СПРАВОЧНИК

ЛАБОЛТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ВЕТЕРИНАРИИ 1 БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ИНФЕКЦИИ

СПРАВОЧНИК

ЛАБОРАТОРНЫЕ

ИССЛЕДОВАНИЯ

В ВЕТЕРИНАРИИ

•

БАКТЕРИАЛЬНЫЕ

ИНФЕКЦИИ

Под редакцией Б. И. АНТОНОВА

МОСКВА АГРОПРОМИЗДАТ 1986

ПРЕДИСЛОВИЕ

В деле выполнения решении партии и правительства по дальнейшему развитию животноводства, а также задач, поставленных Продовольственной программой страны, ветеринарной службе большую помощь оказывают ветеринарные лаборатории.

Ветеринарные лаборатории осуществляют диагностику инфекционных и паразитарных болезней животных, выявляют нарушения обмена веществ в их организме, проводят исследования, направленные на предупреждение отравлений, помогая тем самым специалистам совхозов, колхозов и других хозяйств успешно осуществлять лечебнопрофилактические мероприятия. От того, насколько своевременно ставится диагноз, разработаны и рекомендованы профилактические и лечебные меры, зависит успех ликвидации болезней, сохранность поголовья животных и повышение их продуктивности.

Последнее время в лабораториях появилось много приборов и приспособлений, облегчающих труд специалистов и позволяющих проводить исследования на более современном и качественном уровне, с большой достоверностью. В связи с этим многие ранее действовавшие методические указания переработаны.

Кроме того, ежегодно для лабораторной практики предлагаются новые методы диагностики. В отечественной и зарубежной литературе постоянно публикуется большое количество материалов о новых методах исследований, предлагаются различные модификации существующих методик, вводятся дополнительные диагностические тесты.

Ветеринарные лаборатории в своей работе не могут использовать всего многообразия имеющихся в литературе методов исследования или из-за того, что они недостаточно апробированы, или из-за сложности применяемого оборудования. Иногда методы, предлагаемые различными авторами, при определении одних и тех же показателей дают несовпадающие результаты.

В связи с этим в справочник включены методы лабораторных исследований патологического материала, получаемого от больных, убитых или павших сельскохозяйственных животных, апробированные Центральной ветеринарной лабораторией и утвержденные Главным управлением ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР. Книга содержит методические указания по диагностике инфекционных болезней бактериальной этиологии, а также методические указания по применению культур клеток в диагностических исследованиях.

Методики изложены по единой схеме,- взятие и пересылка патологического материала, методы его обработки и обогащения; бактериоско-пические исследования, включая световую и люминесцентную микроскопию; выделение культур возбудителей инфекционных болезней на питательных средах; заражение лабораторных животных как с целью выделения чистой культуры возбудителя, так и определения степени ее патогенности; гистологические исследования; идентификация и дифференциация возбудителей с использованием различных методов; серологические исследования для определения вида возбудителя.

Приведенные в справочнике методы лабораторных исследований унифицированы и стандартизированы. В широком смысле слова унификация и стандартизация подразумевают применение для различных исследований одних и тех же аппаратов, приборов, инструментов, посуды, реактивов, исключая, конечно, специальные методы исследования; применение стандартных (унифицированных) питательных сред и диагностикумов; разработку методических указаний по единой форме. Все это позволяет лабораторным работникам с меньшей затратой сил и средств, на высоком методическом и техническом уровне, качественно и в срок проводить диагностические исследования. Таким образом, стандартизация методов исследования явится способом наведения строгого порядка в работе ветеринарных лабораторий.

Книга предназначена для ветеринарных врачей, фельдшеров, а также лаборантов ветеринарных диагностических лабораторий.

В справочник не вошли материалы по диагностике туберкулеза, так как они пересматриваются и дополняются, поэтому их публикация будет осуществлена в последующих изданиях.

Временные методические указания по постановке реакции диск-преципитации при диагностике сибирской язвы и идентификации ее возбудителя

(Утверждены Главным управлением ветеринарии Минсельхоза СССР 24 июня 1980 г.)

1.    Общие положения.

1.1.    Реакция диск-преципитации используется при диагностике сибирской язвы и дифференциации ее возбудителя от подобных ему сапрофитных микробов рода Bacillus.

1.2.    Реакция диск-преципитации основана на взаимодействии антигена — нативных продуктов метаболизма растущего в жидкой питательной среде возбудителя сибирской язвы — с антителами преци-питирующей сибиреязвенной сыворотки, выражающемся образованием диска прецитггации в слое агарового геля, расположенного между антигеном и сывороткой.

1.3.    Реакцию диск-преципитации используют при исследовании только свежего патологического материала.

Загнивший материал исследуют по реакции преципитации, поставленной общепринятым пробирочным методом с экстракцией антигенов.

2.    Компоненты реакции, материалы и приготовление системы-

2.1.    Для постановки реакции диск-преципитации необходимо иметь:

преципитирующую сибиреязвенную сыворотку;

очищенный 1%-ный агаровый гель (приготовление см. в приложении) или 1%-ный агар Дифко;

жидкую питательную среду, пригодную для культивирования возбудителя сибирской язвы (мясо-пептонный бульон, среда ГКИ, бульон Хоттингера с 40% инактивированной сыворотки крови или др.);

стерильные бактериологические пробирки, мерные и пастеровские пипетки.

2.2.    Приготовление системы для постановки реакции диск-преци-питацми.

2.2.1.    Преципитирующую сибиреязвенную сыворотку разливают по 0.5—1 мл в стерильные бактериологические пробирки.

2.2.2.    На поверхность сыворотки, по стенке пробирки, наслаивают мерной или пастеровской пипеткой расплавленный и охлажденный до 45—50°С 1%-ный агаровый гель столбиком высотой 5—7 мм. Пробирки необходимо держать в вертикальном положении до застывания агара.

2.2.3.    На поверхность застывшего агара вносят 1 — 1,5 мл жидкой питательной среды. При идентификации культур, выделенных из объек-

тов внешней среды и сырья животного происхождения, в качестве жидкой питательной среды лучше использовать среду ГКИ или бульон Хоттиигера с сывороткой крови, в этом случае одновременно можно провести исследование на капсулообразовапие.

2.2.4. Систему готовят и используют в день постановки реакции.

3.    Постановка реакции диск-преципитации.

3.1.    При исследовании патологического материала и мяса вынужденно убитых животных посев проводят пастеровской пипеткой в мясо-пептонный бульон, находящийся над слоем агарового геля. Не следует вносить в среду большое количество крови или крупные кусочки крове-наполненных органов, так как это затрудняет обнаружение специфического диска преципитации вследствие окрашивания геля.

3.2.    При идентификации культур посевы делают из каждой колонии в отдельности или высевают суспензию, приготовленную из нескольких колоний (5—10).

3.3.    Посевы выдерживают в термостате при 37—38°С в течение 16— 20 ч.

4.    Учет результатов.

4.1.    Учет результатов проводят визуально через 1G—20 ч инкубации посевов в термостате и при отрицательном результате — повторно через 3—4 ч дополнительной инкубации.

4.2.    Пробирки вынимают из термостата и оставляют на 10—15 мин при комнатной температуре, после чего просматривают в проходящем свете на черном фоне.

4.3.    Возбудитель сибирской язвы образует в средней части столбика агарового геля тонкую с четкими границами белую линию (диск) преципитации, которая сохраняется в течение 4 дн.

4.4.    Почвенные сибиреязвенноподобные сапрофитные баЦиллы, за исключением некоторых штаммов Вас. anthracoides, дают отрицательный результат (диск преципитации отсутствует). Эти штаммы через 16— 20 ч образуют в нижней части агарового столбика на границе с преци-питирующей сывороткой рыхлую зону преципитации, которая не имеет четких границ и значительно толще, чем диск преципитации, образуемый возбудителем сибирской язвы. Через 36—40 ч зона преципитации, образуемая Вас. anthracoides, разрыхляется и сливается с преципити-рующей сывороткой.

4.5.    В качестве контроля при постановке реакции могут быть использованы посевы из противосибиреязвенной вакцины СТИ.

5.    Оценка результатов.

5.1.    При исследовании патологического материала и мяса вынужденно убитых животных полученные результаты оценивают, как и результаты реакции преципитации, поставленной общепринятым методом.

5.2.    При исследовании выделенных культур поступают следующим образом.

5.2.1.    Культуры, давшие положительные результаты по реакции диск-преципитации или нечеткие результаты (рыхлое кольцо), идентифицируют общепринятыми методами в соответствии с действующими методическими указаниями.

5.2.2.    В случае обнаружения диска преципитации при посеве суспензии из нескольких культур каждую культуру, включенную в суспензию, исследуют отдельно теми же методами.

5.2.3.    Культуры, давшие отрицательный результат, дальнейшему исследованию не подлежат.

Приложение Приготовление очищенного 1%-ного агарового геля

Сначала готовят нейтральную дистиллированную воду (pH 7,0). Для этого определяют pH имеющейся дистиллированной воды и в зависимости от полученных результатов ее нейтрализуют 1%-ным раствором двууглекислой соды (при кислой реакции) или 0,1%-ным раствором соляной кислоты (при щелочной реакции).

Необходимое для нейтрализации количество раствора определяют следующим способом: к 100 мл воды небольшими порциями (миллилитрами или каплями) добавляют один из указанных растворов, постоянно определяя pH; по достижении нейтральной реакции (pH 7,0) точно учитывают количество раствора, пошедшее на нейтрализацию 100 мл воды. Затем рассчитывают количество раствора, необходимое для нейтрализации всего объема дистиллированной воды.

Берут 5 г агар-агара, заливают 300 мл нейтральной дистиллированной воды, ставят в кипящую водяную баню и нагревают до полного расплавления агар-агара.

Одновременно готовят водный раствор .белка куриного яйца. Берут охлажденное яйцо массой не менее 56 г и отделяют белок, который тщательно взбивают до образования пенистой массы, и растворяют в 200 мл нейтральной дистиллированной воды. Приготовленный раствор белка делят на две части по 100 мл.

В расплавленный агар добавляют 0,5 г хлористого кальция (СаС1₂«

• 6Ы₂0), растворяют его и охлаждают до 50°С. Затем вливают 100 мл водного раствора белка куриного яйца, ставят в кипящую водяную баню .и нагревают до появления хлопьев коагуляции (примерно 15—20 мин).

Если белок не свертывается или коагуляция происходит плохо, то вносят еще 0,25—0,5 г хлористого кальция и продолжают нагревать до появления хлопьев коагуляции.

Горячий агар фильтруют через предварительно смоченный в горячей дистиллированной воде и отжатый ватный фильтр.

К профильтрованному агару добавляют вторую часть (100 мл) водного раствора яичного белка, хорошо смешивают и снова нагревают в кипящей водяной бане до появления хлопьев коагуляции. В случае плохого свертывания белка поступают так же, как и при внесении первой порции (см. выше).

После свертывания белка агар вновь фильтруют в горячем виде.

Очищенный 1%-ный агаровый гель должен быть прозрачным.

Отфильтрованный агаровый гель разливают в пробирки или колбы и стерилизуют автоклавированием при 0,5 атм в -течение 20 мин.

Если после автоклавирования выпадает осадок, агаровый гель фильтруют и стерилизуют повторно.

Готовую среду хранят в холодильнике (2—4°С) и используют в течение 6 мес.