МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА СССР

Главное управление ветеринарии

ВСЕСОЮЗНАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ИМЕНИ В. И. ЛЕНИНА

Отделение ветеринарии

Методические указания по применению унифицированных биохимических методов исследований крови, мочи и молока в ветеринарных лабораториях

Москва — 1981

Министерство сельокого хозяйства \ллиг Главное управление ветеринарии

Всесоюзная академия сельскохозяйственных наук имени В.И.Ленина

Отделение ветеринария

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ УНИФИЦИРОВАНА ШОХШИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИИ КРОВИ, МОЧИ И МОЛОКА В ВЕТЕРИНАР!:.IX ЛАБОРАТОРИЯХ

Утверждаю:

Академик-оекрвтарь Отделения ветеринарии ВАСХНИЛ

академик

В. II. Шишков 29 июня 1981 г.

Москв'⁴ - 1981

4.7.3. Если в сыворотке крови содержится более 10% белка, то ее разводят физиологическим раствором в соотношении 1:1, результат умножают на 2.

4.6. Ошибка метода

Ошибка метода составляет +2,0%.

4.9.    Время необходимое для проведения исследования

В день один исследователь проводит 100 анализов.

4.10.    Источники литературы

4.I0.I. 'Veishselbaim Т* Am.S.Clih.Path.l946, W, 49, 1946,

16, 40.

4.10.2. Deutsches Ar^neibuch, 7 Auegabe, Diagnoetiechea Laborahoriuma eebboden, Berlin, 19^8.

5. ОПРЕЩЕШИЕ БЕЛКОВЫХ ФРАКЦИЙ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ нашомвгричЕСШ методом

5.1.    Принцип метода

Отдельные фракции белка способны осаждаться фосфатными растворами определенной концентрации.

5.2.    Реактивы

5.2. Х. Основной фосфатный раствор : 33,5 г едкого натра растворя

ют в 400 мл дистиллированной воды, добавляют 226,6 г фосфорнокислого калия однозвмещенного. После растворения охлаждают до комнатной температуры и добавляют дистилли-рованную веду до объема 500 мл.

5.2.2.    Рабочие фосфатные растворы. Из основного раствора берут в мерные колбы на 100 мл: 92,4 мл (fc I), 74,9 ил (# 2), 58,8 мл (КЗ), 48,7 мл ( № 4) и доводят дистиллированной водой до метки, тщательно размешивают путем встряхивания При хранении добавляют по I капле хлороформа на 100 мл раствора.

5.3. Количество необходимых реактивов на 100 анализов

5.3.1.    Натр едкий, хч - 100 г.

6.3.2.    Калий фосфорнокислый односвещенный, хч, чда - ош г.

5.3.3.    Хлороформ для наркооа - 10 мд.

5.4.    Спегг’яльноа оборудование и аппаратура

5.4.1.    Фотоэлохтроколоримвтр.

5.4.2.    Химические пробирки.

5.4.3* Пипетки на I, 2, 5, 10 мл.

5.4.4.    Бюретка на IC0 ил.

5.4.5.    Мерные колбы на 100 и 500 ил.

5.4.6.    Холодильник бытовой.

5.4.7.    Пробирки химические.

5.5.    Материал для исследования

Материалом для исследования служит сыворотка крови (пп.

2.I., 2.2., 2.3., 2.4.).

5.6.    Ход определения

5.6.1.    Устанавливают в штативе 6 пробирок на каждую пробу, обозначив их цифрами 0, I, 2, 3, 4, 5.

5.6.2.    В пробирку # 0 вносят 10 мл дистиллированной воды, в пробирки I, 2, 3, 4 - по 5 мл соответствующих рабочих фосфатных растворов.

5.6.3.    В пробирку № 5 вносят 0,5 мл сыворотки крови, 0,75 ил дистиллированной воды и 3,75 ил основного фосфатного раствора, закрывают пробкой и перемешивают путем перевёртывания вс 5-6 раз, пос..е чего переносят по 0,5 ил смеси в пробирки №№ I, 2, 3, 4 и I мл в пробирку $ 0.

5.6.4.    Содержимое пробив эк тщательно, но осторожно перемешивают, избегая образования пузырьков воздуха и через 15 мин определяют оптическую плотность (011) растворов в пробирках I, 2, 3, 4 против контрол.. (Ж» на ФЭКо при красном светофильтре в кювете шириной I см. Измерения оптической п/ютности проводят в обратной последовательности, сначала в пробирке № 4, а затем в пробирках Ш С, 2 и I.

6.7.    Расчеты результатов

6.7.1. Расчет производится по схеме:

ОП пробирки №1 - ОП пробирки №2 = Ш альбуминов,

ОП пробирки №2 - ОП пробирки №3 * ОП «с-глобулинов,

ОП пробирки !£3 - ОП пробирки М * ОП ^-глобулинов,

ОП пробирки М = ОП /-глобулинов.

Принимая сумму 0Г1 альбуминов и всех глобулиновых фракций за 100%, вычисляют содержание каждой фракции в относительных процентах.

Зная концентрации общего белка можно произвести перерасчет в абсолютные величины.

5.7.2. Пример расчета:

ОП пробирки №1 =0,800; ОП пробирки )f>2 * 0,400;

ОП пробирки #3 =0,300; ОП пробирки М » 0,200; тогда ОП альбуминов = 0,800 - 0,400 = 0,400;

One*-глобулинов « 0,400 - 0,300 = 0,100;

ОПр>-глобулинов = 0,300 - 0,200 =* 0,100;

ОП/-глобулинов » 0,200;

0,400x100

относительный % альбуминов ---------*    50%;

0,800

0,100x100

об-глобулинов ------- 12,5% ;

0,800

0,100x100

/3 -глобулинов ---------я 12,5% ;

^J    0,800

0,200x100

>-глобулинов --------* 25%.

^а    0,800

б>8, Ошибка четолс

Сшибка метода составляет +4%.

5.9.Время необходимое я.~я. проведения исследования

Время на одно исследование 20-23 мин. При серийных исследованиях в день один лаборант проводит 30 анализов.

5ДО. Физиологические пределы

5.10.1. Определение белковых фракций позволяет провести ди({фе-ронцнацию отдельных видов run о- и гиперпротоинемии, а также выявить профиль белковых фракций оыворотки крови при ряде заболеваний и состояний, не сопрооо^аающихся изменениями общего содержания белка.

5.10.2.    Снижение альбуминов наблюдается при острых воспалительных процессах, поздних стадиях пневмонии, нефрозах и нефритах, токсикозах беременности, злокачественных новообразованиях кроветворного и люфатического аппарата, при гепатитах, циррозах печени.

5.10.3.    Ум льшение альбуминов при одновременном увеличении

jb- глобулинов и у — глобулинов отмечается при гепатитах. Для цирроза характерно снижение альбуминов и резкое увеличение глобулинов. Изменение белковых фракций обусловливают диспроте..немию, выражением которой является белковый коэффициент (отношение между количеством альбуминов и суммой глобулинов). В норме оно составляет 0,9 - 1,4.

5.II. Источники литературы

5.11.1.    Вургафт К.И. Из практики применения экспресс-метода определения белковых фракций сыворотки крови.- Лаб. дело, 1973, * 12, с. 751-752.

6.11.2.    Карпюк С.А. Определение белковых фракций сыворотки крови экспресс-методом.-Лаб. дело, IS62, № 7, с. 33-36.

6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЧЕВИНЫ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ С ДИАЦЕТИЛМ0Н00КСИМ0М

6.1.    Принцип метода

Мочевина образует с диацет^шонооксимом в присутствии тиосемикарбазида и ионов железа окрашенное соединение, интенсивность ojq юки которого пропорциональна концентрации мочевины в сыворотке крови.

6.2.    Реактивы

Используется набор реактивов для определения содержания мочевины в сыворотке шови фирмы "Лахема" ЧССР на 150 анализов.

6.2,1. Основной раствор реагента. Имеющуюся в наборе таблетку, содержащую диацетилмонооксим, тиосемикарбазид и соль железа растворяют в 30 мл дистиллированной воды при умеренном нагревании в мерной колбе емкостью 50 ш и после охлаждения доводят дистиллированной ведой до метки. Наличие небольшого осадка не мешает определению. Устойчив в

течение нескольких недель при коынатнсй температуре.

6.2.2.    Раствор серной кислоты. В мерную колбу на 250 мл при перемешивании вносят примерно 150 мл дистиллированной воды и 25 мл 96^-ной серной кислоты (хч или чда). После Охлаждения доводят до метки дистиллированной водой. Устойчив неограниченное время.

6.2.3.    Рабочий раствор реагента. Смешивают растворы основного реагента и серной кислоты в соотношении 1:1. Готовится в день проведения анализов.

6.2.4.    55&-НКЙ раствор ТХУ.

6.2.5.    Стандартный раствор мочевины 25 мг$

6.3. Специальное оборудование и аппаратура

6.3.1.    Фотоэлектроколориметр.

6.3.2.    Водяная баня.

6.3.3.    Пипетки на 0,1, 1,0 и 2,0 мл.

6.3.4.    Мерные колбы на 50 и 250 мл.

6.3.5.    Стеклянные палочки,

6.3.6.    Алюыиновая фольга.

6.3.7.    Пробирки хиыич0С..кв.

6.4.    Материал для исследования

Ултериалом для исследования служит сыворотка крови (пп.

2.1,2.2.,2.3.,2.4.).

5.5.    Ход определения

6.5.1.    Для осаждения белка к I мл 5$6-ного раствора ТХУ прибавляют 0,1 мл сыькротки крози, перемешивают стеклянной палочкой и центрифугируют 15-20 мин при 2000-3000 об/мин.

6.5.2.    К 0,2 мл и ад осадочной жидкости приливают 2 ил рабочего раствора рсагентг и перемешивают.

6.5.3.    Пробирки закрывают резгновыми пробками, обернутыми алю-кипезой фольгой и нагревают на ккпящей водяной бане i0 кин (точно).

6.5.4.    Охлаждают в струе водопроводной веды в течение 2-3 мин и измеряют оптическую плотность на ФЗКе против контроля (2 мл рабочего раствора реагента и 0,1 мл 5£-ного раствора ТХУ), обработанного аналогичным образом. Измерение проводят в кювете, толщиной слоя 0,3 см при длине волны 525 им (светофильтр #6) нэ позднее, чем через 15 мин после охлаждени/... Окраска неустойчива.

6.5.5. Одновременно с серией проб (оптимальное количество 20 ) в 3-4 экземплярах обрабатывают стандартный раствор мочевины (25 MtfO как и сыве^отку кровч.

6.6.    Расчеты результатов

По полученным величинам оптической плотности пробы (А) и средних показателей по 3-4 измерениям стандарта (Б) рассчитывают концентрацию мочевины в пробе по фоомуле:

С мгf - -g- х 25

6.7.    Ошибка метода

Оаибиа метода составляет +4%.

6.8.    Количество определений в день

В течение рабочего дня один исследователь проводит 100 анализов.

6.9.    Физиологические пределы

6.9.1.    Содержание мочевины в сыворотке крови здоровых животных представлено в таблице 2.

6.9.2.    Повышение мочевины в сыворотке крови наблюдается при белкевдм перекорме, при дефиците легкопереварим^х углеводов в рационе, при скармливании большого количества карбамида, при заболевании печени и почек.

6.9.3.    Снижение уровня мочевины в сыворотке крови свидетельствует о недостатке протеина в рационе.

6.10.    Источники литературы

6.10.1.    Инструкция к набору "Биотест мочевина" ЧССР.

6.10.2.    Методические указания по применению унифицированных клинических лабораторных методов исследований. М.,1973, 66-69.

7. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРЕДО В БЕЗБШОВОМ ФИЛЬТРАТЕ КРОВИ ПО ЦВЕТНОЙ РЕАКЦП С ОРТО-ТШИДИНОМ

7.1. Принцип метода

Глюкоза при нагревании с орто-тануидином в растворе уксусной кислоты образует соединение, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации глюкозы.

7.2.    Реактивы

7.2*I. Орто-толуидин (ч)-желтого цвета, обязательно подлежит перегонке в колбе-реторте при 200°С (на песочной бале). Свежеприготовленный орто-толуидин должен быть бесцветным или слабо-желтого цвета. Экстинция при 590-655 нм против воды не должна превышать 0,02. Реактив стоек при хранении б посуде из тгмного стекла, без доступа воздуха.

7.2.2.    Ледяная уксусная кислота, хч.

7.2.3.    20$-ный раствор трихлоруксусной кислоты. Берут 20 г ТХУ и добавляют 80 мл дистиллированной веды.

7.2.4.    Тиомочевина,

7.2.5.    0,2£-ИЫЙ раствор бензойной кислоты. 0,2 г кристаллической бензойной кислоты растзоряют в 99,8 мл дистиллированной воды. Для более быстрого растворения нагревают на водяной бане.

7.2.6.    Орто-гслундинозый реактив. 3 ^4 мл ледяной уксусной кислоты растворяют 0,15 г тиомочевины и добавляют 6 мл орто-толукдина. Реактив стоек при хранении в холодильнике.

7.2.7.    Стаодарткнй раст. ор глюкозы. 50 мг глюкозы, высушенной в

сушильном шкафу до постоянного веса при температуре +100° С, растворяя? в 100 мл 0,2&-ного раствора бензойной кислоты.

7.3. Количество нообхсли;гах реактивов на 100 анализов_

7.3.1.    Орто-толуидин, ч - 30 мл.

7.3.2.    Ледяная уксусная кислота, хч - 470 мл.

7.3.3.    Трихлоруксусна”. кислота, ода - 100 г.

7.3.4.    Тисмочовина, ода - I г,

7.3.5.    Гл -коза, ч - 0,1 г.

7.3.6.    Бензойная кислота, ода - 0,2 г.

7,4. Специальное оборудование и аппаратура

7.4.1.    ФЭК-56 или др.

7.4.2.    Сушильный шкаф*

7.4.3.    Колба-реторта.

7,4Л. Песочная баня.

7.4.5, Кслбы мерные на 100 мл.

7.4.0. Лабораторный автотрансформатор.

7.4.7.    Центрифуга.

7.4.8.    Бодрая балл.

7.4.9.    Пробирки химические.

7.4.10. Пробирки центрифужные.

7.4.IX. Термометр лабораторный на 150°С.

7.4.12.    Штативы для пробирок.

7.4.13.    Холодильник бытовой.

7.4.14.    Термос на 3-5 л.

7.5.    Материал для исследования

Материалом служит без белковый фильтрат }фОви полученный путем смешивания и последующего центрифугирования равных объемов 20%-ного раствора трихлоруксусной кислоты и цельной кпови.

7.6.    Ход определения

7.6. Х. В пробирку вносят 0,2 мл безбелкового фильтрата крови,

0,3 мл дистиллированной воды и 4,5 мл орто-толуцдинового реактива.

7.6.2.    Пробирку помещают в кипящую водяную баню на 8 минут, после чего охлаждают до комнатной температуры под водопроводной водой.

7.6.3.    Фотометрируют против контроля при длине волны 590-655 нм, в кювете толщиной 10 мм.

7.6.4.    В контрольную пробирку вносят 0,1 мл 20^-ного раствора трихлоруксусной кислоты и 0,4 мл дистиллированной воды и 4,о мл орто-толуидинового раствора .

7.6.5.    Стандартная проба. Стандартные пробы став«т как опытные, но вместо безбелкового фильтрата берут 0,1 мл глюкозы с концентрацией 50 мг£, 0,1 мл 20^-ного раствора ТХУ, 0,3 мл дистиллированной воды и 4,5 мл орто-тслуидинового реактива.

7.7.    Расчеты результатов провопят по формуле:

^соп" ^Сст •    W

ст

Cqjj - концентрация глюкозы в .фобе, uv/%;

С_ст - концентрация г юкоэы в стандарте, uv/%;

Е_оп - оптическая плотность пробы;

Е_ст - оптическая плотность стандарта.

7.8.    Ошибка метода составляет +2.5?S.

.У.9^Л(од.\шес-гао..оппеаелр>1ий в день

В течение рабочего дня один исследователь

производит 100 определений.

7.10.    Физиологические пределы..

7.10Л. Содержание глюкозы в крови животных представлено в

таблице 2.

7.10.2.    Снижение глюкозы в крови (гипогликемия) бывает при недостаточности микроэлементов в организме, легкоусвояемых углеводов в рационе, при кетозе, остеодистрофии, ацидозе, гипокинезии.

7.10.3,    Повышение глюкозы в крови (гипергликемия) наблюдается при поражении эндокринной системы, недостаточной продукции инсулина, скармливании больших количеств свеклы, патоки, при сильном возбуждении животного.

7.11.    Источники литературы

7.11.1.    Zooder К* Glia. Chim. icta, 9, I9&3, 351.

7.11.2.    Масленников В.Д., Михеева А.И. Лабораторное дело,1970,

10, 588.

8. ОПРЕдаШНЖ ГЛШОЗЫ В БЕЭБШОВОМ ФИЛЬТРАТЕ КРОВИ

по методу сокода

ЗЛ. Принцип метода

Метод основан На окислении глюкозы в щелочной среде при кипячении с сернокислой медью. При йодометрическом определении сЗразовившаяся закись меди окисляется йодом. Последний освобождается подкислением определенного количества йодноватокислого калия и йодистого калия, а оставшийся свободный йод оттитровываотся гипосульфитом.

8.2.    Рэактитзы

8.2Л. Г$-иый раствор сернокислого цинка. Берут 5 г сернокислого цинка,7-водного и растворяют в 95 мл дистиллированной

воды.

8.2.2.    0,3 н раствор едкого натра. Берут 12 г едкого натра (яда) хч) и растворяют в 700 ыл дистиллированной воды, охлаждают и водой доводят раствор в мерной колбе до I л. Растворы 9.2.1. и 6.2.2. должны нейтрализовать друг друга объем в объем. Последнее проверяется медленным титрованием о индикатором фенолфталеином.

8.2.3.    Реактив Соисдаи.

а)    медь сернокислая* б-водная* чда, хч - 8 г;

б)    натрий углекислый безводный, чд&» хч - 30 г;

в)    калий-натрий виннокислый, 1-водный,'ща - 30 г;

г)    калий йодистый, чда* хч - 5 г;

д)    натрий сернокислый безводный, чца» хч - 180 г;

е)    натр едкий, хч,1 н раствор - 40 мл;

ж)    калий иодноватистокислый X н раствор, чда, хч - 5 мл. Углекислый натрий и сегнетову соль растворяют ь 200 мл горячей воды, добавляют раствор едкого натрия, перемешивают , после чего раствор кипятят для удаления COg. Сернокислый натрий растворяют в 500 мл горячей воды и нагревают до кипения. Оба раствора смешивают и добавляют йодистый калий, предварительно растворенный в малом количестве воды. Затем вливают раствор йодноватист®о калия и после охлаждения доливают водой в мерной колба до

I л. Через несколько дней раствор фильтруют. Реактив рекомендуется держать пои комнатной техшератуюе, не подвергая его действию солнечного света. Если температура ниже 20°С и выпадают кристаллы сернокислого натрия, то перед употреблением реактив необходимо немного подогреть и растворить осадок.

8.2.4.    2 н раствор серной кислоты. Берут 56 мл концентрированной серной кислоты (уд.вес - 1,84) и доводят объемом водой в мерной колбе до I л.

8.2.5.    0,005 н раствор натрия сернсватокислого 5-аодного,чда, (готовится перед анализом из 0,1 н раствора, приготовленного из фикс знала),

8.2.6.    1%-ный раствор крахмала, приготовленный в насыщенном растворе хлористого натрия.

8.2.7.    Насыщенный раствор хлористого натрия.

8.2.8.    1%-ныЙ спиртовый раствор фенолфталеина,

8.2.9.    Спирт этиловый.

8.2.10. Натрий фтористый.

6.3. Количество необходимых реактивов на ТОО анализов

8.3.1.    Цинк сернокислый , 7-водный, чда - 20 г.

8.3.2.    Натр едкий - 20 г.

8.3.3.    Спирт этиловый - 100 мл.

Методичеокяе указания подготовлены Всесоюзным научно-исследовательским институтом незаразных болезней животных (В.Т.Самохин, П.Е.Петров), Отделением ветеринария ВАСХНИЛ (И.М Беляков), Московской ветеринарной академией (И.П.Кояд-рахия ), Рязанским сельскохозяйственным институтом (П.Т.Лебедев), .осесоюзным научно-иоследовательским институтом физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных (В.П.Рад-ченков) и Центральной ветеринарной лабораторией МСХ СССР (В.Я.Антонов).

Методические указания одобрены секцией "Патология, терапия и профилактика незаразных болезней животных” Отделения ветеринарии ВАСХНИЛ 20 октября 1977 г.. Научно-техническим ооветом МСХ СССР 28 июня 1979 г., утверждены Главным управлением ветеринарии МСХ Г'ССР 3 апреля 1981 г.

С ветственный за зыпуок - доцент И.М.Беляков (Отделение ветеринарии ВАСХНИЛ).

Методические указания предназначены для республиканских и облаетши ветеринарных лабораторий.

Всесоюзная вкадвмяя сельскохозяйственных наук жмени В.И.Ленина

8.3.4.    Серная кислота, хч, концентриропааная (уд.вес 1,84)-56 мл.

8.3.5.    Крахмал растворимый - I г.

8.3.6.    Натрий хлористый - 100 г.

8.3.7.    Фенолфталеин - I г.

8.3.8.    Медь сернокислая, 5-водная, чда, хч - 4 г.

8.3.9.    Натрий углекислый безводный, чда, хч - 15 г.

8.3.10. Калий-натрий виннокислый, 4-водный,чца - 15 г.

8.3.11. Калий йодистый, чда, хч - 2,5 г.

8.3.12. Натрий сернс.сислый безводный, цца,хч - 90 г.

8.3.13. Калий йодноватокислый фиксанал 0,1 н - I шт.

8.3.14. Натрий фтористый -5г.

8.3.15. Натрий сорноватокислый, 5-водныЙ (    ■    б    М    \

натрий тиосульфат,гипосульфит , чда, фиксанал - I шт.

8.4. Специальное оборудование и алг~ратура

8.4.1.    Сахарные пробирки 2,0-2,5x15 см.

8.4.2.    Водяная баня.

8.4.3.    Ыикробюретка на 5 мл.

8.4.4.    Мерные колбы на 1000 мл.

8.4.5.    Колбы из термостойкого стекла на 500 и 1000 мл.

8.4.6.    Холодильник бы.овой

8.4.7.    Термос на 3-5 л.

8.4.8.    Центрифуга.

8.4.9.    Штативы для пробирок.

8.4.10. Пробирки химические.

g.5. Материалы для исследования

8.5.1.    Материалом служит стабилизированная фтористым натрием кровь.

8.5.2.    Осшедение белков. Одна часть крови гемодизируется в пяти частях воды и смешивается с двумя частями 0,3 н раствора едкого натра_тдвумя частями 5^-ного раствора сорнокислого цинка. Тщательно перемешивают и через 30 гян центрифугирует при 1500 сб/ыин в течение 10 мин. Фильтрат сливают в другу» пробирку. Изменяя соотнесение воды и крови можно подучить беэбелковый фильтрат меньшей концентрации.

8.5.3.    При хранении крови концентрация глюкозы снижается, поэтому осаждение белка необходимо производить сразу после взятия крови или же после стабилизации фтористым натрием.

I. ВВЕДЕНИЕ

1.1.    В настоящих методических указаниях представлены унифицированные методы биохимических исследований крови, мочи и молока для использования в ветеринарных лабораториях.

1.2.    Использование унифицированных методов обеспечивает стандартизацию проводимых исследований в ветеринарных лабораториях и получение сравнимых результатов.

1.3.    Сроки проведения плановых исследований и количьотво анализируемых проб крови, мочи и молока по контролю за состоянием обмена веществ у животных на комплексах и в крупных специализированных хозяйствах регламентируют ветеринарные лаборатории.

1.4.    Ветеринарные специалисты комплексов и специализированных хозяйств в соответствии с планом-графиком, утвержденным директором ветеринарной лаборатории, проводят клиническое обследование животных, подбирают группы и организуют отбор проб для биохимических исследований.

2. ОТБОР А ГЗДГСГГОВКА ПРОБ КРОВ'Л

2.1.    Пробирки для отбора проб крсви ветеринарные специалисты хозяйств получают в ветеринарией лаборатории: на калщее животное по 2 биологических пробирки (М I и № 2, объемом не менее 2С мл) и по 2 центрифужных (!» 3 и № 4, объемом II-I2 мл).

2.1.1.    В пробирку £ I для получения цельной крсви и плазмы сотрудники ветеринарной лаборатории предварительно вносят по 2-3 капли 1%-нсго раствора гепарина на каждые 15-20 ил крови.

2.1.2.    В случаях, когда содержание натрия в плазме крови не определяется, вместо Апарина можно использовать лимоннокислый чли щавелевокислый натрий по 15-20 мг на каждые 15-20 мл кро*,и.

2.1.3.    Пробирка № 2 остается сухой для получения сыворотки.

2Л.4. В одну из центрифужных пробирок (jf 3) вносят 0,5 мл вазелинового масла и каплю 1%-нсго раствора гепарина, в другую 0* 4 -градуированную) - 5 мл 20&-ного раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ)

2.Х.5. Все пробирки закрываются резиновыми пробками. Пробирки 4 помещаются в термос сс ль_г jh.

2.2.    Пробы крови берут у животных перед кормлением или через 5-6 часов после кормления.

2.3.    Кровь набирают в пробирки № 2 и № 3 по стенке t > избежании гемолиза.

2.3.1.    Кровь в пробирках» I и » 3 осторожно перемешивают путем 3-кратного перевёртывания пробирок.

2.3.2.    В градуированную пробирку Нс раствором ТХУ приливают из пробирки №> I 5 мл крови (до отметки ХО мл) и тщательно перемешивают стеклянной палочкой.

2.3.3.    Пробирки W I, 3 и 4 ставят в термос со льдом, пробирку » 2 транспортируют летом обычным путём, а зимой - предохраняют от замерзания.

2.4.    В лаборатории кровь в пробирке » 2 обводят тонкой спицей из нержавеющей стали диаметром 1,0-1,5 мм и ставят в термостат при

емпературе 37--38^сС для окончательного отделения сыворотки.

2.4.1.    Отделившуюся сыворотку сливают в центрифужные пробирки и центрифугируют 20-30 мин при 2000-3000 <~б/мин.

2.4.2.    В сыворотке крови определяют содержание общего белка, белковых фракций, мочевины, общих липидов, общего холестерина, общего кальция, йсда неорганического, связанного г. белками (СБЙ) и активность щелочной фосфатазы.

2.5.    Для получения плазмы кровь в пробирках с антикоогулянгом (№1) осторожно перемешивают, наливают в центрифужные пробирки и центрифугируют 20-30 мин при 2000-3000 об/мин. Плазму переносят в другие пробирки и хранят в холодильнике.

2.5.1.    В плаэ/'в крови определяют содержание натрия, калия, каротина, витаминов Л и С.

2.6.    1 цельной крови кэ про-бирки » I определяют гематокрит, кетоновые тела, медь, цинк, кобальт, марганец.

2.7.    Кровь в пробирке » 3 с вазелиновым маслом центрифугируют 20-30 мин при 20СЭ-30СС об/мин. В плазме определяют содержание С0^ (щелочной резерв).

2.8.    Смесь крови и ТХУ в пробирке № 4 центрифугируют в течение 20-30 мин при 2000-3000 об/мин. Верхний слей (беэбелковый фильтрат) сливают в другую пробирку и в ней определяют глюкозу, неорганиче :кмй фосфор и неорганический магний. Бозбелковый фильтрат крови хранят в холодильнике не более 5 дней.

3. 0]1?даШБ ОБЩЕГО БЕЛКА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ

гатт:шгрттт методов

3.1,    _f 11рк}мрт метода

С сдержан ие белка определяют по рефракции сыворотки крови.

3.2.    Реактивы

3.2 Д. Смесь этилового спирта с серным эфиром 1:1.

3.2.2.    Дистиллированная вода.

3.3.    Количество необходимых реактивов на IQQ анализов

3.3.1.    Спк/f этиловый 96%-ный - 50 мл.

3.3.2.    Эфир серный (для наркоза)- 50 мл.

3.4.    Специальное оборудование и аппаратура

3.4.1.    Рефрактометр -ила RL (ПНР) рДОГ, ИРФ - 454, УРЛ и др.

3.4.2.    Холодильник бытовой, поддерживающий температуру 4-6°С.

3.4.3.    Термометр на 50°С.

3.4.4.    Термостат, поддерживающий температуру 38±1°С.

3.4.5.    Стеклянная палочка.

3.4.6.    Марлевые салфетки.

3.4.7.    Вата.

3.4.8.    Стаканчики.

3.4.9.    Пробирки биологические.

3.4.10. Пробирки центрифужные.

3.4.11. Центрифуга.

3.5.    Материал .для исследования

Материалом для исследования служит сыворотка крови (пп.2.1.

2.2., 2.3., 2.4.).

3.6.    Ход определения

3.6.1.    Стеклянной палочкой на призму рефрактометра наносят каплю дистиллированной воды и закрывают камеру.

3.6.2.    Проводят подготовку прибор., к работе: регулировочным винтом устанавливают шкалу рефрактометра на отметку 1.3330.

3.6.3.    Удаляют воду с призмы марлевой салфеткой и протирают ватой, смоченной смесью этилового спирта с серным эфиром,

3.6.4.    Наносят каплю сыворотки крови на призму стеклянной палочкой, закрывают камеру и 2 раза производят отсчёт. Вычисляют среднее показание.

3.6.5.    Марлевой салфеткой удаляют с призмы рефрактометра сыворотку, протирают ватой, смоченной спиртово-эфирной смесью и исследует следуш^а пробу. Стеклянную палочку промывают в дистиллированной эоде _и обсушивают марлей.

3.7. Расчёты результатов

3.7.1.    Содержание белка в исследуемых пробах (в %) определяют по таблице I.

3.7.2.    Если температура в камере во время отсчета не соответствует 20°С, тс вводят поправку 0,0001 на кодый градус: в случае низкой температуры поправку вычитают, при более высокой - прибавляют.

3.8- Ошибка метода

При хранении сыворотки в холодильнике в течение 3-4 дней ошибка метода не превышает +1%.

3.9.    Время.необходимое для проведение исследования

На одно исследование згграчивается 1-2 мин. Среднее количество исследований в день составляет 150 проб.

3.10.    Физиологические пределы

ЗЛО Л. Содержание общего белка в сыворотке крови здоровых животных представлено в таблице 2 (стр. 83).

3.10.2.    Содехлкание белка в сыворотке крови здоровых животных стабильно. Отклонения уровня белке, от нормы свидетельствуют о глубоких нарушениях обмена веществ з организме животных.

3.10.3.    Снижение содержания белка в сыворотке крови (гипопро-теинемия) характеризует длительный недокорм, белковое голодание, плохое усвоение протеина из кормов вследствие хронических расстройств желудочно-кишечного тракта, заболеваний печени, дефицита углеводов, макро-у микроэлементов и витаминов в рационе.

3.10.4.    Поведение уровня белка в сыворотке крови (гмперпротеи-немия) наблюдают при высококонцечтратиом типе кормления, заболеваниях'нс ie«H (гепатиты, дистрофия), желудочно-кишечного тракта.

ЗЛЬ Источники литературы

3.II..T. Лабораторные исследования в ветеринарии.

Кэд-оо " Колос", М., 1971, 420-423.

3.11,2. Филиппович П.Б., Егорова Т.Л., Севастьянова Г.А.

Практикум по    биохимии.    Над-в о "Просвещение",

1975, 307.

Таблица I Содержание белка в сыворотка крови в зависимости от коэффициента рефракции

Показания рефракто метра	§2 О К	I Показания ! рефракто-! метра	1 fir	f Показания ! рефракто-! метра	£ Белок j (%)
1.3450	5.25	1.3480	7.00	I.35I0	8.74
I.345I	5.31	I.348I	7,05	I.35II	3.80
1.3452	5.37	1.3482	7.II	1.35X2	8.86
1.3453	5.43	1.3483	7.17	1.35X3	8.91
1.3454	5.48	1.3484	7.23	I.35I4	8.97
1.3455	5.54	1.3485	7.29	Х.35Х5	9.03
Г.3456	5.60	1.3485	7.34	1.35X6	9.09
1.3457	5.66	1.3487	7.40	I.35I7	9.16
1.3458	5.72	1.3488	7.46	I.35I8	9.20
1.3459	5.77	1.3489	7.52	I.35I9	9.26
Х.3460	5.83	1.3490	7.58	1.3520	9.32
I.346I	5.89	I.349I	7.63	I.352I	9.38
1.3462	5.95	1.3492	7.69	1.3522	9.44
1.3463	6.ОХ	1.3493	7.75	1.3523	9.50
1.3464	6.07	1.3494	7.81	1.3524	9.55
1.3465	6Л2	1.3495	7.87	1.3525	9.61
1.3466	6.18	1.3496	7.93	1.3526	Э.67
1.3467	6.24	1.3497	7.98	1.3527	9.73
£.3468	6.30	1.3498	8.04	1.3528	9.79
1.3469	6.36	1.3499	8.10	1.3529	9.84
1.3470	6.41	Т.3500	8. Тб	1.3530	9.90
£.3471	6.47	I.3501	8.22	I.353I	9.96
£.3472	6.53	1.3502	8.27	1.3532	10.02
£.3473	6.59	1.3503	8.33	1.3533	10.08
£.3474	6.65	1.3504	8.39	1.3534	10 ДЗ
£.3475	6.70	1.3505	8.46	1.3535	Х0.19
£.3476	6.76	1.3506	8.51	1.3536	10.25
£.3477	6.82	1.3507	8.57	1.3537	10.33
£.3478	6.88	1.3508	8.62	1.3538	J0.37
£.3479	6.94	1.3509	8.68	Х.3539	10.43

4. ОПРдаГЕШЕ ОБЩЕГО BEJT1A. В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ПО БИУРЬТОВОЙ РЕАКЦИИ

4.1» Принцип метода

Белки реагируют в щелочной среде с сернокислой медью с образованием соединений фиолетового цвета.

4.2.    Реактивы

4.21. Биуретовый реактив основной. 4,5 г калия-натрия виннокислого, 4-водного растворяют в 40 мл 0,2 н раствора едкого натра. После растворения прибавляют 1,5 г сернокислой 5-водной ме^и и 0,5 г йодистого калия. Перемешивают до полного растворения и доводят до 100 мл в мерной колбе 0,2 н раствором елсого натра. Хранят в посуде из темного стекла. Реактив стоек.

4.2.2.    0,2 н раствор едкого натра. 8 г вещества вносят в мерную колбу на I л и приливают до метки дистиллированной воды.

4.2.3.    0,5-ный раствор йодистого калия в 0,2 н растворе едкого натра. 2,5 г йодистого калия вносят в мерную колбу на 500 мл и доливают до метки 0,2 н раствором едкого натра. Хранят в посуде из темного стекла но более 2-х недель.

4.2.4.    Рабочий раствор биуретового реактива. Смешивают I часть основного биуретового реактива (п.4.2.1.) с 4-мя частями 0,536-ного раствора йодистого калия (п.4.2.3.). Хранят не более 2-х недель в холодильнике.

4.2.5.    0,9%-ный раствор хлористого натрия. Берут 0,9 г хлористого натрия и растворяют в 91,9 т дистиллированной воды.

4.2.6.    Стандартный раствор альбумина. В пробирку вносят I г криста :лпческого сывороточного (или плацентарного) альбумина

и 9 мл 0,9%-ного раствора хлористого натрия. Тщательно перемешивают. I мл раствора содержит 0,1 г белка. Хранят в холодильнике.

4.3. Количество необходимых реактивов на 100 анализов

4.3.1.    Калий-натрий виннокислый,4-водныЙ, ода - 4,5 г.

4.3.2.    Ыедь сернокислая,5-водная, хч, ода - 1,5 г.

4.3.3.    Калий йодистый, хч, ода - 2,5 г.

4.3.4.    Натр едкий, хч, ода - 4,0 г.

4.3.5.    Альбумин сывороточный или плацентарный - 1,0 г.

4.3.6.    Натрий хлористый - 0,9 г.

4.4. Специальное оборудование и аппаратура

4.4Л. Фотоэлектроколориметр.

4.4.2.    Холодильник бытовой.

4.4.3.    Химические пробирки.

4.4.4.    Пипетки на 0,1* I и 5 мл.

4.4.5.    Мерные колбы на 100, 500 и 1000 мл.

4.4.6.    Миллиметровая бумага.

4.4.7.    Центрифужные пробирки.

4.4.6. Термостат.

4.5.    Материал для исследования

Материалом для исследования служит сыворотка крови (пд.

2.1., 2.2., 2.3., 2.4.).

4.6.    Ход определения

4.6.1.    К 0,1 мл сыворотки крови прибавляют 5 мл рабочего биуре-тового реактива и смешивают избегая образования ш чн*

4.6.2.    Через 30 мин (не позднее чем через час) измеряют оптическую плотность на ФЭКе в кювете с толщиной слоя I см при длине волны 540-560 нм (зеленый светофильтр) против контроля, в котором сыворотку заменяют 0,1 «л 0,9^-ного раствора хлористого натрия.

4.7.    Расчеты результатов

4.7.1. Расчет производится по калибровочному графику.

Сх'ша для построения калибровочного графика

М ! црсб	Стандартный раствор 1 альбумина	! 0,9^-ный раствор ! хлористого натрия 1	j Концентрация балка,
I	0.4 мл	0,6 мл	4
2	0,6 мл	0,4 мл	6
3	0,6 мл	0,2 мл	8
4	1,0 мл	-	10

4.7.2. Из каждого разведения вносят в 3-4 пробирки (не менее)

по 0,1 мл раствор, альбумина и обрабатывают как и сыворотку крови. По полученшл! средним данным из 3-4 измерений строят калибровочную кривую.