ЛАБСШОРНЬЕ

ИССЛЕДОВАНИЯ В ВЕТШ/1НАРИИ

БАКТЕИ^АЛЬНЫЕ

ИНТЕКЦИИ

СПРАВОЧНИК

ЛАБОРАТОРНЫЕ

ИССЛЕДОВАНИЯ

В ВЕТЕРИНАРИИ

•

БАКТЕРИАЛЬНЫЕ

ИНФЕКЦИИ

Под редакцией Б. И. АНТОНОВА

МОСКВА АГРОПРОМИЗДАТ 1986

бы выдерживают в течение такого же срока при 20—22°С и ведут за ними повседневное наблюдение.

4.3 Для контроля мелких и крупномасштабных серий питательных сред, сыворотки и растворов, стерилизуемых фильтрованием и фасуемых в посуду различной емкости, из 2—3 бутылей или флаконов в начале, середине и конце каждой серии в асептических условиях отбирают по 50 мл. Взятые пробы исследуют методом прямого посева в пробирки и чашки Петри с соответствующими бактериологическими средами.

4.4.    Кроме того, с целью выявления контаминации, связанной о погрешностями в подготовке посуды и пробок, а также с аэрогенным инфицированием в процессе разлива, всю серию среды или раствора непосредственно после фильтрации выдерживают в течение 7 дн. при 37°С, а затем — еще неделю при комнатной температуре (20—22°С). На протяжении всего этого периода среды и растворы должны оставаться прозрачными и не иметь осадка. Жидкости, содержащие индикатор фенол рот, не должны менять исходную окраску и иметь красно-оранжевый цвет.

4.5.    При отрицательных результатах бактериологических высевов во всех пробах и отсутствии визуальных признаков обсемененности контролируемую серию среды, сыворотки или раствора считают стерильной и передают для использования или до употребления выдерживают в холодильнике (холодной комнате) при 4°Св пределах установленных сроков хранения. Большую партию стерильной сыворотки можно хранить в замороженном состоянии при температуре минус 10—15°С.

4.6.    Проверяемую серию выбраковывают, если отмечают рост микроорганизмов на бактериологических средах, опалесценцию или помутнение сред, сыворотки и растворов, наличие плесени или изменение pH в кислую сторону более чем на 30% единиц посуды.

4.7.    При наличии макроскопических изменений в отдельных бутылях и флаконах (менее 30% от всей партии) их выбраковывают, а остальную часть серии среды, сыворотки или раствора признают условно стерильной и помещают на временное хранение при 4°С. Допускаюг ее к использованию только после получения отрицательных результатов дополнительного бактериологического исследования с высевом проб на бакереды из расчета 10% от партии.

4.8.    При росте микроорганизмов на бактериологических средах, но в отсутствие визуальных признаков контаминации также проводят дополнительное бактериологическое исследование удвоенного числа проб. При повторном обнаружении обсемененности всю серию признают нестерильной. Если же в этом случае микроорганизмы не будут выделены, то контролируемую серию следует считать пригодной для использования.

4.9.    Контроль на стерильность расфасованных сред и растворов, стерилизуемых автоклавированием, осуществляют так же, как изложено в п. 4.3, с той лишь разницей, что пробы для бактериальных высевов берут не в порядке очередности изготовления, а выборочно (в пределах 3—5% от серии).

4.10.    Стерильность сыворотки крови животных, ростстимулирую-щих добавок (дрожжевой и эмбриональные экстракты, АМЖ) или иных термолабильных компонентов ростовых сред проверяют без их передержки в разных температурных условиях (при 37°С и комнатной температуре) методом прямого посева проб на бактериологические среды.

4.11.    Культуральные среды, изготавливаемые в реакторах большой емкости (100, 250, 630 л и более) и стерилизуемые фильтрованием или термическим способом, контролируют на стерильность методом осаждения возможных контаминантов на мембранные филыры («Владипор»,

«Миллипор», «Гельмам») с размером пор 0,20—0,22 мкм. Для этого в асептических условиях из реактора берут пробы среды по 0,5 л и пропускают их через стерильные фильтры, чем достигается концентрирование микроорганизмов на поверхности. По окончании этой процедуры фильтрующую мембрану (или ее часть) захватывают стерильным пинцетом и накладывают на кровяной агар в чашке Петри, а также помещают в МПБ с 0,5% глюкозы или в тиогликолевую среду. Далее исследования проводят по. обычной методике.

4.12.    Среды и растворы, содержащие антибиотики или ингибиторы роста бактерий, проверяют па стерильность, как и в п. 4.11 — методом мембранного фильтрования. Однако при этом фильтры помещают в бактериологические среды только после промывки 5-кратным объемом стерильного физраствора, пропускаемого через них вслед за фильтрованием пробы среды.

4.13.    Ростовые среды компонуют из заранее проверенных и заведомо стерильных материалов (нативная культуральная питательная среда, сыворотка, различные добавки). Тем не менее после объединения всех компонентов проводят дополнительный бактериологический контроль готовой среды путем высева взятых из нее проб на бактериологические среды. Кроме того, в процессе испытания питательной ценности и токсичности каждой новой серии ростовой среды, проводимого в течение 5—6 последовательных пассажей на эталонной клеточной культуре (постоянно используемые в лаборатории перевиваемые штаммы и линии клеток с известными свойствами), в ряде случаев удается выявить обсс-мененность среды бактериями, плохо или совсем не размножающимися на обычных бактериологических средах. Наличие таких контаминактов устанавливают по изменениям в культуре клеток (незначительная опалесценция среды, замедленный рост клеток, стертость межклеточных границ и т. д.) и подтверждают с помощью фазоконтрастной микроскопии или других специальных методов исследований.

4.14.    Сыворотка животных является обязательным компонентом всех ростовых сред. Наиболее часто используют сыворотку крови крупного рогатого скота (лучше — телят п эмбриона коровы). Каждую серию сыворотки наряду с установлением ростстнмулирующей активности и наличия вируснейтрализующих антител необходимо контролировать на бактериальную, микоплазменную и вирусную контаминацию.

При бактериологическом контроле сыворотку (1 мл) высевают на жидкие среды (10 мл), использование более высоких доз инокулята (25 мл) и среды (100 мл) значительно повышает чувствительность метода. Кроме того, используют полужидкую тиогликолевую среду. Допускается использование для контроля на стерильность обычных питательных сред, в частности МПБ, МГ1А —для бактерий аэробов; среды Мартена, Китта—Тароцци-—для бактерий анаэробов; среды Сабуро, Чапека — для микроскопических грибов. Универсальную полужидкую тиогликолевую среду разливают по 20 мл в 4 пробирки, в каждую из которых засевают 1 мл исследуемого материала (в толщу среды). Две пробирки, предназначенные для обнаружения бактерий (аэробы или анаэробы), ставят в термостат с температурой 37°С, две пробирки (для выявления микроскопических грибов) оставляют при 20—25°С. Для лучшего обнаружения аэробных бактерий и микроскопических грибов в общую схему контроля стерильности рекомендуется дополнительно вводить 1%-ные растворы гидролизатов лактальбумина или илацентар-но-эмбрнональио-маточные (производится Казанским ветеринарным институтом) с 1%-ной глюкозой. Каждую пробу сыворотки высевают в

4 колбы (склянки) со средой. Из них половину инкубируют при температуре 20—22°С, вторую половину ставят в термостат при 37°С.

Микоплазменную контаминацию устанавливают на бульоне Эдварда—Хейфлика или на его модифицированных вариантах. Для этого вы* севают 25 мл сыворотки на 100 мл бульона. Следует иметь в виду, что микоплазмы лучше растут в атмосфере 95%С0₂.

Для контроля сыворотки на культуре клеток с целью исключения вирусной контаминации составляют контрольную систему, которая включает культуру клеток (перевиваемые штаммы и линии клеток), питательную среду с исследуемой сывороткой, растворы версена или трипсина (для снятия и диспергирования клеток). В этой системе неизвестным элементом является только сыворотка. Другие компоненты должны быть заведомо проверенными и соответствовать предъявляемым требованиям. Клетки, используемые в контрольной системе, должны иметь характеристику (морфология, кариология, пролиферативная активность), полученную при культивировании в присутствии заведомо хорошей сыворотки; они также должны обладать широким диапазоном чувствительности к наиболее вероятным вирусам-контаминантам (для сыворотки крупного рогатого скота ими являются вирусы парагрип-па-З, ринотрахеита и диареи). Исследование неизвестной сыворотки следует проводить в течение 5 последовательных пересевов клеток с использованием одних и тех же компонентов контрольной системы. Клетки 5*го пересева в нативном, окрашенном препаратах и в метафазной пластинке исследуют для выявления общих морфологических изменений в культуре, посторонних включений в цитоплазме, нарушений структуры хромосом. Исследование сыворотки на распространенные миксопара-миксовирусы проводят по реакции гемагглютинации и гемадсорбции на гемагглюти пирующие агенты.

Вопрос о необходимости прогревания сыворотки (при 56°С в течение 30 мин) решается индивидуально с учетом результатов контрольных исследований и требований к данной культуре клеток; прогревание ухудшает ростовые свойства сыворотки.

5. Контроль стерильности клеточных культур.

5.1.    Стерильность клеточных культур на всех этапах их приготовления и хранения обеспечивается не только тщательным выполнением изложенных выше мероприятий, но и бактериологическими исследованиями донорских тканей, матричных и производственных линий клеток, а также клеточных расплодок, что позволяет своевременно отбраковывать коптами ни рован н ые материалы.

5.2.    Контроль на стерильность клеточных культур осуществляют: при изготовлении первичных культур клеток (образцы исходных

тканей, готовая суспензия свежеизолированных клеток);

при поддержании перевиваемых линий клеток матричных культур через 5—10 пассажей, но не реже одного раза в месяц, а производственных культур — во время рассадки каждой партии;

при крупномасштабном суспензионном культивировании клегок — в каждом пассаже;

при закладке на хранение в условиях жидкого азота и восстановления клеточных расплодок после низкотемпературной консервации;

при поступлении культур клеток из других учреждений и лабораторий;

во всех случаях возникновения признаков контаминации (опалесценция или помутнение культуральной среды, ее резкое закисление, изменение ростовых характеристик и морфологии клеток, неспецифи-

ческая дегенерация клеточного монослоя или массовая гибель клеток в суспензионных культурах и т. д.).

5.3.    Стерильность клеточных культур проверяют посредством высевов на бактериологические среды проб растворов (по 0,5 мл), использованных для промывки и диспергирования тканей, а также клеточной суспензии и культуральной жидкости. Для бактериологического контроля суспензионных культур, выращиваемых с применением антибиотиков, отобранную пробу в количестве 25—100 мл с целью освобождения от клеток предварительно центрифугируют при 1000 об/мин 10 мин, а надосадочную жидкость затем исследуют методом мембранного фильтрования, как это указано в пп. 4.11 и 4.12 настоящих рекомендаций.

5.4.    Материал на контаминирование вирусами исследуют в вирусологических лабораториях, используя приводимые ниже-методы:

общее обследование культуры на наличие характерных цитопати-ческих изменений (ЦПД, симпласты, трансформация и т. п.);

методы, основанные на прямом или косвенном связывании антиге-на-контаминанта со специфическими антителами иммунной сыворотки (реакции нейтрализации, связывания комплемента, преципитации, иммунофлуоресценции, иммунопероксидазный, радиоиммунный). Для установления контаминанта по реакции нейтрализации и РСК требуется значительное количество антигена. При использовании других приведенных методов расходуется меньше антигена, чувствительность их выше. Эти методы универсальны, практически пригодны для выявления различных видов вирусов. К их недостаткам следует отнести необходимость постоянного наличия большого набора гипериммуиной сыворотки к различным штаммам и видам контаминангов;

заражение исследуемым материалом лабораторных животных, появление характерной клиники, образование специфических антител и изучение и< одной из реакций, указанных в предыдущем пункте. Метод универсален, может быть использован для установления многих видов контаминантов. К его основным недостаткам следует отнести трудоемкость. Более того, контаминанты, персистирующие длительное время в культуре, изменяются и могут не вызывать заболевание животного. Если заболевание и наступает, клиническое течение инфекции может быть нехарактерным;

исследование окрашенных препаратов под световым и люминесцентным микроскопами на тельца-включения (аденовирусы, вирусы ринот.рахеита, бешенства). По техническому выполнению метод прост, доступен и легко осуществим в условиях обычных лабораторий;

электронная микроскопия. Данный вид универсален, позволяет обнаружить практически все виды вирусной контаминации, за исключением тех вирусов, которые йнкорпированы в нуклеопротеидные нити хромосом. Процесс определения контаминанта несложен, требует мало времени. Недостатком электронно-микроскопического метода исследования является трудность обнаружения вируса при слабой инфициро-ванности;

гемадсорбция и гемагглютинация позволяют выявлять вирусы, несущие на своей поверхности рецепторы-агглютинины, взаимодействующие с комплементарными рецепторами поверхности эритроцитов, в результате чего они склеиваются. При гемадсорбции эритроциты обнаруживаются прикрепленными к поверхности инфицированных клеток. Реакцию гемагглютинации ставят отдельно с культуральной жидкостью или вместе с разрушенными клетками. При исследовании контаминиро-ваиной культуры эритроциты, связываясь с вирусами, агглютинируются и оседают на дне лунки панели в виде круга с изъеденными краями. Вна-

чале эти реакции использовались для обнаружения миксовирусов. Впоследствии было показано, что при подборе условий и эритроцитов соответствующих видов животных при помощи реакций гемагглютина-ции и гемадсорбции можно обнаруживать и другие вирусы, а также микоплазмы;

феномены экзальтации (усиление активности одного вируса при взаимодействии с другим), интерференции (подавление активности одного вируса при взаимодействии с другим вирусом), ннтерферонообразования (подавление активности одного вируса благодаря стимулированию интер-фероиообразования другим вирусом), предусматривающие широкое применение разных вирусов, больше используют при разработке научных вопросов и малопригодны для практики вирусологического контроля;

определение обратнотранскрнптазной активности и реакцию гибридизации между нуклеиновыми кислотами клетки и вируса используют для выявления контаминирования клеток онкогениыми вирусами, локализованными в геноме клетки. Оба метода сложны и могут быть выполнены в специализированных лабораториях. Приобретение клетками трансформированного фенотипа в результате взаимодействия их с онкогениыми вирусами устанавливают на основании способности трансформированных клеток размножаться в полужидкой агаровой среде (в этих условиях нормальные клетки не растут) и агглютинироваться в присутствии лектинов;

метод равновесного центрифугирования в градиенте сахарозы концентрированной культуральной жидкости, инкубированной в присутствии радиоактивных предшественников синтеза нуклеиновых кислот.

При выборе метода исследования учитывают вид предполагаемого вируса-коитамиианта, срочность получения ответа и реальные возможности использования того или иного метода.

6. Методы выявления микоплазм в клеточных культурах.

6.1.    Для выявления микоплазм используют следующие методы: посев на питательные среды, цитологические, радиоавтографические, электронно-микроскопические.

6.1.1.    Метод выделения микоплазм на средах Эдварда — Хейфлика, 2%-ном ФГМС (ферментативный мышечный гидролизат) и модифицированной среде ВИЗ В (на основе среды Мартена), включающих в себя специфическую основу, дрожжевой экстракт (10%-ный) и сыворотку лошади или крупного рогатого скота (10%-ный).

Для выделения контамикантов жидкие и полужидкие среды разливают в пробирки по 5—10 мл, твердые — в чашки Петри по 15 мл. Материалом для исследования (посевным материалом) служит суспензия подозреваемых па контаминацию клеток, питательные среды культур клеток, взятые из культуральных флаконов на 2—4-е сут культивирования.

Материал для исследования отбирают стерильно. В одну пробирку с 10 мл питательной среды вносят 1 мл исследуемого материала. Посев в полужидкие агары производят пипетками (Пастер?, или одномиллилитровыми) по уколу так, чтобы посевной материал равномерно распределялся по всему столбику среды.

При посеве на твердые среды посевной материал равномерно распределяют шпателем на поверхности агара. Использование больших объемов инокулята (25 мл) и жидкой среды (100 мл) в значительной степени повышает чувствительность метода обнаружения микоплазм з исследуемом материале.

Инокулированные среды помещают в термостат при 37°С и лросмат-

ривают ежедневно в течение 10—15 дн. Видимый рост появляется обычно на 2—4-есут. На жидких средах он проявляется в виде легкой опалесценции, слабого осадка и нежной поверхностной пленки. На полужидких средах рост микоплазм характеризуется скоплением серовато-белых микроколоний по пути инокулирования посевного материала. На твердых питательных средах микоплазмы образуют характерные, вросшие в агар, округлые колонии с вдавленным центром и возвышенной периферией.

6.1.2. Цитологические методы исследования. Для контроля в световом микроскопе на контаминирование культур микоплазмами суспензию клеток высевают в пробирки или пенициллиновые флаконы с покровными стеклами. Концентрация клеток в суспензии должна быть 1,5—2X10⁵ в 1 мл; объем суспензий 1,5—2 мл. Через определенные промежутки времени (1, 2, 3 и т. д. суток культивирования) покровные стекла вынимают, промывают в подогретом до 37°С растворе Хенкса или физрастворе (pH 7,0—7,2), подсушивают фильтровальной бумагой и фиксируют в одной из фиксирующих смесей: жидкости Кармуа (9б°-ного спи рта-ректификата 6 ч., хлороформа 3 ч., ледяной уксусной кислоты 1 ч.), метиловом спирте или других фиксаторах с последующей окраской цитологических препаратов. Наиболее часто используют для окраски препаратов один из простых и доступных методов — по Романовскому—Гимзе. Выдержанные в краске в течение 2 ч препараты споласкивают водопроводной водой, высушивают при комнатной температуре и заделывают в канадский бальзам для исследования. Применяют и другие методы окрашивания, например гематоксилинэозином. По этому методу сначала гематоксилином окрашивают ядро. Для этого хранившиеся в 70°-ном спирте фиксированные препараты споласкивают в дистиллированной воде и помещают в краску на 2—3 мин, после чего споласкивают водопроводной водой и просматривают под микроскопом. Контуры ядра и ядрышек должны быть четкими, хорошо окрашенными. В случае необходимости окрашивание препарата продолжают, чередуя 2—3-минутное выдерживание в краске, споЛаскивание водопроводной водой и исследование под микроскопом. Затем в течение 30—60 с докрашивают цитоплазму. В готовом препарате на розовом фоне цитоплазмы обнаруживают фиолетовые ядра. После этого стеклышки с клетками подсушивают путем осторожного накладывания фильтровальной бумаги, проводят через спирты с возрастающей концентрацией: 70, 80, 96°-ный (1-й спирт), 96°-ный (2-й спирт), 100°-ный+ксилол (1 : 1), ксилол (1-й ксилол), ксилол (2-й ксилол) и в заключение препарат заделывают в бальзам на предметном стекле.

На цитологических препаратах, окрашенных по Романовскому — Гимзе или гематоксилинэозином, при наличии микоплазменной инфекции видно, что монослой разрыхленный, плотного прилегания клеток нет. На отдельных участках наблюдаются пространства без клеток («окна»). В цитоплазме и в межклеточном пространстве обнаруживаются мико-нлазмы в виде мелких фиолетовых зерен.

Для исследования на микоплазмы в люминесцентном микроскопе клетки окрашивают по методу Фельгена. Последовательность обработки препарата следующая:

фиксировать клетки в жидкости Карнуа в течение 15 мин; отмыть от фиксатора в 96°-ном спирте;

провести по спиртам убывающей концентрации до воды (96, 70, 50°-ный, дистиллированная вода);

поместить в 1 н. раствор НС1 на 10 мин при 60°С с целью гидролиза ДНК; сполоснуть в 2 сменах дистиллированной воды по 3—5 мин;

окрасить реактивом Шиффа в течение 20 мин; отмыть в дистиллированной воде и провести через спирты 50 и 70°-ный; дважды промыть в солевом этаноле по 5 мин; на предметное стекло нанести каплю дистиллированной воды и опустить на нее покровное стекло клетками вниз. Препарат исследуют в люминесцентном микроскопе: в цитоплазме контаминированныя клеток, а также вне на желтом фоне обнаруживаются оранжевокрасные зерна микоплазм.

Приготовление реактива Шиффа для люминесцентной микроскопии! в 200 мл дистиллированной воды растворить 250 г акридинового оранжевого, 500 мг метабисульфита калия и добавить 20 мл 1 н. раствора НС1. Колбу с краской герметически закрыть и оставить в холодильнике при 4°С на 3 сут. Содержимое колбы периодически встряхивать.

Раствор Шиффа непосредственно перед использованием профильтровать через стеклянный фильтр № 4 под давлением. Первую порцию фильтрата выбросить. Реактив Шиффа повторно не используют.

6.1.3.    Выявление микоплазм методом радиоавтографии. Принцип выявления мнкоплазменной инфекции в исследуемой культуре заключается в способности микоплазм при кратковременном инкубировании культур клеток в питательной среде, содержащей Н³-тимидин, включать его как предшественник пол и нуклеотидной структуры дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Таким образом, в радиографах наряду с меткой, находящейся над ядрами клеток, обнаруживается радиоактивная метка и над местами расположения микоплазм.

Препараты просматривают в световом микроскопе (об. 90, ок. 10— 15) по всей площади. Мечеными считаются клетки, над ядрами которых обнаруживают не менее 5 зерен восстановленного серебра. При наличии в данной культуре клеток микоплазм зерна восстановленного серебра располагаются не только над ядром клеток, но и в цитоплазме и в межклеточном пространстве.

Для контроля уровня радиоактивного фона необходимо параллельно с изучаемой культурой брать в опыт еще 1—2 культуры клеток, одна из которых должна быть заведомо свободна от микоплазм. Лучше всего для этой цели подходят первично-трипсинизированные культуры клеток.

6.1.4.    Электронно-микроскопическая диагностика микоплазм в культуре клеток. На срезах при просмотре в электронном микроскопе обращают внимание на наличие микоплазм в межклеточных пространствах, около цитоплазматической мембраны или непосредственно в контакте с мембраной, в цитоплазме клеток. Мйкоплазмы имёютокруглую, овальную или вытянутую форму, иногда в виде ракетки, размер их 0,1—1,0 мкм. Оболочка микоплазм не имеет клеточной стенки и представляет собой элементарную цитоплазматическую мембрану. Внутренняя структура представлена тяжами, микрофибриллами, рибосомоподобными структурами. Внутри клетки мийоплазмы расположены, как правило, в ва-к у ол я х-фа госом а х.

7. Использование противомикробных препаратов для профилактики контаминации и деконтаминации клеточных культур.

7.1. Предупредить размножение и подавить случайно попавшие в клеточную структуру бактерии удается с помощью противомикробных препаратов (антибиотиков и других средств), добавляемых в ростовые среды непосредственно перед их использованием. Однако ввиду токсичности этих препаратов и их способности при длительном воздействии на перевиваемые культуры вызывать определенные изменения свойств клеточных популяций (утрату исходных характеристик, возникновение новых трофовариантов) их следует строго дозировать и применять диф-

ференцированно. Их использование является необходимым условием при возрастании риска контаминации в процессе получения первичных клеточных культур, при крупномасштабном суспензионном выращивании линий клеток, при массовом производственном культивировании перевиваемых пристеночных популяций, а также во всех случаях объединения клеточного материала. В отличие от этого матричные пристеночные культуры перевиваемых клеток выращивают без применения антибиотиков, поэтому для большей гарантии их сохранности всю партию матрасов делят на две равных части, пересевы которых проводят в чередующейся последовательности. При возникновении контаминации эти культуры уничтожают, не подвергая «лечению», а культивирование возобновляют из резервных расплодок, хранящихся в жидком азоте. Только редкие и уникальные культуры подлежат дсконтаминации.

7.2.    При работе с культурами клеток используют многие антимикробные препараты. Оптимальные (нетоксичные) дозы и характер действия их приведены в таблице 3.

7.3.    Выбор эффективного препарата для комплекса препаратов зависит от чувствительности к ним конкретных контаминантов. В связи с этим предварительно определяют чувствительность микрофлоры ткани, используемой при получении первичных клеточных культур, а также выделяемой в процессе бактериологического контроля воздуха, питательных сред и культур клеток к возможно более широкому кругу препаратов, рекомендованных в предыдущем пункте и имеющихся в распоряжении лаборатории. При изоляции однотипной или высокочувствительной к какому-либо из антибиотиков микрофлоры часто бывают достаточным применение монопрепарата, тогда как в случае выделения смешанных культур или резистентных форм микроорганизмов необходимо использовать комплекс препаратов.

Чувствительность микрофлоры к тем или иным ярепаратам определяют с помощью стандартных дисков антибиотиков (согласно прилагаемой к ним инструкции) или методом серийных разведений веществ, как это рекомендуется руководствами по микробиологии.

В первом случае на чашку Петри с кровяным агаром вносят 0,5 мл суточной бульонной культуры-контаминанта, равномерно распределяют инокулят по всей поверхности агара и через 40 мин накладывают диагностические диски соответствующих антибиотиков на расстоянии 28— 30 мм друг от друга и от края чашки. Результаты учитывают через 24 ч; при этом предпочтение отдают препаратам, обеспечивающим зону задержки роста микроорганизмов с диаметром не менее 20—35 мм.

Во втором случае на МПБ готовят серийные разведения исследуемого препарата, содержащие убывающие его концентрации, после чего в пробирки вносят контаминант с плотностью 10⁵—10^е микробных тел в 1 мл. Для последующей работы считают пригодными препараты, даю щие бактерицидный эффект в дозах, не превышающих оптимальные для культур клеток.

7.4.    Выраженным иротивомикробным действием по отношению к наиболее часто встречающимся контамипантам клеточных культур обладает комплекс следующего состава: пенициллин — 100 ЕД/мл, гентамицин (или мономицин) — 100 мкг/мл, полимиксин — 50 ЕД/мл, фура-гин — 5 мкг/мл. Для подавления плесневой флоры, в случае такой необходимости, в этот комплекс рекомендуется добавлять натриевую соль нистатина в концентрации 50 ЕД/мл.

При пристеночном культивировании комплекс антимикробных препаратов применяют однократно во время посева клеток, а при круп-

3. Противомикробные препараты для культур клеток

Чу ветви- Оптимальная Тип антимикробного концентра- Наименование тел ьиые микро- ция для культур клеток, организ- действия ЕД/мл или мы мкг/мл

Пенициллин Б+ Бактерицид 100,0 Стрептомицин Б± ное 100,0 Мономнцнн Б£, м То же 100,0 Неомицин Б±, м » 50,0 Канамиции Б±, м » 200,0 Гентамицин Б±, м » 200,0 Полимиксин Б* » 50,0 Фурагин Б±- » 8,0 Тетрациклин Б±, м Бактериоста 30,0 Эритромицин Б± тическое 50,0 Линкомицин Б±, м То же 100,0 Левоминетин (хлорамфеникол) Б±, м » 30,0 Тилозин М 10,0 Олеандомицин М » 15,0 Препарат № 1 м » 10,0 Препарат № 2 м » 10,0 Нистатин м г Фуигнстати- 50,0 Амфотерицнн м г ческое 2,5

О б о 1 и а ч е и и я. (Б+) — грамположительпые бактерии; (Б±) — грамот-ридательные бактерии; М — микоплазмы; препарат № !—моноэфнр сахарозы и жирных кислот; препарат № 2 — полисахарид; МГ — микроскопические грибы.

номасштабном суспензионном культивировании, когда происходит быстрая инактивация антибиотиков, его вносят повторно еще раз через 48—72 ч.

7.5. При инфицировании редких и уникальных перевиваемых культур клеток микоплазмами, бактериями и дрожжами их деконтаминацию проводят с применением указанного в п. 7.4 комплекса антимикробных препаратов по следующей схеме:

перед пересевом следует обезвредить микроорганизмы и улучшить состояние больной культуры — слабые клетки не выдерживают пересева, погибают. Для этого в зависимости от формы проявления контами-нирования культуральную жидкость с интервалом 1—3 дня несколько раз сменяют с целью доведения ее до прозрачного состояния и устранения зернистости цитоплазмы. Лучшие результаты получают при применении для контаминации среды 199 с 10—15% свежеприготовленной сыворотки и антибиотиками, обладающими бактерицидностью и широким спектром действия на бактерии, микоплазмы (неомицин, канамиции, гентамицин, мономицин и их комбинации с другими антимикробными препаратами). Антибиотики следует применять в больших, но не токсичных дозах;

проводят 5 пассажей культуры на ростовой среде, содержащей рабочие концентрации комплекса;

параллельно определяют чувствительность выделенного из клеточной культуры контаминанта к противомипробным препаратам, имею-

щимся в лаборатории (см. п. 7.3), и уже на втором пассаже вносят соответствующую корректировку в используемый комплекс;

через 5 пассажей культуру проверяют на стерильность методом мембранного фильтрования (см. пп. 4.11, 4.12^ 5.3 настоящих рекомендаций), и если из нее вновь выделяют контаминирующий агент (агенты), то клеточную популяцию подвергают повторной обработке по полному циклу;

далее клетки культивируют на среде без антибактериальных препаратов.

7.6. Культуру клеток после 4—5 последовательных пересевов исследуют и считают ее декоитаминированиой на основании следующих показателей:

при посеве культуральной жидкости и разрушенных клеток на элективные среды микроорганизмы не выделяются;

при исследовании моиослойиой культуры в нативном виде в световом микроскопе цитоплазма гомогенная, прозрачная, без следов зернистости, с признаком тургора, благодаря чему контуры клеток четкие, с хорошо выраженной рельефностью поверхности монослоя; по общей морфологии, кариологии, пролиферативной активности и чувствительности к вирусам деконтаминированные клетки не должны отличаться от исходной здоровой родительской популяции;

при окрашивании клеток, культивированных в течение 96 ч и более по Романовскому—Гимзе, в цитоплазме не должны быть посторонние включения; продолжительность окрашивания — не менее 2 ч.

8. Требования, предъявляемые к сотрудникам.

Сотрудники могут быть причиной инфицирования культур клеток, например, при заболевании острыми и хроническими инфекциями, отсутствии навыков работы, небрежности и невнимательности, несоблюдении правил личной гигиены и санитарного режима лаборатории. С целью исключения возможности инфицирования культур клеток сотрудниками последние обязаны неукоснительно выполнять предусмотренные правила работы.

8.1.    Непосредственно перед заходом в бокс они должны тщательно мыть руки с мылом и щеткой в течение 5—10 мин с последующей обработкой теплым раствором 0,5%-ного нашатырного спирта. В боксе руки протирают ваткой или кусочками марли, смоченными 96°-ным спиртом-ректификатом, обращая особое внимание на подногтевые пространства. По мере необходимости у них проверяют руки на бактериальную обсе-мененность.

8.2.    Сотрудники при подозрении в заболевании острыми и хроническими инфекциями, с гнойными ранами к работе приступают только после получения соответствующего медицинского заключения.

8.3.    Каждый сотрудник должен в совершенстве владеть техникой работы с культурами клеток и пунктуально соблюдать правила асептики. Во время пересева культуры клеток, приготовлении и разливе сред, растворов не разрешается производить насасывание и выдувание при помощи рта; следует пользоваться автоматическими дозаторами, резиновыми грушами.

8.4.    Боксы следует заблаговременно обеспечивать всем необходимым для работы; все предметы, связанные с пересевом культуры, располагают под рукой; максимально ограничивают хождение, категорически запрещается выход из бокса в процессе работы. Во время работы движения рукой должны быть умеренными, чтобы не сбивать пламя го-

репки; разговор, особенно при открывании сосуда с клетками и средами, ограничивают.

8.5.    Сосуды с культурами клеток, средами, сыворотками и другими растворами, контаминированные. микроорганизмами, не вскрывают; они подлежат предварительному автоклавированию, после чего их направляют на мойку.

8.6.    Сотрудники в течение всего рабочего времени должны соблюдать санитарный режим лаборатории.

ПРЕДИСЛОВИЕ

В деле выполнения решении партии и правительства по дальнейшему развитию животноводства, а также задач, поставленных Продовольственной программой страны, ветеринарной службе большую помощь оказывают ветеринарные лаборатории.

Ветеринарные лаборатории осуществляют диагностику инфекционных и паразитарных болезней животных, выявляют нарушения обмена веществ в их организме, проводят исследования, направленные на предупреждение отравлений, помогая тем самым специалистам совхозов, колхозов и других хозяйств успешно осуществлять лечебнопрофилактические мероприятия. От того, насколько своевременно ставится диагноз, разработаны и рекомендованы профилактические и лечебные меры, зависит успех ликвидации болезней, сохранность поголовья животных и повышение их продуктивности.

Последнее время в лабораториях появилось много приборов и приспособлений, облегчающих труд специалистов и позволяющих проводить исследования на более современном и качественном уровне, с большой достоверностью. В связи с этим многие ранее действовавшие методические указания переработаны.

Кроме того, ежегодно для лабораторной практики предлагаются новые методы диагностики. В отечественной и зарубежной литературе постоянно публикуется большое количество материалов о новых методах исследований, предлагаются различные модификации существующих методик, вводятся дополнительные диагностические тесты.

Ветеринарные лаборатории в своей работе не могут использовать всего многообразия имеющихся в литературе методов исследования или из-за того, что они недостаточно апробированы, или из-за сложности применяемого оборудования. Иногда методы, предлагаемые различными авторами, при определении одних и тех же показателей дают несовпадающие результаты.

В связи с этим в справочник включены методы лабораторных исследований патологического материала, получаемого от больных, убитых или павших сельскохозяйственных животных, апробированные Центральной ветеринарной лабораторией и утвержденные Главным управлением ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР. Книга содержит методические указания по диагностике инфекционных болезней бактериальной этиологии, а также методические указания по применению культур клеток в диагностических исследованиях.

Методики изложены по единой схеме,- взятие и пересылка патологического материала, методы его обработки и обогащения; бактериоско-пические исследования, включая световую и люминесцентную микроскопию; выделение культур возбудителей инфекционных болезней на питательных средах; заражение лабораторных животных как с целью выделения чистой культуры возбудителя, так и определения степени ее патогенности; гистологические исследования; идентификация и дифференциация возбудителей с использованием различных методов; серологические исследования для определения вида возбудителя.

Приведенные в справочнике методы лабораторных исследований унифицированы и стандартизированы. В широком смысле слова унификация и стандартизация подразумевают применение для различных исследований одних и тех же аппаратов, приборов, инструментов, посуды, реактивов, исключая, конечно, специальные методы исследования; применение стандартных (унифицированных) питательных сред и диагностикумов; разработку методических указаний по единой форме. Все это позволяет лабораторным работникам с меньшей затратой сил и средств, на высоком методическом и техническом уровне, качественно и в срок проводить диагностические исследования. Таким образом, стандартизация методов исследования явится способом наведения строгого порядка в работе ветеринарных лабораторий.

Книга предназначена для ветеринарных врачей, фельдшеров, а также лаборантов ветеринарных диагностических лабораторий.

В справочник не вошли материалы по диагностике туберкулеза, так как они пересматриваются и дополняются, поэтому их публикация будет осуществлена в последующих изданиях.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ПРОФИЛАКТИКЕ, ДИАГНОСТИКЕ КОНТАМИНИРОВАНИЯ КУЛЬТУР КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМАМИ И МЕРАМ ПО ИХ ДЕКОНТАМИНАЦИИ

(Одобрены Главным управлением ветеринарии Минсельхоза СССР 21 июня 1983 г.)

1. Общие положения.

Применение культур клеток в вирусологических исследованиях, при диагностике вирусных инфекций и на предприятиях по производству противовирусных вакцин, диагностикумов вызывает необходимость разрабатывать методы культивирования клеток, позволяющие обеспечить стабильность культурально-морфологических свойств штаммов, линий клеток и их высокую чувствительность к вирусам.

Одним из факторов, вызывающих изменения в культурах клеток и затрудняющих проведение вирусологических исследований, является контаминация бактериями, микоплазмами, микроскопическими грибами и вирусами. Поэтому совершенствование способов профилактики, диагностики контаминирования микроорганизмами и методов деконтаминации с целью восстановления исходных морфологических и биологических свойств культур клеток — актуальная проблема, решение которой позволит повысить надежность и достоверность проводимых исследований, а также и эффективность биофабричного производства.

По течению инфекция в культуре клеток бывает острой, сопровождающейся дегенерацией чувствительных клеток, и латентной, когда микроорганизм персистнрует, не вызывая гибели хозяина.

Микроорганизмы-контаминанты могут располагаться в межклсточ-

ном веществе, цитоплазме, ядре, ядрышках и между азотистыми основаниями нуклеоиротеидпых нитей хромосом.

Контаминирование культур клеток микроорганизмами происходит через следующие источники инфекции:

рабочие помещения, воздушную среду; посуду, пипетки, резиновые изделия; питательные среды, растворы, сыворотку крови; животные ткани для приготовления культур клеток; контаминированные штаммы и линии клеток; сотрудников.

Систематический контроль этих источников инфекции надежно профил актирует контаминирование культур клеток микроорганизмами.

Настоящие рекомендации имеют целью регламентировать приемы и методы профилактики контаминирования клеток микроорганизмами, выявление источников инфекции* а также использование антибактериальных и антимикоплазменных препаратов для предупреждения загрязнения этих материалов бактериальной и микоплазменной микрофлорой с целью деконтаминации клеточных культур.

2. Требования к боксовым помещениям и бактериологический контроль воздушной среды.

2.1.    Лаборатория, в которой осуществляется производство питательных сред и культур клеток, должна располагать боксовыми помещениями с приточно-вытяжной вентиляцией со стерильной подачей воздуха, исключающей аэрогенную контаминацию материалов посторонней микрофлорой. При этом для обеспечения необходимого положительного давления, препятствующего проникновению микрофлоры в рабочее помещение, воздух нагнетают в бокс, а вытяжку производят из предбокс-ника. Наиболее оптимальным решением данного вопроса являются боксы с ламинарным потоком стерильного воздуха.

2.2.    Боксы оснащают бактерицидными лампами, которые включают на 30 мин до работы, в обеденный перерыв и в конце рабочего дня. При установке ламп следует руководствоваться следующими нормативами: лампа БУВ-30 на 7—8 м² или мощность 1 Вт на 1 м². Подвешивают их на уровне середины высоты комнаты. Средний срок эксплуатации ламп — 1500 ч. Входить в бокс разрешается только в специально предназначенной для этой цели одежде и обуви, причем халаты, чепчики и марлевые повязки (маски) должны быть предварительно простерилизо-ваны автоклавированием в течение 1 ч при 0,7 атм.

2.3.    Работу в боксе проводят у пламени спиртовки или газово горелки. Прежде чем открыть бутыли, флаконы, матрасы пли другую посуду с питательной средой, сывороткой, растворами или культурами клеток, горлышки сосудов и резиновые пробки протирают тампоном, смоченным в спирте, и прожигают. Во время работы в контейнеры убирают использованную посуду, резиновые и ватно-марлевые пробки, инструменты, пергаментную бумагу и другие материалы. После окончания работы выносят мусор и делают влажную уборку; столы, стулья, шкафы и другие предметы, а в конце недели и стены, протирают увлажненной стерильной салфеткой. Поверхность рабочих столов дополнительно протирают стерильной салфеткой или ватой, смоченной спиртом-ректификатом, и прожигают. Для смачивания тряпок, салфеток и ваты применяют 2%-ные растворы хлорамина, карболовой кислоты и другие дезсредства. В конце недели уборка боксов завершается проведением аэрозольной дезинфекции (см. п. 2. >).

2.4.    С целью учета эффективности стерилизующих фильтров венти-

ляционных систем и для оценки общесанитарного состояния боксовых помещений периодически, не реже одного раза в месяц, проводят бактериологические исследования воздушной среды. Микроорганизмы на воздухе улавливают с помощью аппарата Кротова на твердые бакереды (МПА, кровяной агар), разлитые в чашки Петри. После суточной инкубации чашек при 37°С просматривают и подсчитывают колонии и в соответствии с инструкцией, прилагаемой к прибору, определяют микробное число воздуха. Во время работы этот показатель не должен превышать 100 микробных тел в 1 м³.

2.5. Для улавливания быстрооседающего крупнодисперсного бактериального аэрозоля, преимущественно вызывающего аэрогенную контаминацию питательных сред и культур клеток, пробы воздуха отбирают методом седиментации микроорганизмов на открытые чашки Петри со стерильным МПА и кровяным агаром, выставляемые на стол в боксе при экспозиции в 15—30мин. Результаты исследовайий, как и в предыдущем пункте, учитывают после суточного выдерживания проб в термостате. Количество микробных тел, оседающих за 1 мин на 1 м² поверхности, рассчитывают по формуле

_v AMO*

где X — искомое число микроорганизмов; N — общее число колоний, выросших па чашках Петри; S — площадь одной чашки Петри, см²; с— число чашек Петри; t — время экспозиции чашек, мин.

Обсеменен ноет ь воздуха боксов не должна превышать 10 микробных тел на 1 м² в минуту на протяжении всей работы.

2.6. Превышение отмеченных предельно допустимых концентраций микроорганизмов в воздухе резко увеличивает вероятность бактериальной контаминации изготовляемых в боксах питательных сред и культур клеток, даже при работе с ними в непосредственной близости от пламени горелки, и вызывает необходимость дополнительной дезинфекции таких помещений. Ее проводят при помощи аппарата САГ-1 или других приборов аналогичного назначения путем аэрозольного распыления смеси, состоящей из 3% перекиси водорода в 0,5%-ном водном растворе молочной кислоты, при расходе жидкости 5 мл на 1 м³. Применение этой смеси обеспечивает надежное обеззараживание боксов и в отличие от других известных дезинфектантов (формалин, фенол, уксусная кислота и др.) не сопровождается накоплением в помещении токсических для клеток продуктов

3. Контроль стерильности стеклянной посуды, резиновых изделий и других материалов.

3.1. Подготовка посуды и других предметов к стерилизации. Горлышки вымытых и высушенных матрасов, флаконов, колб и бутылей обертывают колпачками из грех слоев бумаги, фольги или из одного слоя бумаги и одного слоя фольги. Каждый колпачок фиксируют на горлышке сосуда шпагатом или суровой ниткой. Пробирки без пробок завертывают в бумагу по 30—50 шт., а флакончики из-под антибиотиков, также используемые для посева клеток, закладывают в биксы в несколько рядов открытым горлышком книзу, дном — кверху. Предназначенные для последующего закрывания стерильной посуды резиновые пробки завертывают в пакеты. Каждый номер пробок упаковывают отдельно. На пакетах простым карандашом делают надписи с указанием номера пробок и даты стер л ли за дон.

В верхние концы пипеток вставляют вату, затем пипетки завертывают в бумагу по 10—20 шт. или помещают в стеклянные или металлические пеналы. На обертке надписывают емкость пипеток. Чашки Петри завертывают в бумагу по 1—5 шт. Воронки, ступки и пестики, а также халаты, колпаки, маски и полотенца завертывают в бумагу, каждый предмет отдельно. Фильтр Сальникова помещают в мешок из полотна. Фильтр Зейтца монтируют на бутыли и накрывают бумажным мешком (Крафта), в области горлышка бутыли его плотно перевязывают суровой ниткой. Бумагу и марлю нарезают кусочками нужных размеров, а вату сворачивают в виде шариков или тампонов. Каждый вид материала отдельно, небольшими порциями, завертывают в бумагу.

3.2. Стерилизация стеклянной посуды, резиновых пробок, трубок и других материалов.

3.2.1 Стеклянную посуду стерилизуют в суховоздушных шкафах, посуду с резиновыми пробками и трубками — в автоклавах. Посуду в шкафу размещают таким образом, чтобы воздух свободно циркулировал по всей камере. Для этого полки шкафа заполняют посудой в один ряд, оставляя ^!/з отверстий открытыми. На все полки с посудой помещают контрольные ампулы с порошкообразной сахарозой. Дверки шкафа плотно закрывают. Шкаф устанавливают на режим стерилизации и включают в электросеть, показания температуры через каждый час записывают в специальном журнале. Стерилизацию проводят при достижении 180°С в течение 2 ч. При этом пергаментная бумага не должна обугливаться. Она может лишь слегка пожелтеть под влиянием высокой температуры. При температуре выше .180°С бумага обугливается. При температуре ниже 18(гС продолжительность стерилизации удлиняется (табл. I).

1. Срок стерилизации посуды в суховоздушном шкафу в зависимости от температуры нагрева

150    240    170    180

100    180    180    120

После окончания стерилизации и остывания посуды открывают дверки шкафа и проверяют контрольные ампулы с сахарозой. Сахароза должна быть оплавленной, черного цвета. Изменение цвета этого индикатора позволяет судить о достижении необходимой температуры в камере шкафа и правильности стерилизации данной партии посуды.

3.2.2. Бутыли с резиновыми пробками, трубками, фильтры, отдельно резиновые пробки, сифоны стерилизуют в автоклавах. Автоклав одновременно загружают разным материалом. Стерилизацию ведут при режиме полного освобождения от микроорганизмов всех материалов. Стерилизация под давлением в автоклаве надежно обезвреживает микроорганизмы в материале только при соблюдении режима стерилизации и соответствии показаний на манометре давления пара температуре внутри автоклава. Ежегодно соответствие давления и температуры проверяют в официальных государственных учреждениях. Ниже приводятся соотношения между показателями манометра, выражаемые в различных единицах, и температурой внутри автоклава (табл. 2).

По показаниям манометра, регистрирующего давление в автоклаве, можно судить о температуре насыщенного водяного пара в камере в градусах Цельсия. Чем выше упругость пара, тем энергичнее он проникает в стерилизуемый материал, вытесняет из него воздух и быстрее прогревает материал до соответствующей температуры.

Фактическое достижение заданной температуры контролируют с помощью порошкообразных индикаторов с известной температурой плавления: бензонафтола— 110°С; антипирина — 115°С; резорцина — 118°С; серы — 119°С; бензойной кислоты — 121°С. К навеске 100 г индикатора для его подкраски добавляют 0,01 г сафранина или 0,005 г фуксина, перемешивают, расфасовывают по 1—2 г и запаивают в ампулы. Если автоклавирование ведут при 1 атм, то вместе с материалом в камеру помещают ампулы с резорцином и бензойной кислотой, а если при 0,5 атм, то — с бензонафтолом и антипирином. Наличие окрашенного сплава или порошка в ампулах позволяет судить о фактической температуре в стерилизационной камере. Посуду, резиновые изделия и другие материалы стерилизуют в автоклаве при 1,5—2,0 атм в течение 1¹/₂—2 ч.

2. Зависимость температуры от давления пара в автоклаве

Температура насыщенного пара н камере, °С Давление пара, атм или кг/см2 Давление пара, гектопаскалей (ГПа) Давление пара, мм рт. ст. Давление пора, фунтов на кв. дюйм 100 0 1013 760 0 111,8 0,5 1470,9 1103,3 7,0 115,0 0.7 1621,2 1216,0 9,5 120,6 1.0 2016 1520,0 14,0 127,8 1,5 2522 1910,0 21,0 133,9 2,0 3110 2280,0 28,0

4. Контроль стерильности питательных сред, растворов и сыворотки.

4.1- Использование в работе контаминнрованных клеточных культур, питательных сред, растворов и сыворотки крупного рогатого скота недопустимо. В связи с этим их подвергают тщательному и многоэтапному контролю на стерильность, что является обязательной и обычной процедурой в системе мероприятий по профилактике обсемененности культур клеток микрофлорой.

4.2. Во всех случаях при исследовании на обсемененность микроорганизмами культуральных питательных сред, сывороток и культур клеток используют следующий минимальный набор бактериологических сред:

мясо-пептоиный бульон (МПБ) с 0,5% глюкозы; кровяной агар; жидкая среда Сабуро; тиогликолевая среда;

среда Эдварда—Хейфлика или ее модифицированный вариант — 2%-ный раствор мышечного ферментативного гидролизата (ФГМС) на растворе Хенкса с добавлением 10% сыворотки крови лошади или крупного рогатого скота и 10% дрожжевого экстракта. Микробиологические высевы на бактерии и микоплазмы помещают на 14 сут в термостат при 37°С, а среду Сабуро на микроскопические гри-