ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИИ ИНСТИТУТ НЕЗАРАЗНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ЖИВОТНЫХ

СИСТЕМА МЕРОПРИЯТИЙ ПО БОРЬБЕ С БОЛЕЗНЯМИ ВИТАМИННОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ В ПРОМЫШЛЕННОМ ПТИЦЕВОДСТВЕ

(Методические указания)

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ НЕЗАРАЗНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ЖИВОТНЫХ

СИСТЕМА МЕРОПРИЯТИЙ ПО БОРЬБЕ С БОЛЕЗНЯМИ ВИТАМИННОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ В ПРОМЫШЛЕННОМ ПТИЦЕВОДСТВЕ

(Методические указания)

к 5 мл (0,25 мг%-го р-ра) добавляют 5 мл бензола (0,125 мг%-й р-р).

Далее в пробирку по 1 мл каждого разведения прибавляют 1 мл бензола и 2 мл железодипиридилового реактива. Контроль: 2 мл бензола и 4 мл железодипиридилового реактива.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА Е В СЫВОРОТКЕ КРОВИ

Принцип метода. Метод основан на фотометрическом определении интенсивности окраски при цветной реакции хлорного железа, с витамином Е в присутствии 2,2^/-дипиридила.

Реактивы. Гексан, этанол 96°, хлороформ, 2%-й р-р хлорного железа, 2%-й р-р 2,2'-дипиридила (на абсолютном спирте).

Посуда и оборудование. Пробирки центрифужные, водяная баня, центрифуга, баллон с газообразным азотом, фотоэлектроколориметр.

Ход определения. В центрифужную пробирку, содержащую 1 мл сыворотки, добавляют 2 мл 96° спирта, 3 мл гексана и 1 мл дистиллированной воды. Затем через полученный раствор несколько секунд пропускают азот, после чего пробирки закрывают пробками и тщательно встряхивают в течение 1—2 минут. Одновременно, подобным образом, обрабатывают контрольную пробу, вместо сыворотки берут 1 мл дистиллированной воды. После встряхивания пробы центрифугируют в течение 10 минут при 1500 об/мин. Затем отбирают 2 мл надосадочной жидкости и выпаривают на водя t-гой бане в токе азота (водяная баня при температуре 60°С). После выпаривания в каждую пробирку добавляют по 0,2 мл хлороформа, 2 мл этанола, 0,2 мл 2%-го раствора 2,2'-дипиридила, 0,2 мл 2%-го раствора хлорного железа. Пробы встряхивают 10 сек и колориметрируют на фотоэлектроколориметре при длине волны 520 нм не позже 40 сек, в кювете с рабочим расстоянием 5 мм против контроля. Контролем служит 0,2 мл хлороформа + 2 мл этанола + 0,2 мл 2%-го раствора 2,2'-дипиридила + 0,2 мл 2%-го раствора хлорного железа. Содержание витамина Е находят по калибровочной кривой.

Построение калибровочной кривой

Основной раствор (20мг%-й) готовится следующим образом:

10

10 мг (чистого 96%-го а -токоферола) растворяют в колбе на 50 мл абсолютным спиртом.

Для построения калибровочной кривой готовят рабочие растворы:

2,5 мл основного раствора растворяют в колбе на 25 мл (2 мг%-й р-р);

к 5 мл (2 мг%-го р-ра) добавляют 5 мл абсолютного спирта (1,0 мг%-й р-р);

к 5 мл (1,0 мг%-го р-ра) добавляют 5 мл абсолютного спирта (0,5 мг%-й р-р);

к 5 мл (0,5 мг%-го р-ра) добавляют 5 мл абсолютного спирта (0,25 мг%-й р-р);

к 5 мл (0,25 мг%-го р-ра) добавляют 5 мл абсолютного спирта (0,125 мг%-й р-р).

В центрифужные пробирки берут no 1 мл каждого разведения. Все остальные операции выполняют в том же порядке, как описано выше.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ Е-ВИТАМИННОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ

С ПОМОЩЬЮ ТЕСТ-ГЕМОЛИЗА ЭРИТРОЦИТОВ

Принцип метода. Витамин Е, участвуя в углеводном, белковом и липидном обмене, способствует сохранению целостности клеточных мембран. Одной из форм проявления гиповитаминоза Е является нарушение лнпопротеиновых оболочек клеток и их субклеточных органелл. В полной мере недостаток токоферола отражается и на состоянии эритроцитарных мембран, в результате чего снижается устойчивость эритроцитов к действию лизирующих веществ. На этой биологической зависимости основан метод тест-гемолиза эритроцитов с лимонной кислотой, который используется для диагностики Е-витаминной недостаточности у птиц.

Реактивы. Фосфатный буфер (14,2 г безводного фосфорнокислого двузамещенного натрия растворяют в 1 л дистиллированной воды, pH 7,4 доводят 1н раствором соляной кислоты), 0,89%-й раствор хлористого натрия, солефосфатный раствор (смесь равных частей фосфатного буфера и солевого раствора), 0,1 %-й раствор лимонной кислоты на солефосфатном растворе.

Посуда и оборудование. Пробирки центрифужные на 10 мл, пипетки на 1—5 мл и микропипетки на 0,1 мл, фотоэлектроколориметр, термостат, центрифуга.

Ход определения. В центрифужную пробирку, содержащую 3 мл солефосфатного раствора, добавляют 0,03 мл крови, взятой из подкрыльцовой вены, смешивают и центрифугируют 10 мин при 1500—2000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают. К осадку эритроцитов добавляют 3 мл солефосфатного раствора, осторожно смешивают до однородной взвеси, а затем переносят по 1 мл в три пробирки. В первую и вторую пробирку добавляют по 1 мл 0,1% раствора лимонной кислоты, а в третью — 1 мл солефосфатного раствора и выдерживают в термостате 30 мин. при температуре 40°С, а затем 1 ч. при комнатной температуре. После этого в первую и третью пробирки добавляют по 3 мл солефосфатного раствора, а во вторую — 3 мл дистиллированной воды. Содержимое каждой пробирки осторожно перемешивают и центрифугируют при 1500—2000 об/мин 10 мин. Надосадочную жидкость каждой пробирки колориметрируют (светофильтр № 3, длина волны 410—415 нм). Контролем служит солефосфатный раствор.

Гемолиз в процентах вычисляют по формуле:

(а—в) : (б—в) х ЮО, где

а — показание ФЭКа при исследовании содержимого первой пробирки;

б — показание ФЭКа при исследовании содержимого второй пробирки;

в — показание ФЭКа при исследовании содержимого третьей пробирки.

Во избежание ошибки при определении следует пользоваться чистой стеклянной посудой, ополаскивая ее спиртом и тщательно просушивая. Нельзя сильно встряхивать пробирки с кровью, особенно после инкубации в термостате, иначе может произойти механический гемолиз эритроцитов.

Диагностическое значение. У клинически здоровой птицы в реакции с лимонной кислотой гемолизируется не более 8% эритроцитов, что соответствует физиологическому содержанию токоферола в сыворотке крови: 0,85—1,2 мг%.

При уменьшении запасов витамина Е в организме устойчивость эритроцитов к гемолизу снижается. Так, гемолиз эритроцитов 10% и выше оценивается как показатель Е-вита-минной недостаточности. Чем выше гемолиз эритроцитов, тем более четко у птицы проявляются клинические признаки гиповитаминоза Е.

Диагностика гиповитаминоза К. К-витаминную недостаточность у птиц диагностируют на основании клинических признаков, патологоанатомических изменений и результатов биохимических исследований печени и сыворотки крови больных птиц.

Основными клиническими симптомами недостатка витамина К у птиц являются массовые кровоизлияния или кровотечения, возникающие при незначительных повреждениях сосудов и продолжающиеся длительное время из-за замедленной свертываемости крови.

При дефиците витамина К у несушек родительского стада птица несет большое количество яиц с кровяными пятнами. Из таких яиц выводится молодняк с повышенной кровоточивостью, который погибает в первые дни жизни от незначительных повреждений сосудов (прикрепление крылометок, обрезание клюва).

Патологоанатомические изменения

У павших птиц обнаруживается картина обескровливания тканей и органов, скопление плохо свернувшейся крови в полостях, под кожей, в межмышечных пространствах, под серозными оболочками.

Геморрагические явления у больных птиц могут быть в любой части тела, подвергшейся механическому воздействию или сильному мышечному напряжению, но, в основном, появляются в области головы, крыльев, грудных и бедренных мышц, в кутикулярном слое, мышечном слое мышечного желудка, под капсулой печени и в толще паренхимы органа.

Характерным патологоанатомическим признаком при К-витаминной недостаточности у взрослых птиц являются гематомы под капсулой печени и в толще органа, у молодняка старшего возраста — геморрагические кровоподтеки в межмышечных пространствах и кровоизлияния под кожей, а у молодняка первых дней жизни — очагово-язвенные кутикулиты.

Лабораторная диагностика

Из биохимических методов исследований наиболее достоверными являются: прямой метод определения витамина К в печени и экспресс-метод определения протромбиновой активности крови.

Принцип метода. Метод основан на фотометрическом определении интенсивности окраски при цветной реакции 2 метил-1,4 нафтохинона с анилином.

Реактивы. Анилин, петролейный эфир, витамин Ki (масляный — 96%-й).

Посуда и оборудование. Фотоэлектроколориметр, центрифуга, весы аналитические, ступки фарфоровые с пестиком, делительные воронки емкостью 50 мл, центрифужные пробирки, мерные пипетки на 5 мл.

Ход определения. Навеску печени в 1 грамм тщательно растирают в ступке. Растертую массу переводят в делительную воронку и ступку смывают 5 мл воды. Прибавляют сюда же 10 мл петролейного эфира. Всю массу взбалтывают в течение 5 мин, затем переливают в центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 15 минут при 1500 об/мин. После центрифугирования берут 5 мл надосадочнон жидкости, приливают 2 мл анилина, встряхивают в течение 2 минут и ставят центрифугировать 5 минут при 1500 об/мин. Затем верхний слой выливают, а нижний слой колориметри-руют на ФЭКе, кювета № 3, светофильтр № 4 (фиолетовый). Контролем служит анилин. Содержание витамина К определяют по калибровочной кривой.

Построение калибровочной кривой

10 мг витамина Ki растворяют в колбе на 50 мл петро-лейным эфиром (200 мкг/г);

25 мл раствора (200 мкг/г) + 25 мл петролейного эфира (100 мкг/г);

25 мл раствора (100 мкг/г) +25 мл петролейного эфира (50 мкг/г);

25 мл раствора (50 мкг/г) + 25 мл петролейного эфира (25 мкг/г);

5 мл раствора (25 мкг/г) + 5 мл петролейного эфира (12,5 кмг/г).

Затем из каждой колбы берут 5 мл раствора, добавляют 2 мл анилина. Пробирку закрывают и смесь взбалтывают в течение 2 минут. Центрифугируют в течение 5 минут при 1500 об/мин. Затем нижний слой анилина колориметрируют на ФЭК. Контроль — анилин. Кювета № 3, светофильтр № 3.

ДИАГНОСТИКА К-ВИТАМИННОИ НЕДОСТАТОЧНОСТИ У ПТИЦ ПО ПРОТРОМБИНОВОЙ АКТИВНОСТИ крови

Принцип метода. При участии витамина К в организме птиц осуществляется синтез протромбина, проконвертина и некоторых других факторов свертывания крови. Существует корреляция между содержанием протромбина в крови и витамином К в организме птиц. «Протромбиновое время» (время, необходимое для образования в плазме крови сгустка из фибрина в присутствии проконвертина, тромбопластина и солей кальция) как показатель содержания в крови протромбина используется для определения обеспеченности организма птиц витамином К-

Реактивы. 0,85%-й физиологический раствор, 1,34%-й раствор щавелевокислого натрия (1,34 г на 100 мл дистиллированной воды), 0,277%—раствор хлористого кальция (0,277г высушенного до постоянного веса и хранимого в эксикаторе хлористого кальция на 100 мл воды), лабораторный тромбо-пластин) (с активностью 22—27 с). Перед постановкой опыта берут 50 мг сухого препарата тромбопластина, растирают с 5 мл дистиллированной воды в фарфоровой ступке до получения однородной массы. Полученную суспензию переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют 8—10 минут при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость сливают в пробирку и используют при постановке реакций. Разведенного тромбопластина (50 мг) достаточно для исследования 45—50 проб крови.

Посуда и оборудование. Пробирки центрифужные, пробирки Видаля, пипетки на 1,2 мл, микропипеткн на 0,1—0,2 мл, водяная баня, секундомер, центрифуга.

Ход определения. Для получения объективных данных нужно исследовать кровь от 10—15 птиц, имеющих характерные для этой группы признаки. Исследуемая птица не позднее 6 часов до взятия крови должна получать достаточное количество питьевой воды. У нее не должно быть признаков заболевания печени. Кровь в количестве 0,4 мл берут пипеткой или шприцем из кровеносных сосудов крыла, ног (можно из сосудов шеи после декапитации) и выливают в центрифужные пробирки, содержащие 0,1 мл раствора щавелевокислого натрия. Для перемешивания крови с оксалатом

натрия пробирку слегка покачивают, а затем центрифугируют 10 минут при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость (плазму) отсасывают и пипеткой переносят в пробирку, где смешивают с равным количеством 0,85%-го раствора хлористого натрия.

В тонкостенную пробирку Видаля наливают 0,2 мл хлористого кальция и 0,1 мл разведенного тромбопластина. Пробирку помещают в водяную баню (40°С) и одновременно включают секундомер. Через 30 сек, не вынимая пробирки из бани, вводят в нее пипеткой 0,1 мл разведенной плазмы и слегка встряхивают до появления хлопьев или сгустков (лучше видны при проходящем свете). При появлении сгустков или хлопьев выключают секундомер, замечая время. «Про-тромбиновым» считается время, прошедшее с момента введения пробирки в водяную баню до появления хлопьев или сгустков, исключая 30 сек, затраченных на прогревание пробирки.

Если исследуемая кровь хранилась более 3 часов (при обычной температуре) с момента ее взятия, а также подвергалась замораживанию или в нее добавлено больше оксалата натрия, чем рекомендуется, то «протромбиновое время» значительно увеличивается.

Диагностическое значение. При достаточной насыщенности организма птиц витамином К среднее «протромбиновое время» у птиц при работе с гетерологичным тромбопластином (Кировский НИИ гематологии и переливания крови) составляет 45 сек. с пределами колебаний от 30—55 сек.

«Протромбиновое время» 60 и более секунд указывает на имеющийся дефицит витамина К в организме птиц.

При исследовании сыворотки крови с гомологичным ветеринарным тромбопластином (изготовлен из тканей суточных цыплят) —среднее «протромбиновое время» у птиц составляет 20 секунд с пределами колебаний 17—25 сек, что соответствует оптимальному содержанию в печени взрослых птиц витамина К-225 мкг/г с пределами колебаний 200—250 мкг/г и молодняка птиц 40 мкг/г с пределами колебаний 30— 50 мкг/г.

Симптомы К-витаминной недостаточности наступают при увеличении «протромбинового времени» как для гетерологичного, так и для гомологичного тромбопластинов в 2 и более раз.

Это групповой экспресс-метод, и для объективной постановки диагноза необходимо исследовать кровь не менее 10 птиц.

Диагностика Д-гиповитаминоза. При дефиците витамина Д в организме птиц нарушаются процессы всасывания из кишечника фосфорнокислых солей, уменьшается количество кальция и фосфора в костях, в результате чего развивается рахит у молодняка и остеомаляция у взрослых птиц.

Развитию этой патологии во многом способствует недостаток или неправильное соотношение между кальцием и фосфором, так как регуляторное влияние витамина Д на соотношение кальция и фосфора ограничено определенными пределами.

Диагноз ставят, основываясь на данных анализа рациона, клинических патоморфологических признаков и биохимических исследований содержания витамина Д₃, кальция и фосфора.

Патоморфологические изменения

При вскрытии павшей птицы обращает на себя внимание синюшность слизистых оболочек. Основные изменения сосредоточены в трубчатых, плоских и смешанных костях.

У молодняка птиц кости мягкие, хрящеподобные, легко режутся или ломаются. Под влиянием веса тела, мышечных сокращений и других нагрузок они искривляются, изменяется фома грудной кости. В местах костно-хрящевых сочленений ребер возникают утолщения, называемые рахитическими четками.

У утят, кроме вышеописанных изменений, клюв мягкий, резиноподобный. У взрослых птиц патология проявляется декальцинацией (остеомаляция) костей с образованием неполноценной в функциональном и морфологическом отношении остеоидной и хрящевой ткани. В период интенсивной яйцекладки несушки несут большое количество яиц шероховатых с насечками и тонкой скорлупой или вообще без скорлупы.

Лабораторная диагностика

Из биохимических методов исследования используют определение витамина Д₃ в печени и экспресс-метод определения уровня лимонной кислоты в крови.

Принцип метода. Метод основан на гидролизе исследуемого образца спиртовым раствором щелочи и отделении неомылягощейся фракции бензолом: удалении стеринов преципитацией с дигитанином, адсорбции токоферолов и каротиноидов на колонке с окисью алюминия, хроматографии на колонке с гумбрином с целью удаления витамина А, спектрофотометрического определения витамина Д по реакции с треххлористой сурьмой.

Реактивы. Бензол, свободный от тиофена и толуола, 1,2-ди-хлорэтан, 96° этанол (перегнанный), 72° этанол (75 мл 96° этанола + 25 мл дистиллированной воды, эфир серный, свободный от перекисей и кислот, эфир петролейный (фракция 40—70°), свободный от воды, ненасыщенных и ароматических углеводородов, 2%-й раствор дигитонина в 72° этаноле, гумбрин 60—100 меш, содержащий 11% воды.

Для хроматографии гумбрин предварительно измельчают на шаровой мельнице, просеивают через сито 110 меш. К 200 г просеянного гумбрина добавляют 500 мл 96° этанола, хорошо размешивают и кипятят полученную смесь в течение 2—3 мин. После отстаивания верхний слой сливают. К осадку добавляют 250 мл 96° этанола и еще раз кипятят в течение 2—3 мин. при постоянном помешивании. Затем смеси дают отстояться, надосадочную жидкость сливают, а осадок дважды промывают диэтиловым эфиром. Промытый гумбрин переносят на стеклянный фильтр (нутч-фильтр) № 1 и с помощью вакуумного насоса отсасывают излишнюю влагу, далее его помещают в сушильный шкаф при температуре 60° на 3 часа, а затем хранят в темной посуде с притертой пробкой. Перед употреблением гумбрин снова помещают в сушильный шкаф на 6 часов при температуре 105°, охлаждают в эксикаторе над хлористым кальцием 1—2 часа, взвешивают, вносят в него воду из расчета 11% от массы гумбрина.

Окись алюминия (щелочная). В колбе на 200 мл смешивают 75 г окиси алюминия для хроматографии (100 325 меш.) с 75 мл 2 и спиртового раствора едкого калия, подогревают на водяной бане 15 минут при температуре 80° и охлаждают. Затем фильтруют отсасыванием, сушат при 130° в вакууме и хранят в герметически закрытой колбе. Реактив Ниелда. Берут 22 г треххлористой сурьмы и заливают 100 мл хлороформа. Из полученного раствора готовят 2%-й ра-

створ ацетилхлорида. Спустя 3 суток реактив готов к употреблению.

Основной стандартный раствор витамина Д. Растворяют 10 мг кристаллического витамина Д в 200 мл бензола и хранят в холодильнике в темной герметически закрытой посуде. Раствор стоек в течение 14 суток.

Рабочий стандартный раствор витамина Д. В мерную колбу емкостью 100 мл наливают 5 мл основного стандартного раствора и доводят бензолом д метки. 1 мл этого раствора содержит 2,5 мкг витамина Д.

Ход определения. В колбу на 300 мл берут 10 г тщательно измельченной печени, заливают 200 мл 75%-го спиртового раствора едкого калия, добавляют 0,5 г аскорбиновой кислоты, все тщательно перемешивают, после чего проводят гидролиз в течение 30 минут на водяной бане с обратным или воздушным холодильником при температуре кипения смеси 80°, не допуская бурного кипения. Далее колбу охлаждают под струен холодной воды, добавляют 50 мл 96° этанола, содержимое тщательно перемешивают и переносят в колбу с притертой пробкой (29 шлиф) на 1000 мл, добавляют 200 мл бензола, колбу закрывают и встряхивают до получения однородного раствора, затем приливают 400 мл дистиллированной воды и снова энергично встряхивают. Затем содержимое колбы переносят в делительную воронку на 1000 м, которую прочно закрепляют в штативе. После разделения слоев нижний водный слой отбрасывают (если разделение слоев медленное или нечеткое, необходимо добавить 10—20 мл 96° этанола). Бензольный экстракт промывают 80 мл 0,5 н водного раствора едкого калия, отмывают дистиллированной водой от щелочи порциями по 80 мл до нейтральной реакции по фенолфталеину, после чего бензольный экстракт сливают в колбу с сернокислым натрием (7—8 г) и ставят в темное место на 30—60 мин. Высушенный бензольный экстракт фильтруют через складчатый фильтр, при этом трижды промывая сернокислый натрий и фильтр бензолом (10—15 мл).

Отфильтрованный бензольный экстракт выпаривают под вакуумом в токе азота на роторно-вакуумном испарителе на водяной бане при температуре 80°. Затем колбу разъединяют с вакуумом и азотом и к сухому остатку быстро добавляют 20 мл 96° этилового спирта. Если сухой остаток не растворился, то колбу следует немного подогреть. Далее добавляют 8,6 мл дистиллированной воды. Раствор должен быть про-

Система мероприятий по борьбе с болезнями витаминной недостаточности в промышленном птицеводстве подготовлена научными сотрудниками ВНИИ незаразных болезней животных Л. И. Войтов, Н. М. Федорова, В. П. Бездверный, А. М. Селиванова, Т. И. Ры-бакнна, В. А. Миронова), Центральной ветеринарной лабораторией ГУ В СССР (Т. Ф. Яковлева), ведущими специалистами ГУВ СССР (С. С. Яковлев, В. П. Новгородов).

Система мероприятий по борьбе с болезнями витаминной недостаточности в промышленном птицеводстве предназначена для ветеринарных и зоотехнических специалистов птицеводческих хозяйств.

Система мероприятий по борьбе с болезнями витаминной недостаточности одобрена Главным управлением ветеринарии Госагропрома СССР 12 июля 1989 года.

(С) Всесоюзный научно-исследовательский институт незаразных болезней животных.

зрачным, если этого явления не наблюдается, колбу необходимо подогреть для просветления раствора. Затем приливают 10 мл 2%-го спиртового раствора дигитонина и через 30 мин. образующийся в растворе осадок комплекса стерин-дигитонина отфильтровывают через бумажный складчатый фильтр, смоченный 72° этанолом. Фильтр и колбу промывают 15 мл 72° этанола. К полученному фильтрату еще раз добавляют 10 мл 2%-го спиртового раствора дигитонина и ставят в холодильник до следующего дня (на 18—20 час.), предварительно плотно закрыв колбу притертой пробкой.

При определении витамина Д в других объектах обработку дигитонином можно проводить однократно, с выдерживанием образцов в холодильнике, лучше в морозильной камере, в течение 18—20 ч. Образующийся осадок снова фильтруют, как было указано выше, полученный фильтрат дважды экстрагируют в делительной воронке по 25 мл петролейным эфиром и промывают 20 мл 72° этилового спирта. Нижний спиртово-водный слой отбрасывают, а экстракт сливают для выпаривания в колбу, в которую вставлена обычная стеклянная воронка с бумажным фильтром, на дно которого помещают сернокислый натрий. Фильтр с сернокислым натрием промывают петролейным эфиром. Затем фильтрат выпаривают под током азота в роторно-вакуумном испарителе на водяной бане при температуре 60°С. Полученный сухой остаток растворяют в 10 мл петролейного эфира. В итоге выполненных операций получается раствор А.

С целью удаления каротиноидов и токоферолов, которые мешают определению витамина Д, проводят колоночную хроматографию на окиси алюминия. Для этого в колбу Эрлен-мейера на 50 мл к 5 г щелочной окиси алюминия добавляют 0,55 мл дистиллированной воды, закрывают резиновой пробкой, нагревают 5 мин. на водяной бане при 80°С и встряхивают до образованию рыхлого порошка. Колбу охлаждают, и окись алюминия переносят в хроматографическую колонку (0,7 см), в узкой части которой помещена вата. Затем пропускают через приготовленную колонку с окисью алюминия 10 мл петролейного эфира и переносят раствор А. Далее сразу же после прохождения раствора А через окись алюминия проводят элюцию, вначале дважды по 5 мл и один раз 40 мл 1%-го раствора диэтилового эфира в петролейном эфире, а затем 50 мл 10%-го раствора диэтилового эфира в петролейном эфире. Собранный элюат выпаривают досуха

Общие вопросы

Экономический ущерб, наносимый промышленному птицеводству болезнями витаминной недостаточности, складывается из снижения оплодотворяемости яиц и выводимости, задержки роста и развития молодняка, снижения количества и качества птицеводческой продукции и значительной гибели птиц.

Кроме того, нарушение витаминного обмена понижает общую неспецифическую резистентность организма птиц и создает предпосылку для возникновения заболеваний инфекционной этиологии.

Причины, обуславливающие гиповитаминозы

Раньше болезни витаминной недостаточности были следствием несбалансированности рациона и недостаточного содержания витаминов в кормах, в настоящее время, когда рационы для птиц обогащают в необходимом количестве витаминными премиксами, возникновение гиповитаминозов обусловлено следующими причинами:

а)    использование кормовых ингредиентов, увеличивающих потребность организма птиц в витаминах (белки и жиры животного и растительного происхождения, содержащих высокий уровень непредельных углеводородов, госсипола, уреазы и перекисей липидов, а также грибковые токсины);

б)    введение в кормовые смеси или дача с водой лекарственных препаратов, являющихся антагонистами витаминного обмена (антибиотики, кокцидиостатики, сульфаниламидные и нитрофурановые препараты);

в)    действие на птиц неблагоприятных факторов, повышающих их потребность в витаминах (вакцинация, диагностические исследования, перевозка и пересадка, переуплотнен-ность, загазованность помещений и др.);

г)    диспропорция отдельных витаминов в кормах и неравномерное распределение витаминов и премикса в кормовых смесях, чему способствует дополнительное обогащение кормов витаминами непосредственно в хозяйствах, без надлежащей эмульгации жирорастворимых витаминов и растворение в воде водорастворимых витаминов;

д)    снижение активности витаминов в премиксе и в витаминных препаратах, имеющихся в хозяйстве.

Диагностика

В птицеводческих хозяйствах чаще диагностируют смешанные формы гипо- и гипервитаминозов, что свидетельствует о том, что дефицит или избыток одного из витаминов в организме птицы неизбежно сопровождается снижением активности других витаминов.

При определении уровня витаминной обеспеченности птицы необходимо учитывать возраст и продуктивную направленность, так как у мясной птицы (бройлеры, индейки, утки и гуси) чаще диагностируется дефицит витаминов Е, К, С, у птиц яичного направления — недостаток или избыток витаминов А, Д₃, В₂. Несколько чаще встречают гиповитамино-зы К, В₂, Bj у птиц при клеточном содержании и это обстоятельство необходимо учитывать при выяснении причины гиповитаминоза и профилактики заболевания.

Наиболее достоверными методами диагностики гипо- и гипервитаминозов являются биохимические способы определения витаминов в депонирующем органе.

Систематический контроль за содержанием витаминов в организме птиц позволяет устанавливать нарушение витаминного обмена на ранних стадиях, когда в организме еще нс наступили необратимые функциональные и морофологиче-екпе изменения и его значительно быстрее можно вывести из такого состояния.

Одним из основных объектов биохимического контроля должна быть племенная птица, так как от ее физиологического состояния во многом зависит биологическая полноценность инкубационного яйца и жизнеспособность молодняка в первые дни жизни.

Контроль за быстрорастущим организмом бройлеров необходимо осуществлять не менее 2 раз в месяц, а исследование ремонтного молодняка, взрослой птицы и инкубационного яйца следует проводить не менее одного раза в месяц.

Биохимическому исследованию подвергают клинически здоровую птицу. Исследование больных птиц, так называемый санбрак, дает необъективные показатели по обеспеченности витаминами. Печень от павшей птицы не исследуют на содержание витаминов.

Диагностика А-гиповитаминоза. Осуществляют на основании патологоанатомических изменений и биохимических исследований.

В настоящее время в промышленном птицеводстве редко встречаются болезни А-витаминной недостаточности с характерными патологоморфологическими изменениями. Чаще в птицеводческих хозяйствах диагностируют гипервитамино-зы А, для которых характерны те же патологоморфологические изменения, что и для дефицита витамина А (ломкость перьев, кожные дерматиты, кератоконъюнктивиты и гиперкератоз слизистых оболочек).

Лабораторная диагностика А-витаминной обеспеченности организма птиц наиболее достоверна при использовании спектрофотометрического метода.

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНА А И КАРОТИНОИДОВ В ПЕЧЕНИ И ЯЙЦЕ

Принцип метода. Метод основан на щелочном гидролизе н экстракции витамина А и каротиноидов из измельченной ткани при помощи малолетучих растворителей и последующем спектрофотометрическом измерении поглощения света раствором до и после разрушения витамина А ультрафиолетовыми лучами при длине волны 328 им и 460 нм для каротиноидов.

Реактивы. 96%-й этиловый спирт, ксилол или о-кси-лол (ч), октан х. ч., калий едкий, 1 и раствор едкого калия в 96%-м этиловом спирте. К 1 объему 11 н раствора едкого калия добавить 10 объемов этилового спирта. Раствор готовится в день проведения анализов, 11 н раствор едкого калия: 617,16 г едкого калия доводят дистиллированной водой в колбе на) 1 л, ксилоло-октановая смесь (1:1). Готовят в день проведения анализов.

Оборудование. Спектрофотометр, ультрафиолетовая лампа ПРК-4, центрифуга, водяная баня, вентилятор настольный, пробирки из стекла пирекс, пропускающие ультрафиолетовые лучи, 55X8 мм, центрифужные пробирки, пипетки градуированные на 1, 5, 10 мл, стеклянные палочки.

Ход определения. Для исследования используют свежую или хранившуюся в замороженном состоянии печень. Пробу печени тщательно растирают в фарфоровой ступке, затем взвешивают 0,5 г полученной гомогенной массы (таким же образом готовят для анализа пробу желтка, только желток в количестве 1 г отвешивают непосредственно в центрифужную пробирку).

Навеску печени количественно переносят в центрифуж-

ную пробирку и приливают 2 мл 1 н спиртового раствора едкого калия. Перемешивают стеклянной палочкой до образования однородной смеси и ставят для гидролиза на водяную баню при температуре 60°С на 30 минут. После этого пробирки охлаждают в холодной воде в течение 5—10 минут и добавляют в каждую 8 мл ксилоло-октановой смеси. Пробирки закрывают пробками и сильно встряхивают в течение 2 мин., после чего центрифугируют 5 мин при 1500 об/мин. Верхний слой центрифугата переносят пипеткой в кварцевую кювету спектрофотометра и калориметрируют: каротиноиды определяют при длине волны 460 нм, витамин А путем двукратного измерения, до и после облучения проб ультрафиолетовыми лучами, при длине волны 328 нм. Для этого исследуемые пробы переносят из кювет в пробирки из стекла пирекс и облучают 45—60 мин лампой ПРК.-4 на расстоянии 15—19 см. Для того чтобы пробирки не нагревались, во время облучения их охлаждают с помощью настольного вентилятора. Концентрацию витамина А определяют по разности отсчетов при спектрофотометрировании до и после облучения.

Расчет. Содержание каротиноидов определяют по формуле:

X = 4,8 • Е • 2 • п, где X — искомое содержание каротиноидов в мкг/г;

4,8 — коэффициент по Бессею для каротина;

Е — оптическая плотность пробы при 460 нм;

2 — коэффициент пересчета на 1 грамм печени; п — разведение (количество мл ксилоло-октановой смеси). Определение содержания витамина А производят по формуле:

X = 6,37 • (Е] — Е₂) • 2 • п, где X — содержание витамина А в мкг/г;

6,37 — коэффициент для витамина А по Бессею;

Ei — оптическая плотность раствора витамина А до облучения при 328 нм;

Ег — оптическая плотность раствора витамина А после облучения при 328 нм;

2 — коэффициент пересчета на 1 грамм печени; п — разведение.

При высоком содержании витамина А в печени нужно проводить дополнительное разведение. Это дополнительное раз-ведение учитывают в формуле расчета.

Диагностика Е-гиповитаминоза. Болезни Е-витаминной недостаточности у молодняка птиц проявляются большим разнообразием клинических признаков и патологоанатомических изменений (энцефаломаляция, экссудативный диатез, беломышечная болезнь и токсическая дистрофия печени).

Диагностируют болезни Е-витаминной недостаточности комплексно по результатам иатологоанатомических, гистологических и биохимических методов исследования.

Патологоанатомические изменения.

а)    энцефаломаляция — восприимчив молодняк птиц 3—6-недельного возраста. Изменения локализуются преимущественно в мозжечке и проявляются кровоизлияниями, разрушением клеток мозговой ткани с последующим образованием очагов некроза, застойными явлениями.

В отдельных случаях морфологические изменения обнаруживают в скелетной мускулатуре и миокарде;

б)    экссудативный диатез — восприимчив молодняк птиц 3—7-недельного возраста. Основным патологоакатомическим признаком этого заболевания являются обширные подкожные инфильтраты соломенного цвета в области головы, шеи, груди, конечностей. Иногда студневидные отеки наблюдаются в межтканевых пространствах внутренних органов и головном мозге. Кроме отеков в подкожной клетчатке, обнаруживаются изменения в миокарде (дистрофия) и в поджелудочной железе (очаговые некрозы);

в)    беломышечная болезнь (миодис.трофия), восприимчив молодняк птиц 2—4-недельного возраста. Довольно часто изменения, характерные для беломышечной болезни, диагностируются у 24—25-суточных эмбрионов индюшат, гусят и утят.

У индюшат патологоанатомические изменения обнаруживаются постоянно в мышечном желудке, значительно реже в миокарде и скелетной мускулатуре. Мышечный желудок уменьшен в объеме, несколько сплюснут, слегка упругой консистенции. На разрезе желудка обнаруживаются серо-белые участки пораженной мышечной ткани, придающие ему мозаичный рисунок. Сердечная мышца дряблая, иногда на фоне темно-розового цвета обнаруживаются серо-белые полоски и тяжи.

У цыплят и гусят морфологические изменения локализуются в скелетной мускулатуре грудной кости, конечностей. Пораженные участки мускулатуры имеют вид вареного мяса.

Большим разнообразием морфологических изменений характеризуется беломышечная болезнь утят. Так, в одних хозяйствах у больных утят поражается только мышечный желудок, у других — скелетная мускулатура, а у третьих — печень;

г) токсическая дистрофия печени утят — одна из форм проявления беломышечной болезни. Печень резко увеличена, заполняет всю брюшную полость, полнокровная, темно-вишневого цвета, дряблой, мажущейся консистенции. Капсула снимается легко. Сердечная мышца дряблая, грушевидной формы и пронизана тонкими серо-белыми полосками.

Лабораторная диагностика Е-витаминной обеспеченности организма птиц

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА Е В ПЕЧЕНИ И ЯЙЦЕ

Принцип метода. Метод основан на фотометрическом определении интенсивности окраски при цветной реакции витамина Е с железодипиридиловым реактивом.

Реактивы. Ацетон, петролейный эфир (40—60°), 85%-я серная кислота, 2%-й гидроксид калия, железодипириди-ловый реактив. Готовится следующим образом: 250 мг хлорного железа и 500 мг 2,2'-дипиридила растворяют в 1 л ледяной уксусной кислоты, реактив стабилизируется на 7—10 день. Хранить при комнатной температуре в посуде из темного стекла, бензол.

Посуда и оборудование. Ступка фарфоровая с пестиком, делительная воронка на 250—500 мл, колба на 50 мл, центрифужные пробирки, центрифуга, фотоэлектроколориметр, водяная баня, баллон с газообразным азотом.

Ход определения. Навеску печени или желтка в 2 г тщательно измельчают и растирают в ступке, заливают 30 мл ацетона, снова растирают, дают отстояться и верхний слой декантируют в делительную воронку, одновременно фильтруя через бумажный фильтр. Повторно витамин экстрагируют 30 мл смеси (ацетон 15 м + 15 мл петролейного эфира), третий раз смесью 10 мл ацетона + 20 мл петролейного эфира. Экстракты, собранные в делительную воронку 2 раза промывают 2—3-кратным объемом дистиллированной воды. Петролейно-

эфирный экстракт переносят в колбу и на водяной бане при температуре 60°С выпаривают в токе азота до объема 1,5—2 мл. Остаток выливают в градуированную пробирку (центрифужную). Колбу ополаскивают 1—2 мл петролейного эфира, который сливают в центрифужную пробирку, и объем жидкости в пробирке доводят петролейным эфиром до 5 мл. Для осаждения витаминов А и каротиноидов в пробирку к экстракту добавляют 2—3 мл серной кислоты, тщательно перемешивают содержимое в течение 2—3 мин. (встряхиванием), а затем для разделения слоев центрифугируют 5 мин при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость пипеткой переносят в другую центрифужную пробирку в количестве 3,0 мл и остаток кислоты в ней нейтрализуют 2-%-м раствором КОМ. Тщательно перемешивают 1—2 мин, затем центрифугируют 5 мин. 3 мл надосадочной жидкости выпаривают на водяной бане при температуре 60°С в токе азота и осадок растворяют в 1 мл бензола, а затем добавляют 2,0 мл железо-дипиридилового реактива. Выдерживают 20 минут в темном месте и колориметрируют при длине волны 490 нм, в кювете с рабочим расстоянием 5 мм против контроля. Контролем служит бензол + железодипиридиловый реактив.

Расчет ведут по формуле:

а • у • в

Е =----,    где

м

Е — концентрация витамина в мг%;

а — количество витамина Е по калибровочной кривой;

у — объем раствора в кювете;

в — степень разведения (3);

м — количество печени (г).

Построение калибровочной кривой:

10 мг (чистого 96%-го а -токоферола) растворяют и колбе на 10 мл бензолом (20 мг%-й — основной раствор);

2,5 мл основного раствора растворяют в колбе иа 25 мл (2 мг%-й р-р);

к 5 мл (2 мг%-го р-ра) добавляют 5 мл бензола (1 мг%-й р-р);

к 5 мл (1 мг%-го р-ра) добавляют 5 мл бензола (0,5 мг%-й р-р);

к 5 мл (0,5 мг%-го р-ра) добавляют 5 мл бензола (0,25 мг%-й р-р);