УТВЕРЖДАЮ: Директор ФГБНУ

СОГЛАСОВАНО: И.о. директора

---

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

по Порядку и условиям применения метода трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота

Настоящие Методические рекомендации определяют терминологию, перечень ключевых операций и подходов для эффективного получения, хранения, пересадки и подсадки эмбрионов крупного рогатого скота.

Рекомендации подготовлены в соответствии с Федеральным законом от 03.08.1995 г. № 123-ФЗ "О племенном животноводстве" и предназначены для организаций по трансплантации эмбрионов, подразделений по получению и трансплантации эмбрионов в составе организаций, хозяйств - собственников скота, племенных и ветеринарных служб.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.........................................................................................................................................4

1.    ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ..............................................................................................................5

2.    ОТБОР ДОНОРОВ И СЕМЕНИ БЫКОВ.................................................................................7

3.    ТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА И ТРАНСПЛАНТАЦИИ ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО

РОГАТОГО СКОТА..........................................................................................................................8

4.    ПОЛУЧЕНИЕ ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА МЕТОДОМ IN VIV0....9

4.1.    ОТБОР ЖИВОТНЫХ В ДОНОРЫ ЭМБРИОНОВ..................................................................9

4.2.    МЕТОДЫ СТИМУЛЯЦИИ ДОНОРОВ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЭМБРИОНОВ.......................9

4.3.    ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГОТОВЫХ СРЕД, ИХ ПРИГОТОВЛЕНИЕ......................................10

4.4.    ИЗВЛЕЧЕНИЕ ЭМБРИОНОВ.................................................................................................10

5.    ПОЛУЧЕНИЕ ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА МЕТОДОМ IN VITRO 12

5.1.    ОТБОР ЖИВОТНЫХ В ДОНОРЫ ЯЙЦЕКЛЕТОК (ООЦИТОВ).......................................12

5.2.    ПРОВЕДЕНИЕ ТРАНСВАГИНАЛЬНОЙ АСПИРАЦИИ (ТАО)........................................12

5.3.    ТРАНСПОРТИРОВКА ОКК....................................................................................................12

5.4.    ТРАНСПОРТИРОВКА ЯИЧНИКОВ......................................................................................13

5.5.    ВЫДЕЛЕНИЕ ООЦИТОВ ИЗ ЯИЧНИКОВ...........................................................................13

5.6.    ОТБОР ООЦИТОВ....................................................................................................................13

5.7.    ДОЗРЕВАНИЕ ОТОБРАННЫХ ООЦИТОВ..........................................................................13

5.8.    ОПЛОДОТВОРЕНИЕ ДОЗРЕВШИХ IN VITRO ООЦИТОВ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ

ЭМБРИОНОВ...................................................................................................................................13

5.9.    ТРЕБОВАНИЯ К РАБОТЕ С БИОЛОГИЧЕСКИМ МАТЕРИАЛОМ И

ИНСТРУМЕНТАМИ.......................................................................................................................14

6.    ТРЕБОВАНИЯ К ЭМБРИОНАМ............................................................................................15

7.    КРИОКОНСЕРВАЦИЯ ЭМБРИОНОВ...................................................................................16

8.    ПЕРЕНОС ЭМБРИОНОВ В ОРГАНИЗМ САМКИ-РЕЦИПИЕНТА..................................17

9.    КРИОХРАНЕНИЕ ЭМБРИОНОВ...........................................................................................19

9.1. ТЕХНИКА БЕЗОПАСНОСТИ ПРИ РАБОТЕ С СОСУДАМИ ДЬЮАРА И СТАЦИОНАРНЫМИ БИОХРАНИЛИЩАМИ.............................................................................19

10.    УЧЕТ И ОТЧЕТНОСТЬ............................................................................................................21

ПРИЛОЖЕНИЯ.........................................................................................................................23

Поиск эмбрионов

Вымывную жидкость собирают в стерильную емкость или фильтруют через эмбриональный фильтр и поиск эмбрионов проводят непосредственно в фильтре. Фокусировку микроскопа проводят по нижнему слою жидкости или по образовавшемуся осадку на дне фильтра, так как именно в этом слое должны находиться извлеченные эмбрионы. Поиск проводят при 10' или 15' кратном увеличении стереомикроскопа, последовательно и тщательно просматривая каждое поле зрения. При этом передвигают эмбриональный фильтр относительно окуляра стереомикроскопа слева направо или наоборот. Обнаруженные в поле зрения эмбрионы с помощью одноразового шприца (емкостью 1мл), соединенного с венозным катетером или пластиковым капилляром, переносят в маленькую чашку Петри (0-35-40 мм) со средой для культивирования.

Оценка эмбрионов

Оценивают качество эмбрионов под микроскопом в проходящем свете при 100-160 кратном увеличении. Пригодными для трансплантации являются эмбрионы, полученные на 7-8 день после первого осеменения. К этому времени нормально развитые эмбрионы находятся на стадии развития поздней морулы, ранней бластоцисты и поздней бластоцисты.

Замороженно-оттаянные эмбрионы оценивают по тем же морфологическим показателям, что и свежеполученные. Эмбрионы, имеющие значительные повреждения прозрачной оболочки, разрушение бластомеров, сжатие бластополости, подвергаются дополнительной оценке методом культивирования или выбраковываются.

Оценку эмбрионов осуществляют согласно нормам Госта 28424-2014. Санитарная обработка эмбрионов

Для устранения инфекционной контаминации перед пересадкой или замораживанием необходимо применять санитарную обработку эмбрионов. Для обработки трипсином можно подвергать только эмбрионы с не повреждённой прозрачной оболочкой. Эмбрионы отмывают в 5-ти стерильных каплях среды культивирования, затем 2-2,5 мин в 2 3-х каплях раствора трипсина с концентрацией 0,25%. После обработки трипсином эмбрионы вновь промывают в 5-ти в 5-ти сменяющихся каплях 20%-ного раствора фетальной сыворотки на основе среды Дюлбекко.

Подготовка эмбрионов к замораживанию

Для замораживания используют только свежеполученные эмбрионы отличного и хорошего качества. Продолжительность времени подготовки эмбрионов к замораживанию должна быть минимальной. Для защиты эмбрионов от разрушения при замораживании и оттаивании применяют специальные криозащитные вещества, в основном: легко

и

проникающий в клетку криопротекторы глицерин в концентрации 1,0 М, 1,4 М. или этилен гликоль в концентрации 1,5 М. Для нысыщения эмбрионов криопротектором их группами помещают в криозащитный раствор и выдерживают определённое время. После чего при помощи специального устройства    заправляют    в    пайеты

Подготовку к криоконсервации, криоконсервацию и отгаивание эмбрионов осуществляют по принятому протоколу.

Глубокое замораживание эмбрионов и хранение их в жидком азоте при температуре -196°С обеспечивает длительное сохранение их жизнеспособности и проведение трансплантации в любое удобное время. Для криоконсервирования выделяют хорошо вентилируемое помещение, граничащие территориально с комнатой, где проводится оценка жизнеспособности эмбрионов. Одно помещение служит для замораживания эмбрионов, другое - для хранения хладоагента и замороженных эмбрионов (эмбриобанк). Замораживание эмбрионов проводят с помощью автоматических приборов, обеспечивающих регулирование скорости охлаждения в заданных режимах.

После проведения криоконсервации эмбрионов заполняют соответствующую документацию, в которой отражены характеристики доноров, эмбрионов и проведенных процедур.

При работе с эмбрионами соблюдают все предписания и правила, отраженные в Госте 28424-2014, в кодексе здоровья наземных животных МЭБ и ветеринарном законодательстве РФ.

5. ПОЛУЧЕНИЕ ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА МЕТОДОМ IN VITRO

5.1. Отбор животных в доноры яйцеклеток (ооцитов)

Отбор животных для получения ооцитов проводится также, как и в технологии трансплантации in vivo.

В технологии in vitro используют два способа получения женских гамет. Первый - ооциты аспирируют из поверхностных антральных фолликулов яичников животных прижизненно, методом ovum pick-up (OPU). Процедура выполняется с минимальным хирургическим вмешательством, при этом предварительная гормональная обработка животного не является обязательным условием, а выделенные ооциты дозревают in vitro. Получение ооцитов у одного животного может проводиться с интервалом в 1-2 недели. Второй способ — это выделение ооцитов из яичников животных при убое.

5.2. Проведение трансвагинальной аспирации ооцитов (ТАО)

Использование технологии in vitro для получения доимплантационных эмбрионов может способствовать ускоренному получению потомства ценных в

генетическом отношении животных, у которых имеются нарушения в воспроизводстве, не связанные с функцией яичников, или не проявляется адекватная реакция суперовуляции в ответ на гормональную обработку. Также этот метод позволяет получать полноценные эмбрионы для трансплантации при выделении ооцитов из яичников здоровых животных, в том числе и находящихся на разных сроках стельности.

Другим источником женских гамет являются яичники, получаемые при убое животных. В этом случае также могут быть разово получены эмбрионы от ценных особей, выбраковка которых по ряду причин необходима. В широком масштабе этот источник используется для увеличения поголовья и повышения генетического потенциала в мясном скотоводстве.

Для проведения прижизненной трансвагинальной аспирации ооцитов из фолликулов яичника используют устройства OPU. Прибор OPU состоит из ультразвукового сканера, вакуумной помпы, пункционной насадки, иглы диметром 18G. В качестве среды для кратковременной локализации ОКК используется фосфатно-солевой буфер Дюльбекко с добавлением 100 ед./мл гентамицина, геперина и 2% BSA либо фетальной сыворотки. Извлекаемые из фолликулов ооциты по трубке попадают в подогреваемый приемник.

5.3. Транспортировка ооцит-кумулюсных комплексов (ОКК)

Допустимо осуществлять транспортировку ОКК в транспортном

инкубаторе в среде для дозревания с соблюдением температурного режима и концентрации СОг

5.4. Транспортировка яичников

После овариоэктомии морфологически нормальные яичники доставляют в лабораторию. Если транспортировка яичников до лаборатории занимает непродолжительное время (2-3 час.), температура раствора, в котором находятся яичники, должна быть в пределах 30-35°С. Если транспортировка требует более продолжительного времени (более 6 час.), температура раствора должна находиться в пределах 20-25°С.

5.5. Выделение ооцитов из яичников

Выделение ооцитов проводится в стерильных условиях с использованием нагревательных поверхностей.

В чашку Петри или конический фильтр помещается небольшое количество предварительно подготовленного и подогретого до температуры +37°С раствора среды Дюльбекко с добавлением фетальной сыворотки и антибиотиков. Яичник в этой среде фиксируется пинцетом. Затем при помощи стерильного лезвия рассекают ткани яичника, после чего места разрезов тщательно промывают подготовленным раствором среды.

5.6.    Отбор ооцитов

В технологии получения эмбрионов крупного рогатого скота in vitro требуются ооциты, способные возобновлять мейоз, дозревать и

оплодотворяться in vitro с получением жизнеспособных эмбрионов, пригодных для дальнейшей трансплантации.

При отборе ооцит-кумулюсных комплексов обращают внимание на такие морфологические параметры как: наличие кумулюса и его качество, размер ооцита, гомогенность и цвет ооплазмы, ширина и равномерность зоны пеллюцида, тургор. Локализацию ооцит-кумулюсных комплексов проводят с помощью сетчатого фильтра, визуализацию и оценку качества ооцитов осуществляют с использованием стереоскопического микроскопа.

5.7. Дозреванис отобранных ооцитов

После получения и отбора ооциты помещают в среду дозревания и выдерживают течение 22-24 часов в газовых инкубаторах, при влажности 98% и температуре +38,5 °С.

Все технологические процедуры с ооцитами для получения эмбрионов методом in vitro должны проводиться согласно принятым протоколам с соблюдением правил асептики.

5.8.    Оплодотворение дозревших in vitro ооцитов и культивирование эмбрионов

Для оплодотворения используют, как правило, криоконссрвированное семя быков. Выделяют фракцию подвижных сперматозоидов, свободных от семенной плазмы и компонентов среды. Оплодотворяющая способность сперматозоидов может существенно варьировать у разных особей. Концентрация подвижных сперматозоидов при оплодотворении дозревших in vitro ооцитов крупного рогатого скота должна составлять 0,5-1,0 х 10⁶ сперматозоидов/мл.

Ооциты со сперматозоидами инкубируют в средах для оплодотворения в течение 18-20 часов. День оплодотворения считают нулевым.

После завершения процедуры инкубирования зиготы помещают в среду культивирования, в состав которой, в зависимости от протокола, могут входить пируват натрия, лактат натрия, глутамин, глюкоза, растворы заменимых и незаменимых аминокислот, фетальная сыворотка крупного рогатого скота, бычий сывороточный альбумин, витамины. Стадии развития, пригодной для нехирургической трансплантации (бластоцисты, экспандированной бластоцисты и полностью экспандированной бластоцисты), полученные in vitro эмбрионы достигают на 6-7 и 8 сутки культивирования.

5.9. Требования к работе с биологическим материалом и инструментами

Биологические продукты животного происхождения, в том числе культуральные клетки и составляющие жидкостей, используемые для отбора, дозревания, оплодотворения, культивирования ооцитов, вымывания и хранения эмбрионов, не должны содержать живых патогенных возбудителей. Среды должны подвергаться предварительной стерилизации по утвержденным

методикам, описанным в Руководстве IETS, а при манипуляциях оставаться стерильными. Антибиотики должны добавляться в жидкости и среды согласно рекомендациям Руководства IETS.

Инвентарь, используемый для отбора, манипуляций, культивирования, вымывания, замораживания и хранения ооцитов/эмбриоиов, должен быть стерильным и тестированным на эмбриотоксичность.

6. ТРЕБОВАНИЯ К ЭМБРИОНАМ

Характеристика состояния эмбрионов необходима для выявления среди них способных к развитию и пригодных для пересадки реципиенту или криоконсервации. При оценке учитывают стадию развития эмбриона, соответствие ее возрасту, определяют морфологическое состояние эмбриона и, исходя из этих критериев, устанавливают его качество и пригодность для дальнейшего использования. Морфологическую оценку качества эмбрионов проводят под бинокулярной лупой или стереомикроскопом. Характеризуют и классифицируют эмбрионы согласно Госту 28424-2014.

При работе с эмбрионами соблюдают все предписания и правила, отраженные в Госте 28424-2014, в кодексе здоровья наземных животных МЭБ и ветеринарном законодательстве РФ.

7. КРИОКОНСЕРВАЦИЯ ЭМБРИОНОВ

Эмбрионы крупного рогатого скота, полученные методом in vitro, по ряду морфофизиологических характеристик отличаются от полученных in vivo, и являются более чувствительными к воздействию факторов, связанных с криоконсервацией. В результате криоконсервации с использованием технологии медленного замораживания жизнеспособность эмбрионов, полученных методом in vitro, существенно снижается.

В этой связи криоконсервацию эмбрионов, полученных методом in vitro рекомендуется проводить методом витрификации. Особенность метода заключается в помещении эмбриона в концентрированный раствор криопротектора, перенос эмбриона на носитель - «криотек» и мгновенное погружение в жидкий азот. Для достижения максимальных скоростей охлаждения и нагревания объем капли криопротектора, в которой содержится эмбрион, должен быть минимальным (от 1 до 4 мкл). При криоконсервации по методу витрификации полученных in vitro эмбрионов используется широкий ряд носителей открытого и закрытого типов.

Требования к консервации и транспортировке эмбрионов согласно кодексу здоровья наземных животных МЭБ:

• в одну группу при криоконсервации должны входить эмбрионы,

полученные от одной самки-донора или происходящие из одной партии.

•    эмбрионы должны криоконсервироваться в очищенных и стерильных контейнерах с жидким азотом, а затем храниться с соблюдением строгих условий гигиены в специально предназначенном для этой цели месте.

•    носители с криоконсервированными эмбрионами маркируются, как указано в Руководстве IETS.

•    после проведения процедуры криоконсервации эмбрионов заполняют соответствующую документацию, в которой отражены характеристики доноров, эмбрионов и проведенных процедур.

8. ПЕРЕНОС ЭМБРИОНОВ В ОРГАНИЗМ САМКИ-РЕЦИПИЕНТА

Пересадки эмбрионов проводят в хозяйствах, благополучных по инфекционным и инвазионным заболеваниям, с хорошей организацией производства, обеспечивающей сбалансированное кормление и оптимальный уровень воспроизводства стада.

Для пересадок используют как коров, так и телок. Коров в качестве реципиентов используют не ранее, чем через 50-60 дней после отела, не старше 7-ми лет, клинически здоровых, с регулярными половыми циклами нормальной продолжительности. Телки должны быть случного возраста, средней упитанности, с живой массой, соответствующей стандарту породы, ни разу не осеменявшиеся. При отборе реципиентов проводят тщательное ректогенитальное обследование с целью исключения особей с неразвитыми половыми органами или наличием патологии.

•    реципиенты должны быть клинически здоровыми;

•    проходить обязательное обследование на инфекционные заболевания (бруцеллез, туберкулез, вирусные респираторные заболевания, лейкоз, трихомоноз, вибриоз, ящур и др.);

•    обязательна дегельминтизация предоставляемого поголовья для отбора в качестве реципиентов за 1,5 месяца до пересадки эмбрионов;

•    реципиенты должны быть с нормальной физиологией половой системы без патологии родовых путей;

•    в качестве реципиентов рекомендуется использовать наименее ценных в племенном отношении животных;

• нельзя использовать в качестве реципиентов животных мелких пород для трансплантации эмбрионов от пород более крупных по массе.

После проведения мероприятий по отбору и комплектованию группы реципиентов составляется акт (см. приложение).

Для управления половым циклом и синхронизации половой охоты у доноров и реципиентов применяют препараты, разрешённые к использованию на территории РФ и содержащие такие гормоны как прогестерон, синтетические аналоги простагландина F2a, различные рилизинг-гормоны.

После проведения мероприятий по синхронизации половых циклов у доноров и реципиентов составляют акт, где указывают использованные схемы введения гормонов (см. приложение).

Трансплантация эмбрионов реципиентам нехирургическим методом представляет собой процедуру переноса эмбриона из пайеты (соломинки) в рог матки реципиента. Такая процедура проводится при помощи специальных катетеров под ректальным контролем. Этот метод требует хороших навыков, позволяющих избежать травмирования слизистой оболочки половых путей, и его проводят в строгом соответствии со всеми требованиями и правилами по контролю и профилактике инфекционных заболеваний.

После пересадки эмбриона кормление и содержание реципиентов осуществляют в обычных условиях, как для стельных животных, не допуская травмирования и стрессовых ситуаций.

В группах реципиентов ведут постоянное наблюдение за возможным проявлением повторной охоты. На 30-90 дни после пересадки животных-реципиентов ректально исследуют на наличие стельности. По результатам исследования составляют акт (см. приложение).

9. ХРАНЕНИЕ ЭМБРИОНОВ

9.1 .Техника безопасности при работе с сосудами Дьюара и стационарными биохранилищами

Персонал, работающий с сосудами Дьюара (заправка жидким азотом, загрузка и выгрузка канистр со спермой, опорожнение сосуда и т. д.), обязан надевать защитные очки (лучше щитки из органического стекла) и рукавицы кожаные, асбестовые или брезентовые. Одежда не должна оставлять открытым кожный покров. Нужно помнить, что попадание жидкого азота на кожу может вызвать обморожение. Необходимо избегать соприкосновения открытых участков тела с металлическими предметами, извлеченными из жидкого азота, которые также могут вызвать обморожение. Брюки должны быть без манжет и закрывать верх обуви. Рукавицы должны надеваться на руки свободно, чтобы при необходимости их можно было легко сбросить.

Заливать жидкий азот в теплый сосуд Дьюара (имеющий температуру внутри сосуда, равную температуре окружающего воздуха) надо медленно. Азот заливают в сосуд Дьюара через широкую металлическую воронку. Быстрое заполнение теплого сосуда Дьюара азотом приводит к выбросам

жидкости из сосуда вследствие чрезмерно большого количества образующихся паров (особенно у сосудов с узкой горловиной).

Категорически запрещается оставлять на отогрев после испытаний сосуды Дьюара, потерявшие вакуум (покрывшиеся слоем инея) в помещении, где могут находиться (или проходить) люди. При отогреве таких сосудов может произойти быстрая десорбция больших количеств воздуха, поглощенного адсорбентом при заливании в сосуд жидкого азота. При этом резко увеличивается давление в межстенном пространстве сосуда, что может привести к взрыву. Отогревать (не менее 3 суток) такие сосуды следует в изолированных помещениях, в которые на это время должен быть запрещен доступ людям.

При транспортировке сосудов Дыоара с жидким азотом на автомобилях и других видах транспорта необходимо надежно закреплять их во избежание падений. Сосуды Дьюара, подготавливаемые к перевозке на самолетах, надо заливать жидким азотом только на половину гидравлической емкости.

В сосуды Дьюара, изготавливаемые для сельского хозяйства, не допускается заливка жидкого азота с примесью воздуха и жидкого кислорода, поскольку в качестве адсорбента применен активированный уголь. Использование в сосудах Дьюара загрязненного кислородом жидкого азота требует соблюдения правил безопасности.

При получении на предприятии-поставщике каждой партии жидкого азота шофер автомобиля с транспортным резервуаром организации или сопровождающее лицо обязаны взять от представителя ОТК этого предприятия сертификат на жидкий азот с указанием его чистоты в процентах. В организации работник, ответственный за эксплуатацию криогенного оборудования, должен постоянно следить по сертификатам за чистотой получаемого азота. Сертификаты должны храниться отдельно от других документов.

10 . УЧЕТ И ОТЧЕТНОСТЬ

Метод трансплантации эмбрионов требует четкой организации и последовательности работ, пунктуального и добросовестного оформления документации. Правильный учет на всех этапах технологии трансплантации эмбрионов необходим для постоянного контроля и анализа результатов, применения отдельных схем, режимов и методов в работе.

На каждого поступающего животного донора и реципиента, заполняется соответственно оформленная карточка племенной коровы, телки. К карточке прилагают пояснительную записку или зоотехническо-гинекологическую карточку с характеристикой воспроизводительной способности животного и других показателей, перечисленных в требованиях при отборе коров-доноров.

На выбракованных из молочного стада коров указывают причину выбраковки.

18

На быков-производителей, семя которых используется для осеменения доноров, заполняется карточка, племенного быка или племсвидетельство.

На каждого теленка, полученного методом трансплантации эмбрионов, в день его рождения составляют акт на оприходование приплода, ведется журнал регистрации приплода и выращивания молодняка крупного рогатого скота.

На каждого племенного бычка и телочку заполняется карточка теленка.

Оперативный учет работ, непосредственно связанный с технологией трансплантации эмбрионов, осуществляется с помощью специальных карточек для животных: доноров, реципиентов и телят. Лицевая сторона карточки донора и реципиента заполняется при отборе животных в хозяйстве, на основании данных первичного зоотехнического племенного учета, клинической и гинекологической диспансеризации, а также непосредственного осмотра и ректального контроля родополовых органов. Обратная сторона карточки предназначена для учета и контроля исполнения каждого элемента технологии трансплантации эмбрионов.

Одновременно ведется учет и регистрация работ в следующих рекомендуемых журналах:

-    учета поступления и использования доноров;

-    гормональной индукции суперовуляции доноров;

-    извлечения, оценки качества и использования эмбрионов;

-    криоконсервирования и использования эмбрионов;

-    учета результатов пересадки эмбрионов.

Вся информация в процессе работы сразу заносится в карточку или журнал с указанием даты и непосредственного исполнителя работ.

По результатам работы за каждый месяц заведующий составляет отчет, в который включает:

•    итоговые показатели работы по трансплантации эмбрионов;

•    опись и карточки на каждого используемого в работе донора, реципиента

и полученного методом пересадки эмбрионов теленка;

•    копию акта результатов ректального исследования реципиентов на

стельность.

ОТЧЕТ

по трансплантации эмбрионов по хозяйству за_квартал    20_гол

Трансплантация эмбрионов крупного    рогатого скота является

биотехнологическим приемом в селекции, позволяющим получать большее количество потомков (по сравнению с    традиционными методами

воспроизводства) от генетически ценных родителей.

Метод эмбриотрансплантации способствует:

•    получению быков-производителей и выдающихся тёлок от лучших племенных животных в количестве большем, чем может принести корова за один год;

•    ускорению селекционного процесса за счет сокращения интервалов между поколениями;

•    увеличению генетического разнообразия быков для одной самки, а также создания семейств и стад коров на основе одной родоначальницы;

•    предимплантационной диагностике эмбрионов с целью выявления нежелательных рецессивных генов и хромосомных аномалий;

•    осуществлению межвидовых пересадок;

•    получению химерных животных;

•    оздоровлению стад от инфекционных заболеваний;

•    созданию банков криоконсервированных эмбрионов, сохранению ценных и исчезающих пород и генотипов;

•    получению животных с желаемым полом.

На современном этапе развития животноводства внедрение трансплантации эмбрионов в практику племенных и товарных хозяйств позволяет повысить эффективность программ по комплексному совершенствованию продуктивных и технологических качеств крупного рогатого скота и обеспечить скорейшее качественное изменение стад.

з

КАРТОЧКА ДОНОРА (КОРОВА/ТЕЛКА)

Хозяйство_Порода_

Инв. №_

Кличка_

Дата рождения_

Живая масса_кг.

Молочная иродуктивность

Лактация по счету Удой за 305 дней, кг % жира % белка Стадия лактации Среднесуточный удой, кг Примечание

Воспроизводительная функция

Дата отела Исход отела Послеродовые заболевания Меры лечения Дата прихода в охоту Примечание 1 2 3 4 5

Средняя продолжительность астрального цикла_дней

Результаты ректального исследования

Дата Состояние влагалища и матки Яичники (размер, кол-во и состояние ЖТ и Ф) Примечание Ф.И.О. специалиста левый Правый

Результаты лабораторных исследований_

Физиологическое состояние животного_

Содержание, кормление_

Заключение специалиста при отборе коровы в качестве донора Дальнейшее использование_

Дата

Ф.И.О.

Место для размещения организации по трансплантации эмбрионов должно быть выбрано с учетом благополучия местности по инфекционным заболеваниям животных, рельефа, залегания грунтовых вод, господствующих ветров и возможностей удобного выхода на шоссейные и железнодорожные магистрали и удаленности от них, населенных пунктов и животноводческих объектов на расстояние, установленное по согласованию с местными органами государственного санитарного и ветеринарного надзора.

Размещение всех зданий и сооружений на территории организации для трансплантации эмбрионов животных должно обеспечить их рациональную технологическую взаимосвязь и соблюдение необходимых ветеринарносанитарных условий.

Территория организации должна быть огорожена, а проезд и проход через неё посторонних лиц и транспорта должны быть запрещены.

На территории организации должны находиться только производственные здания, доноры и реципиенты эмбрионов.

Современные технологии производства эмбрионов позволяют проводить работы на территории хозяйств, в которых располагаются животные доноры и реципиенты.

Для проведения работ на территории заказчика предусматривается наличие мобильной эмбриологической лаборатории или комплекта оборудования для осуществления выезда на предприятие с целью получения эмбрионов in vivo или трансвагинального забора ооцитов для последующего производства эмбрионов in vitro.

Для производства эмбрионов методом in vitro необходимо наличие стационарной лаборатории.

При необходимости длительного хранения эмбрионов в замороженном виде организация по трансплантации эмбрионов должна иметь оборудованное помещение.

Для производства эмбрионов стационарная лаборатория должна быть оснащена следующими устройствами и оборудованием:

•    системой отопления, кондиционирования и дезинфекции помещения для создания необходимого микроклимата;

•    холодильным оборудованием;

•    газовыми инкубаторами для in vitro;

•    комплексом оборудования для транс вагинальной аспирации ооцитов для in vitro;

•    стереомикроскопами;

•    нагревательными поверхностями;

•    программным замораживателем;

•    комплектом инструментов для витрификации;

•    стационарными и переносными сосудами Дьюара;

•    размораживателем;

•    стерилизаторами для используемого инструмента;

•    ультразвуковым сонографом с датчиками для диагностики состояния половых путей и стельности (при необходимости);

•    необходимыми средами, расходным материалом и лабораторной посудой.

2. ОТБОР ДОНОРОВ И СЕМЕНИ БЫКОВ

Организации по трансплантации эмбрионов должны использовать в качестве доноров только животных, имеющих племенную ценность.

Отбор животных в доноры эмбрионов проводят по генетическим параметрам животного, индивидуальному развитию, продуктивности и признакам здоровья.

Генетическое превосходство животного определяется ценностью его предков, длительностью хозяйственного использования, собственной продуктивностью и продуктивностью его потомства, а также соответствием стандарту (по типу) породы.

При подборе коров-допоров для использования в целях сохранения генофонда локальных пород руководствуются задачами поддержания всего генетического разнообразия.

Доноры эмбрионов должны удовлетворять следующим требованиям:

•    не иметь признаков, отрицательно влияющих на племенное использование;

•    иметь известное происхождение, достоверность которого подтверждается соответствующим документом;

•    не иметь экстерьерных недостатков;

•    для получения эмбрионов in vivo животные должны быть клинически здоровыми, иметь регулярный половой цикл;

•    животные доноры должны получать полноценное кормление и бесстрессовое содержание.

Для осеменения доноров и оплодотворения ооцитов, используют сперму быков-производителей согласно утвержденному селекционному плану хозяйства.

Используемое семя должно быть от выдающихся быков-производителей, имеющих высокую оценку племенной ценности. Прошедших генетические исследования на достоверность происхождения и отсутствие наследственных заболеваний.

3. ТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА И ТРАНСПЛАНТАЦИИ ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

В настоящее время в практике скотоводства применяются две технологии получения эмбрионов методами in vivo и in vitro.

Метод in vivo характеризуется тем, что развитие эмбрионов до стадий, необходимых для трансплантации, происходит в репродуктивном тракте животного-донора.

При применении метода in vitro процессы дозревания яйцеклеток, их оплодотворения и культивирования эмбрионов производятся в лабораторных условиях вне организма животного-донора.

Таблица 1 Основные технологические этапы

Метод in vivo Метод in vitro Отбор, и подготовка доноров 1. Индукция суперовуляции; 1. получение ооцитов; 2. Осеменение доноров; 2. дозревание ооцитов in vitro (in 3. Извлечение эмбрионов; vitro maturation, IVM); 3.    оплодотворение ооцитов in vitro (in vitro fertilization, IVF); 4.    культивирование эмбрионов in vitro (in vitro cultivation, IVC), Поиск и оценка качества эмбрионов Оценка степени развития и качества эмбрионов Криоконсервация эмбрионов •    Метод программного замораживания эмбрионов •    Метод витрификации эмбрионов Хранение эмбрионов в жидком азоте Отбор и подготовка реципиентов Трансплантация эмбрионов реципиентам (интактных, либо оттаянных) Контроль стельности

4. ПОЛУЧЕНИЕ ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА МЕТОДОМ IN VIVO

4.1.    Отбор животных в доноры эмбрионов

Отбор животных в доноры проводят специалисты хозяйства и специалисты по трансплантации эмбрионов.

При отборе животных в доноры учитывают следующие признаки:

- клинически здоровые, без патологий репродуктивного тракта, без признаков нарушения обмена веществ (ожирение, дистрофия и т.д.), реагирующие полиовуляцией при гормональной обработке.

Из числа доноров исключают животных с узким анусом, нарушенным половым циклом, фолликулярными кистами, а также животных имеющих незавершенную инволюцию матки.

Отбирают коров-доноров с нормальным течением послеродового периода, у которых на протяжении 60 дней после отела зарегистрированы две овуляции и хотя бы одна выраженная охота.

4.2.    Методы стимуляции доноров для получения эмбрионов

Гормональную обработку с целью индицирования реакции полиовуляции начинают через 50-60 дней после отела. Перед этим контролируют состояние половой системы животного с помощью ректогенитального обследования или УЗИ-сканера. Наличие выраженной охоты и хорошо сформированного желтого тела в одном из яичников на 8-14 день цикла являются показанием для начала гормональной обработки. В случае отсутствия признаков явной охоты или ее пропуске, при нормальном состоянии половой системы приход животного в охоту стимулируют введением аналогов простагландина F-2a.

Таблица 2. Примерные схемы гормональной стимуляции полиовуляции

День эстрального цикла Наименование препарата Дозы Схема 1 9 ФСГ(гипофизарный) 2,5 мл. (утро, вечер) 10 ФСГ 2,0 мл. (утро, вечер) 11 ФСГ + простагландин F-2a (однократно утром) 1,5 мл. (утро, вечер) .+2,0 мл 12 ФСГ 1 мл. (утро, вечер) 13 Охота и осеменение (вечер, утро след, дня.) - 20 Нсхирургичсскос извлечение эмбрионов - Схема 2 Без учета фазы полового цикла CIDR + прогестерон + эстрадиол 0,5 мг+4,0 мл.+2,0 мл. 4 ФСГ 2,5 мл. (утро, вечер) 5 ФСГ 2,0 мл. (утро, вечер) 6 ФСГ + простагландин F-2a (однократно утром) 1,5 мл. +2,0 мл. (утро, вечер) 7 ФСГ 1,0 мл. (утро, вечер) 8 Охота и осеменение (вечер, утро след, дня.) - 15 Нехирургическое извлечение эмбрионов -

Охота у доноров с полиовуляцией обычно начинается через 36-48 часов после введения препарата простагландина F-2a. Коров при полиовуляции осеменяют от 2-х до 3-х раз с 12-часовым интервалом. Первое осеменение проводят спустя 8-12 часов после начала охоты. Сперму вводят в тело матки или в оба рога. Осеменение проводят одной- двумя дозами спермы.

После проведения процедуры по осеменению донора в журнал вносят данные о кличке быка, количества спермодоз и качестве спермы.

4.3. Использование готовых сред и их приготовление Приготовление растворов проводят в стерильных условиях, используя стерильную посуду, которую вскрывают непосредственно перед употреблением.

При работе с эмбрионами применяют модифицированный сбалансированный солевой раствор (Дюльбекко и др.) Непосредственно перед работой по извлечению эмбрионов в раствор фосфатно-солевого буфера, используемый для вымывания, добавляют 2% фетальной сыворотки крови крупного рогатого скота или бычьего сывороточного альбумина (BSA) из расчета 4 г/л среды для. Перед использованием среду для культивирования фильтруют через бактериальный мембранный фильтр (0=0,22 мкм).

Возможно использование готовых сред различных производителей, которые прошли регистрацию и сертификацию в контрольных органах Российской Федерации.

Извлечение эмбрионов

Обычно извлечение эмбрионов проводят на 7-8 день после осеменения донора (день охоты принимают за 0 день).

Перед извлечением эмбрионов проводят ректальное исследование донора для определения состояния половой системы и уровня реакции яичников.

Все инструменты и среды, используемые для извлечения эмбрионов, должны быть стерильными.

Эффективность получения эмбрионов во многом зависит от способа их извлечения, квалификации персонала, правильного использования приборов и инструментов.

Для извлечения эмбрионов необходимы следующие инструменты и растворы:

-    катетер для извлечения эмбрионов в сборе;

-    санитарный чехол;

-    два пластиковых шприца на 150 мл;

-    шприц для воздуха (10-20 мл);

-два зажима для шлангов;

-    емкость для сбора вымывной жидкости

-    среда Дюльбекко для извлечения эмбрионов (400-1000 см3);

-    2% раствор новокаина для сакральной анестезии (5 см3);

-    фильтровальная бумага или бумажные салфетки;

-    70° этиловый спирт;

-    одноразовые перчатки;

-гель УЗИ для смазки катетера

Процедура вымывания эмбрионов представляет собой подачу промывочного раствора в рога матки донора, орошения внутренней полости рога матки с целью извлечения находящихся там эмбрионов, забора промывочного раствора с эмбрионами из рога матки, сбора его в специальный сосуд или локализация вымытых эмбрионов в эмбриосборнике (фильтре).

Среду для извлечения эмбрионов вводят в рог матки отдельными порциями с помощью пластикового шприца емкостью 150 мл. На промывание одного рога расходуется 200-500 см3 среды. После извлечения жидкости из одного рога технолог отодвигает катетер назад в тело матки, вводит стилет и переводит катетер в левый рог и повторяет все манипуляции.

После извлечения последней порции жидкости из второго рога проводят санацию матки. Для этого, не выпуская из манжетки воздух, к катетеру присоединяют шприц с 40 см3 среды, содержащей антибиотики широкого спектра действия или санирующие препараты, используемые в среде для извлечения эмбрионов (ГАМП или полиген из расчета 300 или бООмкг/смЗ среды).

Вымывание эмбрионов проводят, соблюдая все правила обращения с животными, техники безопасности и с соблюдением норм и правил ветеринарного контроля. После проведения процедуры вымывания эмбрионов составляют акт (см. приложения) Используемую среду для вымывания эмбрионов, собирают в стерильную емкость или фильтруют через эмбриональный фильтр, и поиск эмбрионов проводят непосредственно в фильтре.

Перед началом процедуры вымывания эмбрионов животных доноров ректально исследуют на наличие жёлтых тел на яичниках. Наружные половые органы моют и насухо вытирают. Для снятия моторики кишечника и расслабления матки вводят эпидурально 5 см3 2% раствора новокаина. Хвост животного отводят в сторону и фиксируют в этом положении, чтобы он нс мешал при работе.

Технолог аккуратно вводит катетер во влагалище до упора в шейку матки и под ректальным контролем проводит катетер через шейку матки в тело и затем продвигает его в правый (или левый) рог до тех пор, пока не почувствует, что конец катетера упирается в изгиб рога. Ассистент освобождает резьбовой зажим стилета, и технолог, вытаскивая стилет, продвигает катетер дальше в рог матки. После того, как катетер введен глубоко в рог матки, ассистент накачивает манжетку катетера воздухом, вводя в нее примерно 15-20 см3.

ю