ЛАБСШОРНЬЕ

ИССЛЕДОВАНИЯ В ВЕТШ/1НАРИИ

БАКТЕИ^АЛЬНЫЕ

ИНТЕКЦИИ

СПРАВОЧНИК

ЛАБОРАТОРНЫЕ

ИССЛЕДОВАНИЯ

В ВЕТЕРИНАРИИ

•

БАКТЕРИАЛЬНЫЕ

ИНФЕКЦИИ

Под редакцией Б. И. АНТОНОВА

МОСКВА АГРОПРОМИЗДАТ 1986

Схема титрования комплемента в бактериолигической системе

Компоненты, мл Первый ряд пробирок Второй ряд пробирок 1 2 3 4 3 б 7 1 2 3 4 S б 7. Количество сыворотки разведения 1:10 0,5 0.5 0,5 0.5 0.5 0.5 0,5 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1,0 Антиген в титре 1:100 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Нет Нет Нет Нет Нет Нет Нет Количество комплемента 0.16 0.19 0,22 0,25 0,28 0,31 0.34 0,16 0,19 0,22 0,25 0,28 0,31 0,34 Недостающее количество физиологического раствора 0.34 0.31 0,28 0.25 0,22 Водяная баня 0,19 при 37 0,16 0,34 0,31 —383С 20 мин 0,28 0,25 0,22 0,19 0,16 Гемснстема (гемолизин в рабочем титре 0,5 мл + +0.5 мл 2.5% -ной 1,0 1,0 1,0 1,0 1.0 1,0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

взвеси эритроцитов)

Водяная баня при 37—38°С 20 мин

лемеита, Б — общее количество пробирок, находящихся в опыте, и В — разведение комплемента 1 : 20, т. е. (0,31 X 100) : 20=1,55 мл.

Титрование паратуберкулезного антигена. Титрование антигена проводят по квадратной схеме с использованием позитивной (средней активности — титр не выше 1 : 30) и нормальной сывороток. Позитивная сыворотка высылается Сибирским НИВИ одновременно с антигеном.

Для постановки опыта паратуберкулезную сыворотку разводят 1:5, 1 : 10, I : 20 и нормальную, взятую от здоровых животных,— 1 : 10. Сыворотки инактивируют при температуре 61—62°С 30 мин, после чего разливают в пробирки по 0,5 мл. Паратуберкулезный антиген разводят физиологическим раствором 1 : 10. При этом соблюдают следующие правила: на дно пробирки наливают 1 мл антигена и к нему по каплям (по стенке пробирки) добавляют при помешивании 9 мл физиологического раствора; образовавшуюся мутноватую жидкость смешивают пипеткой и оставляют для созревания на 20—30 мин. Из полученного основного разведения антигена 1 : 10 готовят последующие 1 : 20, I : 40, 1 : 60 и т. д. (схема 4).

Схема 4

Номер пробирки Требуется Получаемое разведение антигена основного разведения антигена 1:10, мл физраствора, мл 1 2 2 1 20 2 1 3 1 40 3 1 5 1 G0 4 0,5 3.5 1 80 5 0,5 4.5 1 100 6 0,5 5,5 1 120 7 0,5 6,5 1 140 8 0,5 7,5 1 160 9 0,5 8,5 1 180 10 0,5 9,5 1 200 11 0,5 10,5 1 220

В каждую пробирку с паратуберкулезной (1:5, 1 : 10, 1 : 20) и нормальной (1 : 10) сыворотками добавляют по 0,5 мл соответствующего разведения антигена (I : 20, 1 : 40, 1 : 60 и т. д.). Комплемент, гемолизин и эритроциты берут в рабочих титрах (схема 5).

В качестве контроля на самозадерживающие свойства берут антиген по 0,5 мл во всех разведениях без сывороток. Полный гемолиз эритроцитов со всеми разведениями антигена без сыворотки и с нормальной сывороткой указывает на отсутствие самозадерживающих свойств антигена. Контроли ставят с нормальной и позитивной сыворотками в разведении 1 : 5 и 1 : 10 с вытитрованным ранее антигеном и без пего. Контроли комплемента, гемолизина, эритроцитов ставят в рабочей дозе.

Учет реакции проводят на следующий день после постановки. Показания реакции во всех пробирках оценивают по гемолитической шкале в процентах -гемолиза. Примерный результат титрования пара-туберкулезного антигена представлен в схеме 6.

Рабочим титром антигена считается удвоенное количество его,

Схема титрования паратуберкулезного антигена

Компоненты, мл Раамгдеиме антигена Сыворотха 1:20 1:40 1:60 1:80 1:100 1:120 1:140 1:160 1:180 1:200 I : 22 0 без антигена Антиген паратуберкулез-ный 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 _ Одно разведение сыворотки 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5+0.5 физраствора Комплемент в рабочем титре 0,5 0.5 0,5 0.5 Водяная баня 0,5 0,5 0,5 0,5 при 37—36°С 20 мин 0.5 0.5 0.5 0.5 Гемолизин в рабочем титре 0.5 0.5 0.5 0,5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Взвесь эритроцитов в раз- 0.5 0.5 0.5 0.5 0,5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Водяная баня при 37—3SFC 20 мин

Схема 6

Результат титрования паратуберкулезного антигена

		Разведение позитивной			сыворотки
Разведение антигена	1 :20	1 НО	1 :60	1 :80	1:100	1:120

1:5	0	0	0	0	0	Q
1:10	0	0	0	0	0	0
1:20	20	10	10	0	0	0
Нормальная сыворотка 1:10	100	100	100	100	100	100
с антигеном Антиген без сыворотки	100	100	100	100	100	100

Продолжение Разведение позитивной сыворотки Сыво- ротка Разведение антигена без 1 1 140 1:160 1:180 1:200 1:220 анти- гена 1:5 0 0 0 0 0 100 1:10 0 0 0 0 10 100 1:20 0 0 0 0 20 100 Нормальная сыворотка 1:10 100 100 100 100 100 — с антигеном Антиген без сыворотки 100 100 100 100 100 —

Обозначения. 0-лолняя задержка гемолиза; цифры соответствуют проценту гемолиза эритроцитов. В приведенной схеме предельный титр антигена 112 00, рабочий 1:100.

давшее полную задержку гемолиза с паратуберкулезной сывороткой в разведении 1:10, при наличии гемолиза с нормальной сывороткой (1 : 10).

Например, конечный титр антигена 1 : 200, рабочий титр 1 : 100, конечный титр 1 : 300, рабочий титр 1 : 150 и т. д.

Результаты титрования антигена заносят в лабораторную книгу. Раз протитрованнын антиген может использоваться в реакции в том же титре в течение 5 лет при условии его хранения в темном месте при температуре 12—14°С.

Постановка главного опыта. Реакцию ставят в объеме 2,5 мл всех предварительно титрованных компонентов. Все испытуемые сыворотки крупного рогатого скота и овец берут в дозах 0,1 (разведение 1 : 5) и 0,05 (разведение 1 : 10) и инактивируют при 61—62°С 30 мин.

Постановку главного опыта проводят по схеме 7.

При постановке главного опыта ставят контроли нормальной и позитивной сывороток в разведении I : 5 и 1 : 10 с антигеном, а также без него.

Контроли: комплемента (комплемент 0,5-{-1,5мл физраствора+ 4- 0,5 мл 2,5%-ной взвеси эритроцитов баранов), гемсистемы (0,5 мл комплемента Ч* 1,0 мл физраствора + 1 мл гемсистемы) и антигена в рабочей дозе (0,5 мл комплемента 4 0,5 мл антигена -j- 0,5 мл физраство-

Помер пробирки Компоненты, мл 1 - контроль 2 3 Испытуемая сыворотка 0,1 0,1 0,05 Физиологический раствор 0,9 0,4 0,45 Инактивация при 01—62°С 30 мин Антиген в рабочем титре 1:100 Без антигена 0,5 0,5 Комплемент в рабочем титре 0,5 0,5 0,5 Водяная баня при 37—38°С 20 мин Гемсистсма (гемолизин в рабочем титре 1,0 1,0 1,0 0,5 мл и 0,5 мл 2,5%-ной взвеси эритроцитов барана)

Водяная баня при 37—38°С 20 мин

ра + 1,0 мл гемсистсмы). При массовом исследовании допускается постановка реакции в одной пробирке с дозой сыворотки 0,1 мл (разведение 1:5). Сыворотки, давшие ту или иную степень задержки гемолиза, проверяют вторично в дозах 0,1 и 0,05 мл с контролем в дозе 0,1 мл.

Диагностической дозой сыворотки, но которой дастся результат, является 0,05 мл, доза 0,1 мл является вспомогательно-контрольной.

Оценка результатов реакции. Результат реакции оценивается 2 раза: первый — сразу после водяной бани, второй — на следующий день через 14—16 ч нахождения при комнатной температуре в условиях, исключающих воздействие на них солнечного света, тепла и других факторов. Последняя читка реакции является окончательной.

Результаты реакции отмечают крестами:

(+++4*)1 (+++) — положительная реакция;

(++); (+) — сомнительная реакция;

(—) — отрицательная реакция.

Степень задержки, выраженная крестами, соответствует следующим процентам гемолиза эритроцитов:

(Н—{-4*4") — гемолиз эритроцитов от 0 до 10%;

(4-4*4-) —    »    »    от    10 до    40%;

(-j—j-) —    »    »    от    40 до    70%;

(4-) —    »    »    от    70 до    90%;

(—) —    »    »    от    90 до    100%.

Результаты исследования сообщают словами: положительная, сомнительная, отрицательная, с указанием крестов. Данные всех опытов титрования и особенностей реакции вносят в книгу серологических исследований.

Оценку результатов реакции крестами проводят в процентах гемолиза эритроцитов. Для этого уз реакции выбирают 5 пробирок с полным гемолизом, жидкость сливают в одну пробирку и из нее готовят разведение с различным процентом гемолиза (от 10 до 90) по следующей схеме.

кость, мл Физраствор, мл Процент гемолиза

1 2 3 4 Б 6 7 8 9 жид- 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Сыворотки крови от животных, которые дают сомнительную реакцию, подлежат повторному исследованию РСК через 2—3 нед после первого исследования.

Представленные на исследование сыворотки должны быть свежими, не более 3-дневной давности с момента Взятия крови. Сыворотки загнившие, проросшие и гемолизированные для исследования непригодны.

i 04

ПРЕДМЕТНЫЙ УКАЗАТЕЛЬ

е

Агар глюкозо-кровяной 227 —    дрожжевой 27 —    картофельный 82 —    кровяной 230 —    молочно-солевой 228 —    мясо-пептонный печеночно* глюкозо - глицериновый (МППГГА) 82 —    печеночно-аминопептидный 85 —    печен очно-глюкозо-глицериновый (ГИТА) 82 —    плотный печеночно-сывороточный 85 —    полужидкий печеночно-сывороточный 85 —    полужидкий с дефибриниро-ванной кровью 248 —    сывороточно-декстрозный 85 —    шоколадный 239 Бульон глюкозо-сывороточный 227 —    дрожжевой 27 —    мясо-пептон ный печеночный (МППБ) 82 —    печен оч но-глюк озо-глицериновый 82 —    с желчью 10%-ный 186, 227 —    40%-ный 230 Вода мясная 82 —    печеночная 82 Выбор питательных сред 271 Гель агаровый 1%-ный 31 Дезагрегация ткани 314 Жидкость Карнуа 309 Индикатор для определения анаэробных условий 39 Консервирующая смесь глицериновая 185 --фосфатная буферная 185 Лизис желчью 225

Метод выявления капсулообра-зования 13, 14 —    определения вирулентности сибиреязвенных культур 14 —    флуоресцирующих антител (МФА) 180 Молоко с метиленовым синим 228 —    с 0,02%-ньм метиленовым синим 230 Обнаружение индола 217 Окраска мазков гематоксилин-эозином 309 --по Козловскому 81 --по методу Гипса 239 --по Романовскому — Гим- зе 309 --по Стампу 81 --по Фельгену 309 --по Шуляку — Шину 82 Определение гемолитической активности 8 —    концентрации углекислого газа 85 Получение и подготовка эритроцитов барана для постановки РСК и РДСК 86 Приготовление индикаторных бумажек 187 Раствор антибиотиков 272 —    веронал-мединаловый буферный 329 —    версена 282 —    гидролизата лактоальбумииа 0,5%-ный 283 —    гидролизата мышечных белков 0,3%-ный 282 —    глицерина 216 —    двууглекислого натрия 282 —    двухромовокислого калия 279 —    полиэтиленгликоля 326 —    Тироде 281 —    трипсина 283 —    уксусной кислоты 282

---

—    физиологический хлорида натрия с добавлением ионов магния и кальция (для постановки РСК и РДСК) 86 —    Хенкса 281 —    хлориду натрия феиолезиро-ванные для.РА 86 Реактив биуретовый 328 —    йодистый калий 328 Реакция диффузной преципитации в геле 333 —    с метилротом 218 —    нейтрализации с целью выявления антител к вирусу инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи 332 —    непрямой гемагглютинации (РПГА) 332 —    преципитации 8 —    связывания комплемента (РСК) 334 —    торможения гемагглютина-ции (РТГА) 332 —    Фогеса — Проскауэра 218 —    Эрлиха 181 —    метиленового синего 226 Среда Биттера с рамнозой 187 —    водно-сывороточная 145 —    дифференциальная висмут-сульфат-агар 186 -- Левина 186 --Плоски рева 186 --трехуглеводная с мочевиной 186 --Эндо 186 —    для обнаружения сероводорода 216 —    для определения способности бактерий расщеплять мочевину 218    н —    для посева по Свену — Гарду 187 —    Дюбуа — Смита 90 —    Заксе 243 —    Игла 282, 324

—    из гидролизата мышцы сердца крупного рогатого скота 252 —    из куриного мяса 260 —    Кларка 218 —    Клиглера 217 —    комбинированная Олькениц-кого 216 —    Мартена 251, 260 —    плотная ВИЭВ для изоляции кампилобактерий 125, 126 —    сафранино-железо-новобиоци-новая 123, 124 —    Симмонса 216 —    с лактозой 252 —    с повышенным содержанием лактозы 187 —    с теллуритом калия 228 —    триптический перевар бычьего сердца 337 —    Ферворта — Вольфа в модификации С. И. Тарасова 146 —    Флетчера 146 —    6,5%-ного хлорида натрия 228 —    Хоттингера 259 —    Эдварда 258 —    энтерококковая дифференциально-диагностическая 228 Среды индикаторные с амидочерным 168 --с конгоротом 168 --с лакмусом 167 --с метил ротом 167 --с нейтральротом и метиленовой синью 167 --обогащения Кауфмана 186 --Киллиана 186 --Мюллера 186 -- селенитовая 185 —    плотные питательные 252 Тест «жемчужного ожерелья» 6,7 Фаготипирование 17—28 Экстракт дрожжевой 252 Эритрит-агар 85

---

СОДЕРЖАНИЕ

©

Предисловие........................ 3

Методы диагностики бактериальных инфекций....... 5

Сибирская язва....................    5

Методические указания по лабораторной диагностике сибирской язвы ..................... 5

Методические указания по обнаружению возбудителя сибирской язвы в сырье животного происхождения и объектах

внешней среды..................... 9

Временное наставление по применению сибиреязвенного бактериофага «К» ВИЭВ для определения возбудителя сибирской язвы..................... 17

Временное наставление по применению сибиреязвенного фага «Гамма-MBA» для определения возбудителя сибирской

язвы.......................... 28

Временные методические указания по постановке реакции диск-преципитации при диагностике сибирской язвы и идентификации ее возбудителя................ 29

Наставление по исследованию кожевенного и мехового сырья

на сибирскую язву реакцией преципитации ....... 31

Эмфизематозный карбункул................. 37

Методические указания по лабораторной диагностике эмфизематозного карбункула................. 37

Злокачественный отек.................... 40

Методические указания по лабораторным исследованиям

на злокачественный отек животных.......... 40

Брадзот овец........................ 44

Методические указания по лабораторной диагностике брад-

зота овец....................... 44

Инфекционная энтеротоксемия животных и анаэробная дизентерия ягнят......................... 48

Методические указания по лабораторной диагностике инфекционной энтеротоксемии животных и анаэробной дизентерии ягнят....................... 48

Столбняк.......................... 52

Методические указания по лабораторной диагностике столбняка .......................... 52

Ботулизм.......................... 53

Методические указания по лабораторной диагностике ботулизма .......................... 53

Некробактериоз ....................... 56

Методические указания по лабораторной диагностике некро-

бактериоза....................... 56

Копытная гниль овец и    коз................ 58

Приложение к «Инструкции по профилактике и ликвидации копытной гнили овец    и    коз» .............. 58

Временные методические указания по обнаружению возбудителя копытной гнили в патологическом материале от больных овец с помощью непрямого метода иммунофлуоресценции .......................... 59

Бруцеллез......................... 60

Наставление по диагностике бруцеллеза    животных ...    60

Паратуберкулез ...................... 89

Наставление по диагностике паратуберкулезного энтерита

(паратуберкулеза) крупного рогатого скота ....... 89

Методика обнаружения в патологическом материале возбудителей туберкулеза и паратуберкулеза методом люминесцентной микроскопии.................. 92

Временное наставление по' постановке реакции связывания комплемента для диагностики паратуберкулеза крупного рогатого скота и овец с антигеном Сибирского научно-исследовательского ветеринарного института    ........ 94

Сап............................ 104

Методические указания по лабораторной диагностике сапа 104

Кампилобактериоз (вибриоз)................ 112

Извлечение из временной инструкции по диагностике, профилактике и ликвидации вибриоза крупного рогатого скота и овец........................ 112

Наставление по применению вибриозных агглютинирующих моноспецифических сывороток.............. 116

новой среды (СЖН) при лабораторной диагностике вибриоза 123 Временные рекомендации Центральной ветеринарной лаборатории по приготовлению и применению плотной среды ВИЭВ

для изоляции кампилобактерий............. 125

Наставление по применению кампилобактериозного (вибри-озного) антигена для реакции агглютинации с вагинальной

слизью (РАВС).................... 126

Лептоспироз......................... 128

Методические указания по лабораторной диагностике леп-

тоспнроза животных.................. 128

Методические указания по применению групповых агглютинирующих лептоспирозных сывороток.......... 146

Методические указания по применению флуоресцирующего

глобулина для    диагностики лептоспироза ....... 148

Листериоз......................... 151

Наставление по лабораторной диагностике листериоза животных ......................... 151

Методические указания по применению набора лиофилизи-рованных бактериофагов для идентификации возбудителя

листериоза....... 169

Рожа свиней........................ 170

Методические указания по лабораторным исследованиям на

рожу свиней...................... 170

Наставление по применению сухих рожистых люминесцирующих сывороток (для прямого метода иммунофлуоресценции) .......................... 173

Пастереллез........................ 175

Наставление по лабораторной диагностике пастереллеза птиц 175

Сальмонеллезы....................... 177

Методические указания по бактериологической диагностике

сальмонеллезов животных................ 177

Наставление по применению наборов сывороток сальмонел-лезных О-комплексных и монорецепторных О и Н-агглюти-нирующнх для экспресс-идентификации сальмонелл в РА па

стекле......................... 192

Наставление по применению комплексной и групповых саль-монеллезных флуоресцирующих сывороток (для прямого метода иммунофлуоресценции)............... 195

Временная методика серологической диагностики сальмонеллеза овец в реакции непрямой (пассивной) гемагглютина-

ции (РИГА)...................... 205

Наставление по применению серогрупповых антигенов и сывороток В, С| и Di для диагностики сальмонеллеза в пробирочной реакции агглютинации (РА) ......... 207

Колибактериоз....................... 209

Методические указания по бактериологической диагностике колибактериоза (эшерихиоза) животных....... 209

Наставление по применению агглютинирующих О-коли-

сывороток....................... 218

Диплококковые заболевания............. .    .    221

Методические указания по лабораторным исследованиям на пневмококковую (диплококковую) инфекцию животных 221

Стрентококкозы сельскохозяйственных животных...... 224

Методические указания по лабораторной диагностике стреп-

тококкоза животных.................. 224

Методические указания по лабораторной диагностике стрептококковой септицемии птиц............... 228

Методические указания по лабораторной диагностике стрептококкового полиартрита ягнят .............. 230

Методические указания по лабораторной диагностике мыта 233

Псевдомоноз........................ 235

Временное наставление по применению набора О-агглютини-рующих сывороток для диагностики псевдомоноза ....    235

Гемофил езы......................... 237

Временные методические указания по лабораторной диагностике гемофилезного полисерозита свиней....... 237

Временные методические указания по лабораторной диагностике гемофилезной плевропневмонии свиней..... 240

Методические указания по лабораторной диагностике контагиозного метрита лошадей................ 243

Микоплазмозы....................... 248

Методические указания по лабораторной диагностике инфекционной агалактии овец и коз............ 248

Методические указания по лабораторной диагностике инфекционной плевропневмонии коз............ 253

Наставление но диагностике респираторного микоплазмоза

птиц.......................... 257

Реакция агглютинации для диагностики респираторного микоплазмоза птиц с цельной кровью (ККРА) и сывороткой крови (СКРА)..................... 264

ПРЕДИСЛОВИЕ

В деле выполнения решении партии и правительства по дальнейшему развитию животноводства, а также задач, поставленных Продовольственной программой страны, ветеринарной службе большую помощь оказывают ветеринарные лаборатории.

Ветеринарные лаборатории осуществляют диагностику инфекционных и паразитарных болезней животных, выявляют нарушения обмена веществ в их организме, проводят исследования, направленные на предупреждение отравлений, помогая тем самым специалистам совхозов, колхозов и других хозяйств успешно осуществлять лечебнопрофилактические мероприятия. От того, насколько своевременно ставится диагноз, разработаны и рекомендованы профилактические и лечебные меры, зависит успех ликвидации болезней, сохранность поголовья животных и повышение их продуктивности.

Последнее время в лабораториях появилось много приборов и приспособлений, облегчающих труд специалистов и позволяющих проводить исследования на более современном и качественном уровне, с большой достоверностью. В связи с этим многие ранее действовавшие методические указания переработаны.

Кроме того, ежегодно для лабораторной практики предлагаются новые методы диагностики. В отечественной и зарубежной литературе постоянно публикуется большое количество материалов о новых методах исследований, предлагаются различные модификации существующих методик, вводятся дополнительные диагностические тесты.

Ветеринарные лаборатории в своей работе не могут использовать всего многообразия имеющихся в литературе методов исследования или из-за того, что они недостаточно апробированы, или из-за сложности применяемого оборудования. Иногда методы, предлагаемые различными авторами, при определении одних и тех же показателей дают несовпадающие результаты.

В связи с этим в справочник включены методы лабораторных исследований патологического материала, получаемого от больных, убитых или павших сельскохозяйственных животных, апробированные Центральной ветеринарной лабораторией и утвержденные Главным управлением ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР. Книга содержит методические указания по диагностике инфекционных болезней бактериальной этиологии, а также методические указания по применению культур клеток в диагностических исследованиях.

Методики изложены по единой схеме,- взятие и пересылка патологического материала, методы его обработки и обогащения; бактериоско-пические исследования, включая световую и люминесцентную микроскопию; выделение культур возбудителей инфекционных болезней на питательных средах; заражение лабораторных животных как с целью выделения чистой культуры возбудителя, так и определения степени ее патогенности; гистологические исследования; идентификация и дифференциация возбудителей с использованием различных методов; серологические исследования для определения вида возбудителя.

Приведенные в справочнике методы лабораторных исследований унифицированы и стандартизированы. В широком смысле слова унификация и стандартизация подразумевают применение для различных исследований одних и тех же аппаратов, приборов, инструментов, посуды, реактивов, исключая, конечно, специальные методы исследования; применение стандартных (унифицированных) питательных сред и диагностикумов; разработку методических указаний по единой форме. Все это позволяет лабораторным работникам с меньшей затратой сил и средств, на высоком методическом и техническом уровне, качественно и в срок проводить диагностические исследования. Таким образом, стандартизация методов исследования явится способом наведения строгого порядка в работе ветеринарных лабораторий.

Книга предназначена для ветеринарных врачей, фельдшеров, а также лаборантов ветеринарных диагностических лабораторий.

В справочник не вошли материалы по диагностике туберкулеза, так как они пересматриваются и дополняются, поэтому их публикация будет осуществлена в последующих изданиях.

Временное наставление по постановке реакции связывания комплемента для диагностики паратуберкулеза крупного рогатого скота и овец с антигеном Сибирского научно-исследовательского ветеринарного института

(Утверждено Г л явным управлением ветеринарии Минсельхоза СССР 31 мая 1968 г.)

Реакция связывания комплемента (РСК) проводится в водяной бане при температуре 37—38°С в общем объеме 2,5 мл всех компонентов.

Компоненты реакции:

испытуемая сыворотка и сыворотки нормальная и позитивная для титрования комплемента в бактериолитической системе, инактивированные в день постановки реакции при температуре 61—62°С в течение 30 мин;

паратуберкулезный антиген — спиртовой (метиловый) экстракт бактерий паратуберкулеза;

гемолизин в рабочем титре;

комплемент — сыворотка крови морской спинки (свежая, сухая или консервированная);

2,5%-ная взвесь эритроцитов барана (овцы) на физиологическом растворе (1 : 40 от осадка);

физиологический раствор (0,85%-ный х. ч. NaCl в дистиллированной воде).

Титрование компонентов реакции. Перед постановкой главного опыта проводят титрование: а) гемолизина; б) комплемента в гемолитической системе и в) комплемента в бактериолитической системе.

Титрование гемолизина. Для титрования гемолизина вначале готовят основное его разведение I : 100, из которого готовят последующие I : 500, 1 : 800, 1 : 1000, 1 : 1200 и т. д. до предельного титра, указанного на этикетке.

Примечание. Так как гемолизин консервирован глицерином в равных частях, то для получения основного разведения 1 : 100 берут 0,2 мл гемолизина и 9,8 мл физиологического раствора.

При приготовлении разведения гемолизина пользуются следующей схемой.

Основного разведения	Физиологического	Получаемое
гемолизина 1:100, мл	раствора, мл	разведение
0,1	0,4	1:500
0,!	0,7	1:800
0,1	0,9	1:1000
0,1	и	1:1200
0,1	1,4	1:1500
0,1	1.7	1:1800
0,1	1,9	1:2000
0,1	2,1	1:2200
0,1	2,3	1:2400
0.1	2,5	1:2000
0,1	2,7	1:2800
0,1	2,9	1:3000

В реакцию входят: гемолизин в соответствующих разведениях, 0,5 мл комплемента в разведении 1 : 20, 0,5 мл 2,5%-ной взвеси эритроцитов барана и 1 мл физиологического раствора (взамен паратуберкулезного антигена и сыворотки). Время течения реакции — 10 мин в водяной бане при температуре 37—38°С.

При титровании гемолизина ставят следующие контроля: 1) контроль гемолизина (гемолизин I : 100-|-2,5%-ная взвесь эритроцитов -f--f физиологический раствор до объема 2,5 мл при отсутствии комплемента); 2) контроль комплемента (комплемент -f- эритроциты -|- физиологический раствор до объема 2,5 мл при отсутствии гемолизина).

Примечание. Сухой комплемент предварительно переводят в жидкое состояние, как указано на этикетке, а затем готовят разведение I : 20 физиологическим раствором.

3) контроль физраствора (эритроциты физиологический раствор до объема 2,5 мл при отсутствии гемолизина и комплемента). Во всех контрольных пробирках гемолиз эритроцитов должен отсутствовать.

Титрование гемолизина приведено в схеме 1.

Титром гемолизина считается наименьшее количество (наибольшее разведение) его, потребное для полного гемолиза 0,5 мл 2,5%-ной взвеси эритроцитов при комплементе 0,5 мл в разведении 1 : 20 в течение 10 мин в водяной бане при температуре 37—38°С.

Рабочей дозой гемолизина для титрования комплемента, паратубер-кулезного антигена, а также для реакции при испытании сывороток животных (в главном опыте) берут удвоенный титр гемолизина, т. е. если титр гемолизина при его подтитровке равен 1 : 2000, то в главном опыте берут разведение его 1 : 1000. Гемолизйн в титре ниже чем I : 1000 для работы непригоден.

Примечание. Для дальнейшей работы рекомендуется смешивание гемолизина в рабочем титре и 2,5%-ной взвеси эритроцитов барана в одинаковых объемах (гемолитическая система). После смешивания гемолитическую систему ставят в термостат при 37—38°С на 30 мин.

Схема титрования гемолизина

Разделение гемолизина Контроли Компоненты, мл 1:600 1:800 1:1000 1:1200 1:1800 1:1800 1:2000 1:2200 гемолизин па 1 100 компле мента физиологи ческого раствора

Гемолизин (в разведе- 0.5 0.5 0.5 0,5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 — — ннях) Физиологический рас- 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.5 1.5 2.0 твор Комплемент 1:20 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 — 0,5 — 2,5%-ная взвесь ври- 0.5 0.5 0,5 0.5 0.5 0,5 0.5 0.5 0,5 0.5 0.5

троцитов

Водяная баня при 37—3&С 10 мин Результаты    Г    Г    Г    Г    Г    Г    Г    НГ    НГ    НГ    НГ

Г-гемолиз; НГ-отсутствие гемолиза.

Титрование комплемента в гемолитической системе. Титрование комплемента проводят, как указано в схеме 2. Комплемент исследуют в следующих дозах: 0,1; 0,13; 0,16; 0,19; 0,22; 0,25; 0,28 и т. д. с интервалом по 0,03 до 0,4 разведения комплемента 1 : 20. В каждую пробирку до недостающего количества объема 0,5 мл доливают физраствор (1-я пробирка 0,4 мл физраствора, 2-я — 0,37 мл и т. д.).

Титром комплемента в гемолитической системе считается наименьшее его количество, потребное для полного гемолиза 0,5 мл 2,5%-ной взвеси эритроцитов в течение 10 мин в водяной бане при температуре 37—38°С.

Титрование комплемента в бактерполитической системе. Титрование комплемента в бактериолнтической системе проводят с сыворотками того вида животных (крупного рогатого скота или овец), которые исследуют в главном опыте.

Для титрования берут две сыворотки — нормальную от здорового животного и позитивную. Обычно позитивные сыворотки используют консервированные 5%-ным карболовым физиологическим раствором (1 мл раствора -+• 9 мл сыворотки), а нормальные сыворотки подбирают по возможности одинаковой давности с испытуемыми. Обе сыворотки разводят физраствором 1 : 5 и 1 : 10, разливают по пробиркам (2—3 мл каждой сыворотки отдельно и инактивируют при 61—62°С 30 мин. После чего сыворотку в разведении 1 : 10 и все остальные ингредиенты разливают по пробиркам, как указано в схеме 3).

Нормальную и позитивную сыворотки в разведении 1 : 5 и 1 : 10 используют для контроля в главном опыте.

Дозу комплемента (из основного разведения 1 : 20) берут на дра интервала ниже против титра его в гемолитической системе, т. е. если титр комплемента в гемолитической системе 0,22, то титрование комплемента в бактериолнтической системе начинают с 0,16; 0,19; 0,22 и т. д.

С каждым разведением комплемента ставят контроль сыворотки без антигена.

После разлива по пробиркам нормальной и позитивной сывороток, паратуберкулезного антигена в рабочем титре (см. примечание по разведению антигена), комплемента в соответствующих дозах разведения 1 : 20 (0,16, 0,19 и т. д.) и недостающего количества (до 0,5 мл) физиологического раствора пробирки помещают для связывания па 20 мин в водяную баню при 37—38°С. Затем в пробирки добавляют гемолитическую систему по 1 мл и ставят в водяную башо на 20 мин при температуре 37—38°С.

Титром комплемента в бактериолнтической системе будет такое его минимальное количество, которое необходимо для полного гемолиза взвеси эритроцитов в течение 20 мин при 37—38°С в пробирках с нормальной сывороткой, с антигеном и без него, с паратуберкулезной сывороткой без антигена, при одновременной задержке гемолиза в пробирках с паратуберкулезной сывороткой и специфическим антигеном.

После установления титра комплемента в бактериолнтической системе проводят расчет комплемента для главного опыта одним из следующих способов

способ 1-й — предположим, что в бактериолнтической системе титр комплемента в разведении 1 : 20 равен 0,31. Следовательно, в каждой пробирке содержится комплемента 0,0155 (0,31 : 20—0,0155).

Если необходимо провести исследование 100 пробирок сыворотки, то чистого комплемента потребуется 1,55 мл (0,0155Х100= 1 »55) и 48,45 мл физиологического раствора;

способ 2-й — по формуле Ль : В, где А — означает титр комп-

Схема титрования комплемента в гемолитической системе

Номер* пробирок

Компоненты, мл 1 5 3 « S в 7 в 9 10 II Комплемент (1:20) 0.1 0,13 0,16 0,19 0,22 0,25 0,28 0,31- 0,34 0,37 0,40 Недостающее количество физраствора 0.4 0,37 0,34 0.31 0.28 0.25 0.22 0,19 0.16 0.13 0.1 Физраствор вместо антигена и сыво- 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 ротки Гемсистеиа: 1) гемолизин в рабочем титре 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 2) взвесь эритроцитов барана 1:40 0.5 0.5 0.5 0.5 0,5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Водяная баня при 37—3fFС 10 мин