ф

MHHHCfIPtTW 1РСГИЦНИ «С8НЩЙ И1ЕГШИ

ЗАРЕГИСТРИРОВАНО

Регистрационный Si

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

(Минсельхоз России)

ПРИКАЗ

от 22 марта 2019 г.    №    126

Москва

Об утверждении Методики производства молекулярногенетического исследования генно-инженерно-модифицированных организмов, используемых для производства кормов и кормовых добавок для животных, а также кормов и кормовых добавок для животных, полученных с применением таких организмов или содержащих такие организмы

В соответствии с пунктом 13 Правил государственной регистрации генно-инженерно-модифицированных организмов, предназначенных для выпуска в окружающую среду, а также продукции, полученной с применением таких организмов или содержащей такие организмы, включая указанную продукцию, ввозимую на территорию Российской Федерации, утвержденных постановлением Правительства Российской Федерации от 23 сентября 2013 г. № 839 (Собрание законодательства Российской Федерации, 2013, №39, ст. 4991; 2014, №25, ст. 3317; 2017, № 28, ст. 4145; 2018, № 6, ст. 896; № 41, ст. 6260), приказываю:

Утвердить прилагаемую Методику производства молекулярногенетического исследования генно-инженерно-модифицированных организмов, используемых для производства кормов и кормовых добавок для животных, а также кормов и кормовых добавок для животных, полученных с применением таких организйЬв или содержащих такие организмы.    11    !    I

Д.Н. Патрушев

УТВЕРЖДЕНА

приказом Минсельхоза России

от 22 марта 2019 г. № 126

МЕТОДИКА производства молекулярно-генетического исследования генно-инженерно-модифицированных организмов, используемых для производства кормов и кормовых добавок для животных, а также кормов и кормовых добавок для животных, полученных с применением таких организмов или содержащих такие организмы

I. Общие положения

1.    Настоящая Методика устанавливает порядок проведения молекулярногенетического исследования генно-инженерно-модифицированных организмов, используемых для производства кормов и кормовых добавок для животных, а также кормов и кормовых добавок для животных, полученных с применением таких организмов или содержащих такие организмы (далее - исследование, ГМО, продукция соответственно).

2.    Исследование проводится организацией (испытательной лабораторией), аккредитованной в национальной системе аккредитации, с областью аккредитации, соответствующей исследованиям, указанным в настоящей Методике.

3.    Результаты исследования ГМО    оформляются    заключением

о результатах исследования, составляемым на основании протоколов испытаний, которое должно содержать:

наименование заключения;

полное наименование и место нахождения организации (испытательной лаборатории), осуществившей проведение исследования;

наименование ГМО с указанием его таксономического статуса;

полное наименование и место нахождения, идентификационный номер налогоплательщика (ИНН) юридического лица, осуществляющего на территории Российской Федерации генно-инженерную деятельность в целях создания ГМО (далее - заявитель ГМО);

полное наименование и место нахождения юридического лица либо фамилия, имя, отчество (при наличии), место жительства индивидуального предпринимателя - изготовителя образцов ГМО;

вид предполагаемого целевого использования ГМО;

	антибиотикоустойчивости (pBR322)
F1 оп	Ориджин репликации плазмид (pBSKSII, pKEN-gfpmut2, pCR2.1 ТОРО)
Транспозон Tn7L	Фрагмент обеспечивает транспозицию рекомбинантных генов из плазмид в геном (pRK415-gfp)
Г ен егшС	Кодирует устойчивость к эритромицину, плазмидные вектора
Ген cat	Кодирует устойчивость к хлорамфениколу, плазмидные вектора
R6K ori	Ориджин репликации плазмид (pVIKl 12)

Таблица № 2. Основные генетические последовательности в геноме ГМО растительного происхождения

ПЦР мишень	ГМ линии сои, кукурузы и рапса, содержащие данный элемент
Промотор p-CaMV35S	GTS 40-3-2, А2704-12, А5547-127, ВТ 176, ВТ11, MON810, GA21, MON88017, NK603, MON863, Т25, Т45
Терминатор t-NOS	GTS 40-3-2, MON863, MON531, MON757, MON1076, MON1445, MON1698, MON15985, ВТ11, GA21, NK603, MON802, 3272, MIR604, MON88017
Промотор p-FMV	MON89788, MON89034, GT73
Промотор p-SSuAra	MSI, RF1, RF2, MS8xRF3
Промотор р-ТА29	MSI, RF1, RF2, MS8xRF3
Промотор p-NOS	MSI, RF1, RF2, Topas 19-2
Терминатор t-E9	MON89788
Терминатор t-35S	ВТ 176, T14, T25, 3272, A2704-12, A5547-127, T45, Topas 19/2
Терминатор t-OCS	MSI, RF1, RF2
Терминатор t-g7	MSI, RF1, RF2, MS8xRF3
Г ен pat	TCI507, 59122 A2704-12, A5547-127, T25, T45,

№ п/п	__ Описание Характеристика характеристики	Критерий	Методы оценки критерия
2	Чувствитель- Наименьшее	Чувствительность	Проводят
	ность ПЦР содержание копий	должна быть не ниже	исследования ряда
	целевой ДНК,	100 копий целевой	десятикратных
	которое может	ДНК, например,	разведений целевой
	быть определено с	плазмидной, в одной	плазмидной ДНК
	использованием	ПЦР реакции	с известной
	данной ПЦР		концентрацией
	методики,		в двух повторах
	в первую очередь.		каждое. Определяют
	зависит от свойств		максимальное
	используемых		разведение, при
	праймеров		котором ДНК
	и зондов		воспроизводимо
			выявляется (в двух
			повторах)

№ п/п	' Характеристика	Описание характеристики	Критерий	Методы оценки критерия
3	Эффективность ПЦР	Характеризует прирост матрицы на каждом цикле амплификации	Эффективность ПЦР должна быть не ниже 90%. Это соответствует значению наклона линейной области зависимости Ct от логарифма концентрации ДНК матрицы (slope): не ниже - 3,6 (приемлем диапазон slope 3,1-3,6)	Для оценки эффективности ПЦР проводят амплификацию с рядом десятикратных разведений целевой плазм идной ДНК (пункт 2 настоящей таблицы) в двух повторах каждое. По результатам амплификации строят график зависимости Ct от логарифма концентрации ДНК 1 матрицы. Определяют наклон линейной области (slope). Эффективность ПЦР оценивают по I уравнению: Е = [10(-1/slope)]-1, в идеальном случае - при удвоении количества ПЦР продукта за один цикл: Е = 100%, (slope = -3, 32)

№	Характеристика	Описание	Критерий	Методы оценки
п/п		характеристики		критерия
5	Предел	Наименьшее	Предел должен быть	Исследуют 10
	количественного	количество	не более 0,1%.	повторов 0,1 % ГМО
	определения	(концентрация)	На пределе	стандарта по ПЦР
	(LOQ,	вещества в	чувствительности	методике.
	quantitation limit)	образце, которое	относительное	Рассчитывают
		может быть	стандартное	среднее значение
		количественно	отклонение (RSD) не	содержания ГМО
		оценено с	должно превышать	в образце и
		использованием	20%.	относительное
		методики	Истинное значение	стандартное
		с требуемой	измеряемой величины	отклонение (RSD).
		правильностью	должно входить в	Сравнивают
		и внутри	полученный при	рассчитанное
		лабораторной	измерениях	стандартное
		прецизионностью	доверительный	отклонение (RSD)
			интервал	с критерием 20%. Также оценивают.
	_			входит ли истинное значение в доверительный интервал полученного среднего значения

! 7 [Линейность Наличие линейной зависимости ! аналитического сигнала в I анализируемой пробе в пределах аналитической области методики. Оценивается как R2 коэффициент корреляции, определяющий верность модели линейной зависимости О от логарифма концентрации калибровочных образцов

R2 коэффициент для Исследуют в двух калибровочных    повторах 0,1 %, образцов должен быть 1,0% и 5% не менее 0,98%    калибровочные ГМО стандарты по ПЦР методике. Строят калибровочную прямую (dCt от lgC), оценивают коэффициент I корреляции данных с линейной j зависимостью (R2) № п/п Характеристика Описание характеристики Критерий Методы оценки критерия 6 Аналитическая Интервал Диапазон 0,1% - 5% Проводят область (dynamic определяемых ГМО исследования range) аналитических экспериментальных образцов с характеристик, в данных, должен различным котором удовлетворять содержанием ГМО. I получаемые линейной модели Оценивают результаты имеют (пункт 7 настоящей линейность приемлемый таблицы) зависимости уровень аналитического правильности и прецизионности, приемлем диапазон 0,1% - 5% сигнала

---

№ п/п	Характеристика	- ■ Описание характеристики	Критерий	Методы оценки критерия
8 ! I 1 и	Правильность	Правильность методики характеризуется отклонением среднего результата определений, выполненных с ее использованием, от значения, принимаемого за истинное	Методика дает корректные результаты, если значения, принимаемые за истинные, лежат внутри доверительных интервалов соответствующих средних результатов анализов, полученных экспериментально по данной методике	Готовят образцы из калибровочных стандартов 0,1 %, 1,0% и 5% с добавлением матриц различного происхождения (для этого смешивают стандарты с другими ингредиентами, сухим молоком, мясным фаршем, рыбной мукой). Исследуют образцы по ПЦР методике в двух повторах. Оценивают, входит ли истинное значение в диапазон погрешности полученного среднего значения для каждого образца

При использовании методики, основанной на ПЦР, исследование включает последовательные процессы: подготовку проб, выделение нуклеиновых кислот из образцов, амплификацию заданных фрагментов нуклеиновых кислот, детекцию продуктов амплификации, анализ и интерпретацию результат.

Таблица № 4. Критерии эффективности методики полногеномного

секвеннрования

Этап анализа	Характеристика	Описание характеристики	Критерий
	Концентрация геномной ДНК		не менее 0,2 нг/мкл
Подготовка библиотеки для секвеннрования	Размер фрагментов ДНК	Распределение фрагментов по длинам, устанавливается электрофоретически (например, на капиллярных анализаторах)	распределение в диапазоне 250-1000 п.н. Максимум распределения 300-500 п.н.
	Распределение качества идентификации нуклеотидов	Q=-101ogl0p, где р - вероятность неправильного определения нуклеотида	Q>20, то есть вероятность ошибки нс более 0,01
	Среднее качество прочтения		Q>25
Проведение массового параллельного секвеннрования	Служебные последовательности	Наличие служебных последовательностей (адаптеров, индексов) в прочтении	должны отсутствовать
	Покрытие чтения	число чтений, содержащих определенный нуклеотид последовательности генома	не менее десятикратного покрытия
	Представленность нуклеотидов в каждом цикле	Максимальное отклонение между А и Т или G и С	не более 20% в любой позиции
	GC-состав на прочтение	Сумма отклонений от ожидаемого распределения	не более 30% прочтений

место депонирования и коллекционный номер (указывается для депонированных штаммов ГМО);

сведения о трансформационном событии в виде кода, сформированного согласно Общероссийскому классификатору трансформационных событий;

регистрационный номер свидетельства о государственной регистрации ГМО, предназначенного (предназначенных) для выпуска в окружающую среду, на основе которого (которых) создан ГМО, в отношении которого проведено исследование (в случае если ГМО создан на основе иного (иных) ГМО), либо указание на то, что ГМО не создан на основе иного (иных) ГМО;

регистрационный номер свидетельства о государственной регистрации ГМО для иного целевого использования (при наличии);

сведения о регистрации ГМО за рубежом (при наличии); оценку полноты документов и данных, представленных заявителем ГМО для исследования;

краткое содержание документов и данных, представленных заявителем ГМО для исследования;

описание образцов ГМО и исходного организма-реципиента, представленных заявителем ГМО для исследования, с указанием их количества, а также оценку их пригодности для проведения исследования;

выводы о результатах исследования: о молекулярно-генетической структуре ГМО, об отсутствии или наличии не заявленных генетических конструкций; об эффективности метода идентификации ГМО, сведения о соответствии генетической модификации природным (естественным) процессам;

фамилии, имена, отчества (при наличии), должности, места работы, ученые степени (при наличии) лиц, проводивших исследование; дату и номер заключения;

подпись руководителя организации (испытательной лаборатории), осуществившей проведение исследования.

4. Результаты исследования продукции оформляются заключением о результатах исследования, составляемым на основании протоколов испытаний, которое должно содержать:

наименование заключения;

полное наименование и местонахождение организации (испытательной лаборатории), осуществившей проведение исследования; наименование продукции;

полное наименование и место нахождения юридического лица, осуществляющего изготовление (поставку) продукции (далее - заявитель продукции);

регистрационный номер свидетельства о государственной регистрации ГМО, с применением которого получена продукция или который она содержит (указывается регистрационный номер свидетельства о государственной регистрации каждого ГМО, содержащегося в продукции или с применением, которого она получена);

специальные условия использования ГМО, с применением которого получена продукция или который она содержит (при наличии);

сведения о регистрации продукции за рубежом (при наличии); компонентный состав продукции, включая информацию о количестве ГМО (доля содержания в %);

оценка полноты представленных на экспертизу документов и данных, представленных заявителем продукции для исследования;

краткое содержание документов и данных, представленных заявителем продукции для исследования;

описание образцов продукции, представленных заявителем продукции для исследования, с указанием их количества, а также оценку их пригодности для проведения исследования;

выводы о наличии или отсутствии заявленного ГМО в образцах продукции; фамилии, имена, отчества (при наличии), должности, места работы, ученые степени (при наличии) лиц, проводивших исследование;

срок действия свидетельства о государственной регистрации продукции, соответствующий сроку действия свидетельства о государственной регистрации ГМО, с применением которого получена продукция или который она содержит. Если продукция получена с применением нескольких ГМО или содержит несколько ГМО, срок действия свидетельства о государственной регистрации продукции должен соответствовать минимальному сроку действия свидетельства о регистрации ГМО, с применением которого продукция получена или который продукция содержит;

дату и номер заключения;

подпись руководителя организации (испытательной лаборатории), осуществившей проведение исследования.

5.    К заключению о результатах исследования ГМО или продукции должны прилагаться протоколы испытаний, на основании которых составлено соответствующее заключение, подписанные лицами, проводившими испытания.

6.    Требования к проведению исследования приведены в приложении к настоящей Методике.

7.    В случае если заявителем не представлены документы и данные, предусмотренные настоящей Методикой, и (или) образцы ГМО и исходного организма-реципиента или образцы продукции, пригодные для проведения

исследований, в количестве, необходимом для проведения исследований, исследование не проводится. Заявителю должен быть выдан мотивированный отказ в проведении исследования, подписанный руководителем организации (испытательной лаборатории), аккредитованной в национальной системе аккредитации, с областью аккредитации, соответствующей исследованиям, указанным в настоящей методике, в которую обратился заявитель для проведения исследования.

II. Исследование ГМО, являющихся микроорганизмами

8. В рамках исследования осуществляется анализ представленных заявителем ГМО документов и данных:

а)    наименования ГМО с указанием его таксономического статуса;

б)    полного наименования и места нахождения, идентификационного номера налогоплательщика (ИНН) заявителя ГМО;

в)    полного наименования и место нахождения юридического лица либо фамилия, имя, отчество (при наличии), место жительства индивидуального предпринимателя - изготовителя образцов ГМО;

г)    вид предполагаемого целевого использования ГМО;

д) сведений об исходном организме-реципиенте (таксономическая характеристика с указанием метода идентификации; источник выделения штамма: субстрат, географический пункт, дата выделения; методы идентификации штамма, кем идентифицирован (фамилия, имя, отчество (при наличии)), ссылка на использованные определители);

е)    сведений о трансформационном событии в виде кода, сформированного согласно Общероссийскому классификатору трансформационных событий;

ж)    информации об организмах-донорах вносимых генов (с указанием группы патогенности при наличии);

з)    описания структуры генетической конструкции (внесенной или удаленной) и места ее локализации, характеристики встроенных или измененных генов;

и) информации о генетической модификации: описания метода модификации, структуры вектора, структуры вставки, расположения рекомбинантной ДНК (хромосома, плазмида, мобильные элементы), включая фланкирующие последовательности, включение в состав мобильных генетических элементов;

к)    регистрационного номера свидетельства о государственной регистрации ГМО, предназначенного (предназначенных) для выпуска в окружающую среду, на основе которого (которых) создан ГМО, в отношении которого проводится

исследование (в случае если ГМО создан на основе иного (иных) ГМО), либо указания на то, что ГМО не создан на основе иного (иных) ГМО;

л)    описания методики, позволяющей идентифицировать генетическую модификацию, в том числе описания нуклеотидных последовательностей, используемых праймеров, зондов и условий полимеразной цепной реакции (далее - ПЦР);

м)    информации о месте депонирования и коллекционном номере штамма ГМО, паспорт штамма ГМО (для депонированных штаммов ГМО) либо информации о культурально-морфологических, физиолого-биохимических (ферментативных), антигенных, биологических свойствах и генетических особенностях штамма ГМО; об условиях культивирования: наименованиях питательных сред, pH среды, температуре и продолжительности выращивания, сроке хранения и периодичности пересева культуры штамма ГМО в нативной форме; о применяемом способе и условиях хранения штамма ГМО: в случае лиофилизации указывается продолжительность выращивания на питательной среде (возраст культуры), состав защитной среды, титр клеточной суспензии, режим высушивания, температура хранения, срок хранения; в случае криоконсервации указывается продолжительность выращивания на питательной среде (возраст культуры), состав защитной среды, титр клеточной суспензии, скорость замораживания (град/мин), температура хранения, срок хранения; о диссоциации культуры в зависимости от метода хранения (описание морфологических типов колоний на конкретной среде с подробным описанием типа колонии, сохраняющего полезный или диагностический признак); о среде, на которой заявителем предоставляется штамм ГМО; о количестве, дате приготовления и сроке годности образцов штамма ГМО (в случае непредоставления информации о месте депонирования и коллекционном номере штамма ГМО, паспорта штамма ГМО);

н)    регистрационного номера свидетельства о государственной регистрации ГМО для иного целевого использования (при наличии);

о)    информации о регистрации ГМО за рубежом (при наличии);

п)    данных полногеномного секвенирования ГМО (при наличии).

Заявителем ГМО для исследования предоставляются образцы ГМО

и исходного организма-реципиента.

9. В рамках исследования осуществляются следующие испытания представленных заявителем образцов ГМО и исходного организма-реципиента:

а) проверка (валидация) методики идентификации ГМО, в том числе оценка чувствительности и специфичности данной методики в соответствии с критериями эффективности, указанными в таблице № 3 приложения к настоящей Методике;

б)    подтверждение присутствия (отсутствия) заявленной генетической модификации в геноме ГМО;

в)    подтверждение присутствия (отсутствия) маркерных и селективных генов в геноме ГМО, указанных в таблице № 1 приложения к настоящей Методике;

г)    проведение полногеномного секвенирования ГМО, который содержится в продукции в жизнеспособном виде (в случае непредставления заявителем ГМО данных полногеномного секвенирования ГМО, представляющего собой плазмиду, бактерию, одноклеточное простейшее, животное, гриб), проведенного с использованием методики полногеномного секвенирования, соответствующей критериям эффективности, указанным в таблице № 4 приложения к настоящей Методике.

10.    Полногеномное секвенирование ГМО проводится с использованием методики полногеномного секвенирования, соответствующей критериям эффективности, указанным в таблице № 4 приложения к настоящей Методике.

III. Исследование ГМО растительного происхождения

11. В рамках исследования осуществляется анализ представленных заявителем ГМО документов и данных, предусмотренных подпунктами «а» - «л» пункта 8 настоящей Методики, а также данных секвенирования вставки ГМО и бордерных последовательностей, не менее 100 нуклеотидов по флангам генома реципиента (при наличии).

Заявителем ГМО для исследования предоставляются образцы ГМО и исходного организма-реципиента.

12. В рамках исследования осуществляются следующие испытания представленных заявителем образцов ГМО и исходного организма-реципиента:

а)    проверка (валидация) методики идентификации ГМО, в том числе оценка чувствительности и специфичности данной методики в соответствии с критериями эффективности, указанными в таблице № 3 приложения к настоящей Методике;

б)    подтверждение присутствия (отсутствия) заявленной генетической модификации в геноме ГМО;

в)    подтверждение присутствия (отсутствия) генетических последовательностей в геноме ГМО, указанных в таблице № 2 приложения к настоящей Методике.

IV. Исследование ГМО животного происхождения

13. В рамках исследования осуществляется анализ представленных заявителем ГМО документов и данных, предусмотренных подпунктами «а» - «л» пункта 8 настоящей Методики, а также данных секвенирования вставки ГМО и бордерных последовательностей, не менее 100 нуклеотидов по флангам генома реципиента (при наличии).

Заявителем ГМО для исследования предоставляются образцы ГМО и исходного организма-реципиента.

14. В рамках исследования осуществляются следующие испытания представленных заявителем образцов ГМО и исходного организма-реципиента:

а)    проверка (валидация) методики идентификации ГМО, в том числе оценка чувствительности и специфичности данной методики в соответствии с критериями эффективности, указанными в таблице № 3 приложения к настоящей Методике;

б)    подтверждение присутствия (отсутствия) заявленной генетической модификации в геноме ГМО;

в)    подтверждение присутствия (отсутствия) незаявленных генетических последовательностей в геноме ГМО.

V. Исследование продукции

15. В рамках исследования осуществляется анализ представленных заявителем продукции документов и данных:

а)    наименования продукции;

б)    полного наименования и места нахождения заявителя продукции;

в)    регистрационного номера свидетельства о государственной регистрации ГМО, с применением которого получена продукция или который она содержит (указывается регистрационный номер свидетельства о государственной регистрации каждого ГМО, содержащегося в продукции или с применением, которого она получена);

г)    компонентного состава продукции, включая    информацию

о количестве ГМО (доля содержания в %);

д)    описания методики, позволяющей идентифицировать генетическую модификацию, в том числе описание нуклеотидных последовательностей, используемых праймеров, зондов, и условий ПЦР;

е)    специальных условий использования ГМО, с применением которого получена продукция или который она содержит (при наличии);

ж)    информации о регистрации продукции за рубежом (при наличии).

Заявителем продукции для исследования предоставляются образцы продукции.

16. В рамках исследования осуществляются следующие испытания представленных заявителем образцов продукции:

а)    проведение идентификации заявленного (заявленных) ГМО в образцах продукции;

б)    проведение скрининга для подтверждения присутствия заявленных генетических модификаций в образцах продукции.

Приложение

к Методике производства молекулярно-генетического исследования генно-инженерно-модифицированных организмов, используемых для производства кормов и кормовых добавок для животных, а также кормов и кормовых добавок для животных, полученных с применением таких организмов или содержащих такие организмы

Таблица № 1. Основные маркерные и селективные гены, являющиеся составляющими частями генно-инженерных конструкций микроорганизмов

Мишень	Описание
Ген LacZ	Кодирует фермент b-галактозидазу. Используется в векторных плазмидных конструкциях (pCR2.1TOPO, pVIKl 12, pBSKSII), включает область полилинкера для клонирования рекомбинантных генов. При наличии данного фермента бесцветный субстрат X-gal превращается в окрашенный продукт, бактериальные колонии, экспрессирующие LacZ, имеют голубой цвет
Г ен gfp	Г ен зеленого флуоресцентного белка используется в ряде векторных плазмид для генно-инженерных манипуляций (pKEN-gfpmut2, pRK415-gfp) в качестве светящейся метки
Ген amp	Кодирует устойчивость к ампициллину, используется в ряде векторных плазмид для селекции по антибиотикоустойчивости (pBR322, pUC18, pBSKSII, pET,pCR2.1 ТОРО)
Ген Km	Кодирует устойчивость к канамицину, используется в ряде векторных плазмид для селекции по антибиотикоустойчивости (pVIKl 12, рМС212)
Г ен tetO	Кодирует устойчивость к тетрациклину, используется в ряде векторных плазмид для селекции по