НОРОК И ПАНЛЕЙКОПЕНИИ КОШЕК ИММУНОФЕРМЕНТНЫМ АНАЛИЗОМ (ИФА) (утверждено в 2002 г.)

1. Общие положения.

1.1.    Назначение набора. Набор предназначен для выявления иммуноферментным анализом (ИФА) специфического антигена парвовирусного энтерита собак (БЭС), вирусного энтерита норок и панлейкопении кошек в биологическом материале от больных и экспериментально зараженных животных. Набор рассчитан на проведение 46 анализов (в двух повторах). Компоновка набора допускает возможность дробного использования компонентов для проведения нескольких серий анализов по мере поступления биоматериала.

1.2.    Состав набора. Набор состоит из 12 компонентов.

Специфические компоненты:

1) специфический иммуноглобулин G (IgG) к БЭС, лио-филизированный — 1 флакон, ОД мл;

604    Лабораторная    диагностика    вирусных    болезней    животных

......................................................................................................................И......шиш.........11|111Ш11|111|1111|Н1'|1111М111!|1|1ШШ1||1......... ШИ

2)    положительный контроль (К*) — специфический антиген ВЭС, лиофилизированный, ОД мл — 1 флакон;

3)    отрицательный контроль (К~) — лизат клеток без вируса, лиофилизированный, ОД мл — 1 флакон;

4)    конъюгат — меченный пероксидазой хрена слецифи* ческий иммуноглобулине к ВЭС, лиофилизированный, ОД мл — 1 флакон.

Неспецифические компоненты;

5)    1 М карбонатно-бикарбонатный буфер (КББ): pH 9,4,,.

9,6, жидкий, 11 мл — 1 флакон.

6)    20*кратный концентрат фосфатно-солевого, содержащего твин 20, буферного раствора (ФСБТ), pH 7,2...7,4, жидкий — 2 флакона по 25 мл;

7)    буферный раствор для разведения реагентов (БДР), pH 7,2...7,4, жидкий — 2 флакона по 20 мл;

8)    субстратный раствор с перекисью водорода для разведения хромогена (СР), жидкий, 5,1 мл — 1 флакон;

9)    хромоген — 3,3\5,5'-тетраметилбензидин (ТМБ) жидкий, 5 Д мл — 1 флакон;

10)    1 М серная кислота, стоп-раствор, жидкий, 5 Д мл — 1 флакон;

11)    плоскодонный полистироловый планшет 96-луноч-ный — 1 шт.;

12)    наставление по применению набора — 1 экз.

1.3.    Упаковка и маркировка. Компоненты набора выпускаются в закрытых флаконах. На флаконы с каждым компонентом наклеивают или наносят несмываемой краской по стеклу этикетки с указанием товарного знака и наименования предприятия-изготовителя, названия компонента, его номера и количества, номера серии и контроля, срока годности. На каждую коробку с диагностическим набором наклеивают этикетку, в которой указывают наименование и товарный знак предприятия-изготовителя, полное название набора, номер серии набора и контроля, срок годности, условия хранения и обозначение ТУ; в коробку вкладывают наставление по применению набора.

1.4.    Набор хранят при температуре от 2 до 8°С и относительной влажности не более 80%. Срок годности — 12 мес. с даты изготовления.

Примечание. Набор содержит все необходимые для анализа компоненты. Дополнительно требуются микропипетки на 10, 100, 200 и 1000 мкл, мерная лабораторная посуда, дистиллированная вода, суховоздушный термостат с температурой 37°С, спектрофотометр для иммуно-ферментного анализа со светофильтром на 450 нм.

ВНИМАНИЕ! В состав компонентов набора входят токсические консерванты — мертиолят и азид натрия. Не допускайте попадания их внутрь и на слизистые оболочки. Серная кислота вызывает раздражение при попадании на кожу и слизистые оболочки.

2.    Принцип метода.

2.1.    Метод основан на взаимодействии иммобилизованного на поверхности лунок планшета специфического иммуноглобулина с антигеном ВЭС из исследуемой пробы и последующем выявлении полученного комплекса конъюгатом (меченым пероксидазой хрена специфическим к антигену ВЭС иммуноглобулином G). Связанная перокси-даза вызывает разложение находящейся в хромоген-суб* стратном растворе перекиси водорода и окисление хромогена. В лунках развивается окраска, интенсивность которой прямо пропорциональна количеству антигена в определяемой пробе.

3.    Подготовка материала для анализа и рабочих растворов.

3.1.    Подготовка биологического материала.

Для анализа используют пробы фекалий, дефибрини-зированную кровь, а также участки тонкого и толстого отделов кишечника, взятые от павших или вынужденно убитых животных в первые часы после гибели. Из материала готовят 10%-ную суспензию на забуференном физрастворе (в набор не входит) и центрифугируют ее 10 мин при 2000...3000 об/мин. Анализируют полученный супернатант.

Предназначенный для исследования материал можно хранить в морозильной камере бытового холодильника. Размораживать только перед анализом!

Лабораторная диагностика вирусных болезней животных

3.2. Подготовка рабочих растворов.

3.2.1.    Перед началом работы все компоненты выдерживают не менее 0,5 ч при комнатной температуре.

3.2.2.    Буфер для растворения специфического иммуноглобулина G — карбонатно-бикарбонатный буфер (флакон 5 — КББ) готов к употреблению.

3.2.3.    Рабочий раствор для промывки планшетов (ФСБТ), Содержимое флаконов 6 растворяют в 1000 мл дистиллированной воды. Готовый раствор стабилен 3 сут при 4°С. Для более длительного хранения неиспользованный раствор замораживают и хранят при -20°С.

3.2.4.    Раствор для блокировки свободной поверхности лунок и для растворения положительного (К⁺) и отрицательного (К") контролей и конъюгата (флакон 7, БДР) готов к употреблению.

3.2.5.    Рабочий хромоген-субстратный раствор. Раствор хромогена (ТМБ — флакон 9) разводят субстратным раствором (флакон 8) в соотношении 1:1 и перемешивают. Пример: для приготовления 5 мл рабочего раствора к 2,5 мл раствора ТМБ добавляют 2,5 мл субстратного раствора. Раствор готовят непосредственно перед использованием.

3.2.6.    Раствор специфического иммуноглобулина для сенсибилизации планшета. Содержимое флакона 1 растворяют в 11 мл КББ. Раствор готовят непосредственно перед использованием,

3.2.7.    Раствор положительного контроля (К⁺). Содержимое флакона 2 — специфический антиген — растворяют в 2 мл БДР (флакон 7). Раствор готовят непосредственно перед использованием. Неиспользованный раствор фасуют в пробирки типа «Эппендорф» по 0,25 мл и хранят при температуре -20°С и ниже до следующего исследования, избегая повторного замораживания.

3.2.8.    Раствор отрицательного контроля (К"). Содержимое флакона 3 — лизат клеток без вируса — растворяют в 2 мл БДР (флакон 7). Раствор готовят непосредственно перед использованием. Неиспользованный раствор фасуют в пробирки типа «Эппендорф» по 0,25 мл и хранят при температуре ~20^оС и ниже до следующего исследования, избегая повторного замораживания.

7. Болезни плотоядных и пушных животных

3.2.9.    Раствор конъюгата. Содержимое флакона 4 — конъюгат — растворяют в 0,1 мл БДР (флакон 7) и доводят объем до 10 мл этим же буфером. Раствор готовят непосредственно перед использованием. Неиспользованный раствор фасуют в пробирки типа «Эппендорф* по 0,8 мл и хранят при температуре -20°С и ниже до следующего исследования, избегая повторного замораживания.

3.2.10.    Раствор для остановки реакции (стоп-раствор, флакон 10) готов к употреблению.

4. Постановка реакции.

4.1.    Во все лунки планшета вносят по 100 мкл раствора специфического иммуноглобулина G (см. п, 3,2.6).

4.2.    Планшет помещают в полиэтиленовый пакет и инкубируют 3...4 ч при 37°С или 18 ч при 4°С.

4.3.    Планшет промывают 4 раза буфером ФСБТ (300 мкл/лунка) (см, п, 3.2.3), каждый раз полностью удаляя жидкость из лунок постукиванием перевернутого планшета по фильтровальной бумаге.

4.4.    Во все лунки планшета вносят по 200 мкл буфера БДР (см. п. 3.2.4). Планшет помещают в полиэтиленовый пакет и инкубируют 0,5 ч при 37°С.

4.5.    ВНИМАНИЕ! Если количество образцов для исследования не позволяет использовать планшет полностью, то неиспользованные стрипы замораживают с раствором БДР. Стрипы помещают в полиэтиленовый пакет и хранят до момента использования при температуре от -20 до -40°С, не допуская повторного замораживания. По мере необходимости стрипы размораживают, промывают раствором ФСБТ и используют в реакции, начиная с п. 4.6).

4.6.    В лунки А1...В1 вносят по 100 мкл БДР — контроль конъюгата.

4.7.    В лунки C1...D1 вносят по 100 мкл раствора отрицательного контроля (К") (см. п. 3.2.8).

4.8.    В лунки EI...F1 вносят по 100 мкл раствора положительного контроля (К⁺) (см. п. 3.2.7),

4.9.    В остальные лунки вносят по 100 мкл исследуемых образцов (см. п. 3.1) (по 2 лунки на каждый образец).

608    Лабораторная    диагностика    вирусных    болезней    животных

UHiHiiHiiimwuuuiuiHiwtHuniuiiuKUiwuiiiuiiiutuimiiiLwiuLiiiuuuuuiuuiiwUuiimwHiiiuiiiiHiiLiHiMinniiuiuLiiMwiumitiHiiuiiiumuuHiiunuimKuiiiHiiiiiiiA^iiiu

4.10.    Планшет помещают в полиэтиленовый пакет и инкубируют 1 ч при 37°С.

4.11.    Планшет 4 раза промывают буфером ФСБТ (см. п, 4.3),

4.12.    Во все лунки планшета вносят по 100 мкл конъюгата (см. п. 3,2.9).

4.13.    Планшет помещают в полиэтиленовый пакет и инкубируют 1 ч при 37°С.

4.14.    Планшет 4 раза промывают буфером ФСБТ (см. п, 4.3).

4.15.    Во все лунки планшета вносят по 100 мкл рабочего хромоген-субстратного раствора (см. п. 3.2,5),

4.16.    Планшет инкубируют 20 мин при комнатной температуре в темном месте.

4.17.    Реакцию останавливают добавлением во все лунки планшета 50 мкл стоп-раствора (флакон 10).

5. Учет и интерпретация результатов.

5.1.    Визуальный учет. (Останавливать реакцию не рекомендуется.) Лунки с положительным контролем должны иметь сине-голубое окрашивание до остановки реакции (желтое после остановки реакции). Лунки с отрицательным контролем и контролем конъюгата должны оставаться бесцветными (до и после остановки реакции). Лунки с исследуемыми образцами, в которых присутствует специфический антиген, имеют сине-голубое (желтое после остановки реакции) окрашивание различной интенсивности в зависимости от концентрации антигена.

Реакцию считают положительной, когда заметна четкая разница в интенсивности окрашивания опытных и контрольных отрицательных (К") лунок планшета.

5.2.    Инструментальный учет.

Результаты ИФА учитывают спектрофотометрически при длине волны 450 нм после остановки реакции кислотой. Положительной считают реакцию при соотношении величины оптической плотности в лунке с исследуемой пробой (Р) к величине оптической плотности в лунке с отрицательным контролем (N) (P/N), равном не менее 2Д. Величина оптической плотности для положительного контроля (К⁺) должна быть не ниже 0,4 единиц.

1

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ • * МОСКВА -• КРАСНОДАР• •2015-