ЛАБСШОРНЬЕ

ИССЛЕДОВАНИЯ В ВЕТШ/1НАРИИ

БАКТЕИ^АЛЬНЫЕ

ИНТЕКЦИИ

СПРАВОЧНИК

ЛАБОРАТОРНЫЕ

ИССЛЕДОВАНИЯ

В ВЕТЕРИНАРИИ

•

БАКТЕРИАЛЬНЫЕ

ИНФЕКЦИИ

Под редакцией Б. И. АНТОНОВА

МОСКВА АГРОПРОМИЗДАТ 1986

вора уксуснокислого таллия на дистиллированной воде) и пенициллин из расчета 1000 ЕД/мл.

2.9. После внесения добавок среды проверяют на стерильность.

ПРЕДМЕТНЫЙ УКАЗАТЕЛЬ

е

Агар глюкозо-кровяной 227 —    дрожжевой 27 —    картофельный 82 —    кровяной 230 —    молочно-солевой 228 —    мясо-пептонный печеночно* глюкозо - глицериновый (МППГГА) 82 —    печеночно-аминопептидный 85 —    печен очно-глюкозо-глицериновый (ГИТА) 82 —    плотный печеночно-сывороточный 85 —    полужидкий печеночно-сывороточный 85 —    полужидкий с дефибриниро-ванной кровью 248 —    сывороточно-декстрозный 85 —    шоколадный 239 Бульон глюкозо-сывороточный 227 —    дрожжевой 27 —    мясо-пептон ный печеночный (МППБ) 82 —    печен оч но-глюк озо-глицериновый 82 —    с желчью 10%-ный 186, 227 —    40%-ный 230 Вода мясная 82 —    печеночная 82 Выбор питательных сред 271 Гель агаровый 1%-ный 31 Дезагрегация ткани 314 Жидкость Карнуа 309 Индикатор для определения анаэробных условий 39 Консервирующая смесь глицериновая 185 --фосфатная буферная 185 Лизис желчью 225

Метод выявления капсулообра-зования 13, 14 —    определения вирулентности сибиреязвенных культур 14 —    флуоресцирующих антител (МФА) 180 Молоко с метиленовым синим 228 —    с 0,02%-ньм метиленовым синим 230 Обнаружение индола 217 Окраска мазков гематоксилин-эозином 309 --по Козловскому 81 --по методу Гипса 239 --по Романовскому — Гим- зе 309 --по Стампу 81 --по Фельгену 309 --по Шуляку — Шину 82 Определение гемолитической активности 8 —    концентрации углекислого газа 85 Получение и подготовка эритроцитов барана для постановки РСК и РДСК 86 Приготовление индикаторных бумажек 187 Раствор антибиотиков 272 —    веронал-мединаловый буферный 329 —    версена 282 —    гидролизата лактоальбумииа 0,5%-ный 283 —    гидролизата мышечных белков 0,3%-ный 282 —    глицерина 216 —    двууглекислого натрия 282 —    двухромовокислого калия 279 —    полиэтиленгликоля 326 —    Тироде 281 —    трипсина 283 —    уксусной кислоты 282

---

—    физиологический хлорида натрия с добавлением ионов магния и кальция (для постановки РСК и РДСК) 86 —    Хенкса 281 —    хлориду натрия феиолезиро-ванные для.РА 86 Реактив биуретовый 328 —    йодистый калий 328 Реакция диффузной преципитации в геле 333 —    с метилротом 218 —    нейтрализации с целью выявления антител к вирусу инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи 332 —    непрямой гемагглютинации (РПГА) 332 —    преципитации 8 —    связывания комплемента (РСК) 334 —    торможения гемагглютина-ции (РТГА) 332 —    Фогеса — Проскауэра 218 —    Эрлиха 181 —    метиленового синего 226 Среда Биттера с рамнозой 187 —    водно-сывороточная 145 —    дифференциальная висмут-сульфат-агар 186 -- Левина 186 --Плоски рева 186 --трехуглеводная с мочевиной 186 --Эндо 186 —    для обнаружения сероводорода 216 —    для определения способности бактерий расщеплять мочевину 218    н —    для посева по Свену — Гарду 187 —    Дюбуа — Смита 90 —    Заксе 243 —    Игла 282, 324

—    из гидролизата мышцы сердца крупного рогатого скота 252 —    из куриного мяса 260 —    Кларка 218 —    Клиглера 217 —    комбинированная Олькениц-кого 216 —    Мартена 251, 260 —    плотная ВИЭВ для изоляции кампилобактерий 125, 126 —    сафранино-железо-новобиоци-новая 123, 124 —    Симмонса 216 —    с лактозой 252 —    с повышенным содержанием лактозы 187 —    с теллуритом калия 228 —    триптический перевар бычьего сердца 337 —    Ферворта — Вольфа в модификации С. И. Тарасова 146 —    Флетчера 146 —    6,5%-ного хлорида натрия 228 —    Хоттингера 259 —    Эдварда 258 —    энтерококковая дифференциально-диагностическая 228 Среды индикаторные с амидочерным 168 --с конгоротом 168 --с лакмусом 167 --с метил ротом 167 --с нейтральротом и метиленовой синью 167 --обогащения Кауфмана 186 --Киллиана 186 --Мюллера 186 -- селенитовая 185 —    плотные питательные 252 Тест «жемчужного ожерелья» 6,7 Фаготипирование 17—28 Экстракт дрожжевой 252 Эритрит-агар 85

---

СОДЕРЖАНИЕ

©

Предисловие........................ 3

Методы диагностики бактериальных инфекций....... 5

Сибирская язва....................    5

Методические указания по лабораторной диагностике сибирской язвы ..................... 5

Методические указания по обнаружению возбудителя сибирской язвы в сырье животного происхождения и объектах

внешней среды..................... 9

Временное наставление по применению сибиреязвенного бактериофага «К» ВИЭВ для определения возбудителя сибирской язвы..................... 17

Временное наставление по применению сибиреязвенного фага «Гамма-MBA» для определения возбудителя сибирской

язвы.......................... 28

Временные методические указания по постановке реакции диск-преципитации при диагностике сибирской язвы и идентификации ее возбудителя................ 29

Наставление по исследованию кожевенного и мехового сырья

на сибирскую язву реакцией преципитации ....... 31

Эмфизематозный карбункул................. 37

Методические указания по лабораторной диагностике эмфизематозного карбункула................. 37

Злокачественный отек.................... 40

Методические указания по лабораторным исследованиям

на злокачественный отек животных.......... 40

Брадзот овец........................ 44

Методические указания по лабораторной диагностике брад-

зота овец....................... 44

Инфекционная энтеротоксемия животных и анаэробная дизентерия ягнят......................... 48

Методические указания по лабораторной диагностике инфекционной энтеротоксемии животных и анаэробной дизентерии ягнят....................... 48

Столбняк.......................... 52

Методические указания по лабораторной диагностике столбняка .......................... 52

Ботулизм.......................... 53

Методические указания по лабораторной диагностике ботулизма .......................... 53

Некробактериоз ....................... 56

Методические указания по лабораторной диагностике некро-

бактериоза....................... 56

Копытная гниль овец и    коз................ 58

Приложение к «Инструкции по профилактике и ликвидации копытной гнили овец    и    коз» .............. 58

Временные методические указания по обнаружению возбудителя копытной гнили в патологическом материале от больных овец с помощью непрямого метода иммунофлуоресценции .......................... 59

Бруцеллез......................... 60

Наставление по диагностике бруцеллеза    животных ...    60

Паратуберкулез ...................... 89

Наставление по диагностике паратуберкулезного энтерита

(паратуберкулеза) крупного рогатого скота ....... 89

Методика обнаружения в патологическом материале возбудителей туберкулеза и паратуберкулеза методом люминесцентной микроскопии.................. 92

Временное наставление по' постановке реакции связывания комплемента для диагностики паратуберкулеза крупного рогатого скота и овец с антигеном Сибирского научно-исследовательского ветеринарного института    ........ 94

Сап............................ 104

Методические указания по лабораторной диагностике сапа 104

Кампилобактериоз (вибриоз)................ 112

Извлечение из временной инструкции по диагностике, профилактике и ликвидации вибриоза крупного рогатого скота и овец........................ 112

Наставление по применению вибриозных агглютинирующих моноспецифических сывороток.............. 116

новой среды (СЖН) при лабораторной диагностике вибриоза 123 Временные рекомендации Центральной ветеринарной лаборатории по приготовлению и применению плотной среды ВИЭВ

для изоляции кампилобактерий............. 125

Наставление по применению кампилобактериозного (вибри-озного) антигена для реакции агглютинации с вагинальной

слизью (РАВС).................... 126

Лептоспироз......................... 128

Методические указания по лабораторной диагностике леп-

тоспнроза животных.................. 128

Методические указания по применению групповых агглютинирующих лептоспирозных сывороток.......... 146

Методические указания по применению флуоресцирующего

глобулина для    диагностики лептоспироза ....... 148

Листериоз......................... 151

Наставление по лабораторной диагностике листериоза животных ......................... 151

Методические указания по применению набора лиофилизи-рованных бактериофагов для идентификации возбудителя

листериоза....... 169

Рожа свиней........................ 170

Методические указания по лабораторным исследованиям на

рожу свиней...................... 170

Наставление по применению сухих рожистых люминесцирующих сывороток (для прямого метода иммунофлуоресценции) .......................... 173

Пастереллез........................ 175

Наставление по лабораторной диагностике пастереллеза птиц 175

Сальмонеллезы....................... 177

Методические указания по бактериологической диагностике

сальмонеллезов животных................ 177

Наставление по применению наборов сывороток сальмонел-лезных О-комплексных и монорецепторных О и Н-агглюти-нирующнх для экспресс-идентификации сальмонелл в РА па

стекле......................... 192

Наставление по применению комплексной и групповых саль-монеллезных флуоресцирующих сывороток (для прямого метода иммунофлуоресценции)............... 195

Временная методика серологической диагностики сальмонеллеза овец в реакции непрямой (пассивной) гемагглютина-

ции (РИГА)...................... 205

Наставление по применению серогрупповых антигенов и сывороток В, С| и Di для диагностики сальмонеллеза в пробирочной реакции агглютинации (РА) ......... 207

Колибактериоз....................... 209

Методические указания по бактериологической диагностике колибактериоза (эшерихиоза) животных....... 209

Наставление по применению агглютинирующих О-коли-

сывороток....................... 218

Диплококковые заболевания............. .    .    221

Методические указания по лабораторным исследованиям на пневмококковую (диплококковую) инфекцию животных 221

Стрентококкозы сельскохозяйственных животных...... 224

Методические указания по лабораторной диагностике стреп-

тококкоза животных.................. 224

Методические указания по лабораторной диагностике стрептококковой септицемии птиц............... 228

Методические указания по лабораторной диагностике стрептококкового полиартрита ягнят .............. 230

Методические указания по лабораторной диагностике мыта 233

Псевдомоноз........................ 235

Временное наставление по применению набора О-агглютини-рующих сывороток для диагностики псевдомоноза ....    235

Гемофил езы......................... 237

Временные методические указания по лабораторной диагностике гемофилезного полисерозита свиней....... 237

Временные методические указания по лабораторной диагностике гемофилезной плевропневмонии свиней..... 240

Методические указания по лабораторной диагностике контагиозного метрита лошадей................ 243

Микоплазмозы....................... 248

Методические указания по лабораторной диагностике инфекционной агалактии овец и коз............ 248

Методические указания по лабораторной диагностике инфекционной плевропневмонии коз............ 253

Наставление но диагностике респираторного микоплазмоза

птиц.......................... 257

Реакция агглютинации для диагностики респираторного микоплазмоза птиц с цельной кровью (ККРА) и сывороткой крови (СКРА)..................... 264

Наставление по постановке РСК при перипневмоиии крупного рогатого скота.................. 265

Дизентерия свиней..................... 268

Методические указания по лабораторным исследованиям на

дизентерию свиней, вызываемую трепонемой....... 268

Методические указания по определению чувствительности к антибиотикам возбудителей инфекционных болезней сельскохозяйственных животных................ 270

Методические указания по применению культур клеток в диагностических исследованиях.................. 279

Методические рекомендации по получению, культивированию и использованию в научных и производственных ветеринарных лабораториях первичных, перевиваемых и диплоидных культур

клеток животного происхождения.............. 279

Наставление по применению гидролизата мышечных белков ферментативного сухого (ФГМ-С) для питательных сред тканевых

культур.......................... 298

Рекомендации по профилактике, диагностике контаминнрования культур клеток микроорганизмами и    меры    по    их    деконтаминации 299

Методические указания по получению и применению в вирусологической практике перевиваемых линий клеток из лимфоидных

органов крупного рогатого скота и    почек    теленка...... 314

Методические рекомендации по очистке сыворотки крови крупного рогатого скота, используемой для культивирования клеточных

культур.......................... 326

Временное наставление по получению, контролю и использованию сыворотки крови животных для культивирования клеток и

вирусологических исследований............... 337

Предметный указатель................... 347

ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ВЕТЕРИНАРИИ:

Бактериальные инфекции

Составители: Борис Иванович Антонов,

Валерия Валентиновна Борисова, Галина Михайловна Волкова и др.

Заведующий редакцией В. Г. Федотов. Редактор В. Н. Сайта над и. Художник А. И. Бершачевская. Художественный редактор М. Д. Северина. Технический редактор Е. В. Соломович. Корректоры Н. fl. Туманова, Т. Н. Бобрикова, М. В. Писарева

ИБ № 4308

Сдано в набор 13.06.85. Подписано к печати 06-12.85. Т-22156. Формат 84хЮ8‘/«- Бумага тип. №3. Гарнитура литературная. Печать высокая. Уел. псч. л. 18.18. Уел. кр.-отт. 18,48. Уч -изд. л. 27,27.. Изд. № 360 Тираж 2 9000. экз. Заказ Л¹? 419 . Цена 1 р. 4 0 к.

Ордена Трудооого Красного Знамени ВО «АгропроМиздат», 107807, ГСП, Москва, Б-53, ул. Садовая-Сласская, 18 Набрано в ордена Октябрьской Революции и ордена Трудового Красного Знамени МПО «Первая Образцовая типография имени А. А. Жданова»Союзполиг-рафпрома при Государственном комитете СССР по делам издательств, полиграфии и книжной торговли: 1 13054, Москва, Валовая, 28

Отпечатано с матриц во Владимирской типографии СоюЗполиграфпрома при Государственном комитете СССР по долам издательств, полиграфии и книжной торговли, 600000, г. Владимир, Октябрьский проспект, д. 7.

ББК 48.73 Л 12

УДК 619:616.9—08(031)

Составители: Б. И. Антонов, В. В. Борисова, Я. М. Волкова, »/7. Я. Каменева, Л. В. Кошеленко, Г. А. Михальский, В. В. Лоповцев, Л. И. Прянишникова, В. Е. Храпова

Лабораторные исследования в ветеринарии. Бакте-Л12 риальные инфекции: Справочник/Сост. Б. И. Антонов, В. В. Борисова, П. М. Волкова и др.; Под ред. Б. И. Антонова.— М.: Агропромиздат, 1986.— 352 с.

В книге даны методы лабораторных исследований патологического материала с целью определения возбудителя нпфекционноЛ болезни. Они изложены по единой схеме: бактериологические и бактериоскопнческие исследования, биопроба, идентификация и дифференциация возбудителей. Методы унифицированы и стандартизированы

Для ветврачей и фельдшеров, лаборантов ветеринарных лабораторий.

3805020000-079 035 (01)-86

© ВО «Агропромиздат», 1986

ПРЕДИСЛОВИЕ

В деле выполнения решении партии и правительства по дальнейшему развитию животноводства, а также задач, поставленных Продовольственной программой страны, ветеринарной службе большую помощь оказывают ветеринарные лаборатории.

Ветеринарные лаборатории осуществляют диагностику инфекционных и паразитарных болезней животных, выявляют нарушения обмена веществ в их организме, проводят исследования, направленные на предупреждение отравлений, помогая тем самым специалистам совхозов, колхозов и других хозяйств успешно осуществлять лечебнопрофилактические мероприятия. От того, насколько своевременно ставится диагноз, разработаны и рекомендованы профилактические и лечебные меры, зависит успех ликвидации болезней, сохранность поголовья животных и повышение их продуктивности.

Последнее время в лабораториях появилось много приборов и приспособлений, облегчающих труд специалистов и позволяющих проводить исследования на более современном и качественном уровне, с большой достоверностью. В связи с этим многие ранее действовавшие методические указания переработаны.

Кроме того, ежегодно для лабораторной практики предлагаются новые методы диагностики. В отечественной и зарубежной литературе постоянно публикуется большое количество материалов о новых методах исследований, предлагаются различные модификации существующих методик, вводятся дополнительные диагностические тесты.

Ветеринарные лаборатории в своей работе не могут использовать всего многообразия имеющихся в литературе методов исследования или из-за того, что они недостаточно апробированы, или из-за сложности применяемого оборудования. Иногда методы, предлагаемые различными авторами, при определении одних и тех же показателей дают несовпадающие результаты.

В связи с этим в справочник включены методы лабораторных исследований патологического материала, получаемого от больных, убитых или павших сельскохозяйственных животных, апробированные Центральной ветеринарной лабораторией и утвержденные Главным управлением ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР. Книга содержит методические указания по диагностике инфекционных болезней бактериальной этиологии, а также методические указания по применению культур клеток в диагностических исследованиях.

Методики изложены по единой схеме,- взятие и пересылка патологического материала, методы его обработки и обогащения; бактериоско-пические исследования, включая световую и люминесцентную микроскопию; выделение культур возбудителей инфекционных болезней на питательных средах; заражение лабораторных животных как с целью выделения чистой культуры возбудителя, так и определения степени ее патогенности; гистологические исследования; идентификация и дифференциация возбудителей с использованием различных методов; серологические исследования для определения вида возбудителя.

Приведенные в справочнике методы лабораторных исследований унифицированы и стандартизированы. В широком смысле слова унификация и стандартизация подразумевают применение для различных исследований одних и тех же аппаратов, приборов, инструментов, посуды, реактивов, исключая, конечно, специальные методы исследования; применение стандартных (унифицированных) питательных сред и диагностикумов; разработку методических указаний по единой форме. Все это позволяет лабораторным работникам с меньшей затратой сил и средств, на высоком методическом и техническом уровне, качественно и в срок проводить диагностические исследования. Таким образом, стандартизация методов исследования явится способом наведения строгого порядка в работе ветеринарных лабораторий.

Книга предназначена для ветеринарных врачей, фельдшеров, а также лаборантов ветеринарных диагностических лабораторий.

В справочник не вошли материалы по диагностике туберкулеза, так как они пересматриваются и дополняются, поэтому их публикация будет осуществлена в последующих изданиях.

МИКОПЛАЗМОЗЫ

Методические указания по лабораторной диагностике инфекционной агалактии овец и коз

(Утверждены Главным управлением ветеринарии Минсельхоза СССР 15 февраля 1984 г.)

1. Общие положения.

1.1.    Инфекционная агалактия овец и коз — контагиозная болезнь, вызываемая специфическим возбудителем Mycoplasma agalac-tiae и характеризующаяся преимущественным поражением молочной железы, суставов и глаз.

1.2.    Возбудитель агалактии-—мелкий полиморфный организм, вместо истинной клеточной стенки имеет цитоплазматическую мембрану. Минимальные репродуктивные единицы возбудителя проходят через бактериальные фильтры.

1.3.    Диагноз на инфекционную агалактию ставят на основании эпизоотологических, клинических и патологоанатомических данных, а также результатов лабораторных исследований.

1.4.    Материалом для исследования от животных с клиническим!, признаками болезни служат: молоко — при заболевании вымени, синовиальная жидкость — из пораженных суставов; от павших и вынужденно убитых животных — паренхиматозные органы (почка, часть печени, селезенка), лимфатические узлы, регионарные пораженным органам, пораженный глаз, пораженная часть вымени, синовиальная жидкость из сустава.

Патологический материал берут стерильным инструментом в стерильную посуду.

Перед взятием проб молока вымя обмывают теплой водой, затем протирают тампоном, смоченным 70°-ным спиртом, сдаивают первые струйки, после чего 5—6 мл молока выдаивают в стерильную пробирку.

При взятии синовиальной жидкости в области пораженного сустава выстригают шерстный покров, кожу обрабатывают дезинфицирующим раствором, делают пункцию полости и отсасывают шприцем 2—5 мл жидкости.

1.5.    Материал пересылают в лабораторию с нарочным в термосе со льдом или в замороженном виде.

Для исследования пригоден только свежий патологический материал, замороженный материал хранят не более 10 сут.

1.6.    Лабораторное исследование на инфекционную агалактию включает микроскопию мазков из патологического материала, посев на питательные среды и постановку биопробы.

2.    Микроскопическое исследование.

2.1.    Из доставленного патологического материала готовят мазки-отпечатки, высушивают на воздухе и фиксируют этиловым спиртом 15—20 мин или метиловым спиртом 5 мин, после чего окрашивают но Граму и Романовскому — Гимзе (см. приложение).

2.2.    В мазках-отпечатках, окрашенных краской Романовского — Гимзы.в положительных случаях обнаруживают мелкие полиморфные образования кокковидной, нитевидной, кольцевидной форм, окрашенные в розовый цвет. При окраске по Граму возбудителя обнаружить не удается.

3.    Бактериологическое исследование.

3.1.    Для выделения культуры возбудителя инфекционной агалак-тии овец и коз используют жидкие питательные среды Мартена, Эдварда или триптический перевар сердца крупного рогатого скота, а при их отсутствии — МПБ с 2% лактозы (см. приложение).

3.2.    Из доставленных органов и тканей пастеровской пипеткой делают обильный посев в одну из указанных питательных сред с ингибиторами (ацетатом таллия и пенициллином — см. приложение).

При сильном загрязнении материала его можно профильтровать. Для этого кусочки органов тщательно растирают в ступке и разводят жидкой питательной средой с ингибиторами из расчета 80 мл питательной среды на 1—2 г патологического материала. Полученную суспензию фильтруют через мембранные фильтры № 2 или 3, в пробирки наливают по 5—6 мл фильтрата и ставят в термостат.

Для исключения контаминации патологического материала сопутствующей микрофлорой проводят посевы на МПЛ, в МПБ и среду Китта — Тароцци.

3.3.    Посевы инкубируют при 37—38°С в течение 5—7 ди., ежедневно просматривая.

3.4.    Если после 5—7 ди. культивирования рост микоплазм на питательных средах отсутствует, проводят пересев на жидкие и плотные питательные среды без ингибиторов (слепой пассаж) и инкубируют при указанных выше режимах.

Для предотвращения подсыхания чашек с агаром их помещают в эксикатор или полиэтиленовый мешок.

3.5.    При отсутствии роста проводят не менее 5 последовательных пассажей с интервалом 5—7 дн. Отсутствие роста в 5—7 пассажах указывает, что материал свободен от возбудителя инфекционной ага-лактии овец и коз.

3.6.    Рост возбудителя на жидких питательных средах характеризуется опалесценцией или незначительным помутнением без образования пленки или осадка.

На агаре возбудитель формирует мелкие росинчатые колонии. Под малым увеличением микроскопа у них обнаруживают светлую периферийную зону и темный, врастающий в агар центр. По внешнему виду колонии напоминают яичницу-глазунью.

3.7.    При обнаружении на агаре видимого роста изолированные

колонии с кусочком агара переносят в жидкую питательную среду для изучения их морфологических и культурально-биохимических свойств.

3.7.1.    Для приготовления мазков 72-часовую бульонную культуру центрифугируют при 10 тыс. об/мин в течение 30 мин, надосадочную жидкость удаляют, а из осадка делают мазки, которые окрашивают по Граму и Романовскому — Гимзе и микроскопируют.

В мазках из культур, окрашенных по Романовскому — Гимзе, возбудитель имеет вид полиморфных образований (округлых, овальных, дисковидных, реже — нитевидных) сине-фиолетового цвета.

3.7.2.    Ферментативную активность определяют на жидких и полужидких питательных средах с добавлением глюкозы, сахарозы (см. приложение). Результаты учитывают через 10 дн. инкубирования при 37—38°С по изменению окраски среды до оранжевого и желтого.

3.7.3.    Фосфатазную активность определяют на плотной питательной среде, к 100 мл которой добавляют I мл 1%-ного раствора натрия фенолфталеиидифосфата (pH среды 7,8—8,0). Среду разливают в чашки Петри, в три из которых проводят посев испытуемой культуры, три оставляют в качестве контроля. Все чашки помещают в термостат и инкубируют при 37—38°С. Через 3, 7 и 14 дн. по одной испытуемой и контрольной чашке вынимают из термостата и на поверхность среды наносят 5 н. раствор едкого натра (200 г NaOH на 1 л дистиллированной воды). Окрашивание плотной среды с посевом в красный цвет в течение 30 с указывает на фосфатазную активность культуры. Контрольная питательная среда приобретает красную окраску через более продолжительное время.

3.8. Культуры, не ферментирующие глюкозу и сахарозу, обладающие фосфатаз ной активностью, относят к возбудителю инфекционной агалактии овец и коз.

4. Биологическое исследование.

4.1.    Биопробу проводят на кроликах массой 2,5—3 кг, а при необходимости и на том виде животного (овцы или козы 1—2-месячного возраста), от которого выделена культура.

4.2.    Для заражения животных используют суспензию патологического материала, обработанную ингибиторами, или чистую культуру микоплазм.

Из патологического материала на физиологическом растворе готовят однородную суспензию 1 : 10, добавляют пенициллин из расчета 1000 ЕД/мл и 10%-ный раствор уксуснокислого таллия из расчета 1—2 капли на 10 мл суспензии, выдерживают при комнатной температуре 1 ч, после чего используют для заражения.

При заражении культурой используют 3—4-суточную свежевыделенную бульонную культуру микоплазм.

4.3.    Заражение кроликов проводят в переднюю камеру глаза, для чего из нее тонкой иглой отсасывают 0,05—0,1 мл жидкости и, не вынимая иглы, вводят 0,1—0,2 мл материала. Для контроля в другой глаз таким же образом вводят 0,1—0,2 мл стерильного бульона.

В положительных случаях через 5—12 дн. развивается кератит.

Наблюдение за подопытными кроликами ведут в течение 30 дн.

4.4.    При наличии кератита биопроба считается положительной, выделение культуры не обязательно.

При необходимости исходную культуру можно выделить в начальной стадии заболевания кролика. Для этого из передней камеры по-

раженного глаза стерильным шприцем набирают 0,2—0,5 мл жидкости и делают высев на жидкие питательные среды, как указано в п. 2.

4.5. Заражение овец и коз проводят в молочный канал или подкожно в дозе 5 мл или в сустав в дозе 2 мл.

В положительных случаях через 2—30 ди. после введения материала у зараженных животных развивается клиническая картина болезни, характерная для инфекционной агалактии.

Наблюдение за зараженными животными ведут в течение 30 дн.

Овец и коз с клиническими признаками болезни убивают, из органов делают высевы, как указано в п. 2.

5.    Лабораторный диагноз на инфекционную агалактию овец и коз считают установленным при получении одного из следующих показателен:

выделение из патологического материала культуры со свойствами, характерными для возбудителя данного заболевания;

положительная биопроба на кроликах, если даже в посевах из исходного материала культуры возбудителя не выделено;

положительная биопроба на овцах или козах с последующим выделением культуры со свойствами, характерными для данного возбудителя, если даже из исходного материала культуры возбудителя не выделено.

6.    Срок исследования без постановки биопробы — 30 дн., с биопробой и последующим выделением возбудителя — до 90 дн.

Приложение

1.    Окраска мазков.

1.1.    Фиксированные мазки окрашивают в течение 24 ч при комнатной температуре краской Романовского — Гимзы 1 : 10, после чего промывают и микроскопируют.

1.2.    Подогретую до 90°С Краску Романовского — Гимзы вводят под предметное стекло, положенное мазком вниз. Окрашивают в течение 20 мин, периодически добавляя горячую краску.

2.    Среды для культивирования микоплазм.

2.1. Среда Мартена. Свежие свиные желудки освобождают от жира и содержимого и пропускают через мясорубку. На 250 г фарша добавляют 1 л теплой (50°С) кипяченой водопроводной воды и 10 мл концентрированной соляной кислоты. Смерь выдерживают при температуре 45—50°С в течение 24 ч, периодически взбалтывая, затем прогревают текучим паром 30 мин и оставляют в холодном месте па 5 сут. Надосадочную жидкость сливают, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в колбы и стерилизуют при 120°С в течение 30 мин. Полученный пептон хранят до 3 мес.

Из мяса крупного рогатого скота, освобожденного от жира и сухожилий, готовят фарш. К 500 г фарша добавляют 1 л дистиллированной воды и смесь выдерживают при 4—8°С 24 ч. После этого фарш кипятят на слабом огне 2 ч, постоянно подливая воду до первоначального объема. Фарш отжимают и удаляют, мясную воду фильтруют через бумажный фильтр, разливают в колбы и стерилизуют при 120°С 30— 40 мин. Хранят при 4—8°С до 3 мес.

Для приготовления жидкой среды смешивают равные объемы пептона Мартена и мясной воды, устанавливают pH 8,0—8,2, разливают в колбы и стерилизуют при 120°С 30 мин. Бульон хранят не более одного месяца.

2.2.    Среда Эдварда. Сначала готовят отвар мышцы сердца крупного рогатого скота. Для этого 1 кг мышцы сердца освобождают от жира и сосудов, пропускают через мясорубку и заливают 1 л дистиллированной воды. Смесь выдерживают в течение 16 ч при комнатной температуре, периодически помешивая, затем кипятят 40 мин, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в колбы и автоклавируют при 120°С 30 мин. Отвар хранят при комнатной температуре не более месяца.

Для приготовления жидкой среды Эдварда к 500 мл отвара мышцы сердца добавляют 500 мл дистиллированной воды и 10 г пептона. Устанавливают pH 8,4 и стерилизуют автоклавированием при* 120°С 30 мни; pH среды после стерилизации — 8,0. Среду используют в течение одного месяца.

2.3.    Среда из гидролизата мышцы сердца крупного рогатого скота. Сердце крупного рогатого скота очищают от жира и сосудов, нарезают кусками. К одной весовой части измельченной мышцы сердца добавляют 1,5 части дистиллированной воды и кипятят 10—15 мин. Остывшие полувареные куски сердечной мышцы пропускают через мясорубку, после чего к 600 г фарша добавляют 1 л бульона, pH которого доведен 20%-ным раствором едкого натра до 8,0. К смеси добавляют 150 г свежей измельченной поджелудочной железы крупного рогатого скота и 30 мл хлороформа. Бутыль плотно закрывают и оставляют в темном месте при 45—48°С на 10 дн., периодически перемешивая. Через 10 дн. триптический перевар мцшцы сердца охлаждают, фильтруют через полотняные фильтры и доводят pH до 8,0. Содержание аминного азота в переваре должно быть не менее 650—700 мг%. К приготовленному перевару добавляют хлороформ из расчета 20 мл на 1 л среды и хранят при 4Х.

2.6.1. Приготовление дрожжевого экстракта. 50 г пекарских дрожжей растворяют в 200 мл дистиллированной воды, кипятят до прекращения вспенивания, дают отстояться и фильтруют через бумажный фильтр. Дрожжевой экстракт хранят при 4°С в течение месяца.

2.7. Для определения ферментативной активности используют жидкие и полужидкие питательные среды, к которым, кроме сыворотки крови и дрожжевого экстракта, добавляют 0,002% фенолрота и 0,5—1% соответствующего углевода (глюкозы или сахарозы), pH среды 7,8—8,0.