Товары в корзине: 0 шт Оформить заказ
Стр. 1 

17 страниц

Купить СТБ EN 12823-1-2012 — бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Цена на этот документ пока неизвестна. Нажмите кнопку "Купить" и сделайте заказ, и мы пришлем вам цену.

Распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль"

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

Способы доставки

  • Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
  • Курьерская доставка (7 дней)
  • Самовывоз из московского офиса
  • Почта РФ

Устанавливает метод определения витамина А в пищевых продуктах с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

 Скачать PDF

Оглавление

Введение

1 Область применения

2 Нормативные ссылки

3 Сущность метода

4 Реактивы

5 Аппаратура и приборы

6 Отбор проб

7 Проведение испытания

8 Расчет

9 Прецизионность результатов

10 Протокол испытаний

Приложение А (справочное) Примеры высокоэффективных жидкостных хроматограмм

Приложение В (справочное) Данные прецизионности

Приложение С (справочное) Альтернативные системы высокоэффективной жидкостной хроматографии

Библиография

Приложение Д.А (справочное) Сведения о соответствии государственного стандарта ссылочному европейскому стандарту

 
Дата введения01.01.2013
Добавлен в базу01.01.2019
Актуализация01.02.2020

Организации:

28.05.2012УтвержденГосстандарт Республики Беларусь26
ИзданБелГИСС2012 г.
РазработанНаучно-производственное республиканское УП БелГИСС

Foodstuffs. Determination of vitamin A by high performance liquid chromatography. Part 1. Measurement of all-trans-retinol and 13-cis-retinol

Стр. 1
стр. 1
Стр. 2
стр. 2
Стр. 3
стр. 3
Стр. 4
стр. 4
Стр. 5
стр. 5
Стр. 6
стр. 6
Стр. 7
стр. 7
Стр. 8
стр. 8
Стр. 9
стр. 9
Стр. 10
стр. 10
Стр. 11
стр. 11
Стр. 12
стр. 12
Стр. 13
стр. 13
Стр. 14
стр. 14
Стр. 15
стр. 15
Стр. 16
стр. 16
Стр. 17
стр. 17

СТБ EN 12823-1-2012

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

Определение содержания витамина А методом высокоэффективной жидкостной хроматографии Часть 1

Измерение количества полного транс-ретинола и 13-цис-ретинола

ПРАДУКТЫ ХАРЧОВЫЯ

Вызначэнне змяшчэння в1тамшу А метадам высокаэфекгыунай вадкаснай храматаграфм Частка 1

Вымярэнне колькасщ поунага транс-рэтынолу i 13-цыс-рэтынолу

(EN 12823-1:2000, ЮТ)

Издание официальное

Госстандарт

Минск

(пБ

УДК 664:543.645.5(083.74)(476)    МКС    67.050    КП 06    ЮТ

Ключевые слова: витамин А, ретинол, высокоэффективная жидкостная хроматография, отбор проб, антиоксиданты

Предисловие

Цели, основные принципы, положения по государственному регулированию и управлению в области технического нормирования и стандартизации установлены Законом Республики Беларусь «О техническом нормировании и стандартизации».

1    ПОДГОТОВЛЕН научно-производственным республиканским унитарным предприятием «Белорусский государственный институт стандартизации и сертификации» (БелГИСС)

ВНЕСЕН Госстандартом Республики Беларусь

2    УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ постановлением Госстандарта Республики Беларусь от 28 мая 2012 г. № 26

3    Настоящий стандарт идентичен европейскому стандарту EN 12823-1:2000 Foodstuffs - Determination of vitamin A by high performance liquid chromatography - Part 1: Measurement of all-trans-retinol and 13-cis-retinol (Продукты пищевые. Определение содержания витамина А методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Часть 1. Измерение количества полного транс-ретинола и 13-цис-ретинола) Европейского комитета по стандартизации (CEN).

Европейский стандарт разработан техническим комитетом по стандартизации CEN/TC 275 «Анализ пищевых продуктов. Горизонтальные методы» Европейского комитета по стандартизации (CEN).

Перевод с английского языка (еп).

Официальные экземпляры европейского стандарта, на основе которого подготовлен настоящий государственный стандарт, и европейских стандартов, на которые даны ссылки, имеются в Национальном фонде ТИПА.

В разделе «Нормативные ссылки» и тексте стандарта ссылки на европейские стандарты актуализированы.

Сведения о соответствии государственного стандарта ссылочному европейскому стандарту приведены в дополнительном приложении Д.А.

Степень соответствия - идентичная (ЮТ)

4    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

© Госстандарт, 2012

Настоящий стандарт не может быть воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Госстандарта Республики Беларусь

Издан на русском языке

СТБ EN 12823-1-2012


т

Vis

1000

Fr


масса навески пробы, г;

объем введенного раствора анализируемой пробы, мкл; коэффициент пересчета микрограммов в миллиграммы;

коэффициент соответствия 13-цис-ретинола полному транс-ретинолу, определенный с помощью ВЭЖХ с использованием стандартного раствора известной концентрации, вычисляют по формуле


Fr =


Дзс1з ' fiill-T ®all-Т ‘ ^13cis


(6)


ГД6 613^3

Sall-T

Cl3cis

Call-T


площадь пика или высота, полученные при исследовании стандартного раствора 13-цис-ретинола;

площадь пика или высота, полученные при исследовании стандартного раствора полного транс-ретинола;

массовая концентрация стандартного раствора 13-цис-ретинола; массовая концентрация стандартного раствора полного транс-ретинола.


9 Прецизионность

9.1    Общие положения

Результаты межлабораторных испытаний прецизионности методов приведены в приложении В. Данные, полученные в исследованиях, могут быть применены только для диапазонов концентраций и образцов, приведенных в приложении В.

9.2    Повторяемость

Абсолютная разность между независимыми результатами анализа, полученными на идентичном анализируемом материале одним и тем же оператором, который использовал одно и то же оборудование в пределах самого короткого промежутка времени, не должна превышать предел повторяемости г более чем в 5 % случаев.


Значения:

Маргарин

полный транс-ретинол

х = 729 мкг/ЮОг

г= 78,4 мкг/ЮО г

13-цис-ретинол

х = 39 мкг/ЮОг

г= 8,4 мкг/ЮО г

Сухое молоко

полный транс-ретинол

х = 653 мкг/ЮОг

г= 39,2 мкг/ЮО г

13-цис-ретинол

х = 30 мкг/ЮОг

г= 4,2 мкг/ЮО г


9.3 Воспроизводимость

Абсолютная разность между результатами двух анализов идентичного материала, анализируемого в двух лабораториях, не должна превышать предел воспроизводимости R более чем в 5 % случаев. Значения:


Маргарин

полный транс-ретинол

х = 729 мкг/ЮОг

R =204,4 мкг/ЮО г

13-цис-ретинол

х = 39 мкг/ЮОг

R = 33,6 мкг/ЮО г

Сухое молоко

полный транс-ретинол

х = 653 мкг/ЮОг

R = 61,6 мкг/ЮО г

13-цис-ретинол

х = 30 мкг/ЮОг

R = 20,2 мкг/ЮО г


10 Протокол испытаний

Протокол испытаний должен содержать следующие данные:

-    всю информацию, необходимую для идентификации пробы;

-    ссылку на настоящий стандарт или на другой используемый метод;

-    результаты и единицы измерения, в которых выражены результаты;

-    дату и методику отбора проб (если известно);

-    дату получения пробы;

-дату проведения испытания;

-любые особенности, которые наблюдались в ходе проведения испытания;

-    любые операции, не установленные в настоящем стандарте или рассматриваемые в качестве дополнительных, которые могли повлиять на результаты.


7


8


Приложение А

(справочное)

Примеры высокоэффективных жидкостных хроматограмм


полный транс-ретинол

j__I_I_I_1_1_

0,1    2    и    6    min    10

л. -1-1-1    I

0,1    2    4    6    min    10

_i__I_I_I-1-i_

0,1    2    4    6    min    10


d) —


d) —


d)

колонка размер колонки подвижная фаза поток детектор


-    время;

-    Merck LiChrosorb® Si 60 (5 мкм);

-    250 х 4 мм;

-    л-гексан + л-бутанол (98 : 2) (объемные части);

-    2 мл /мин;

-    флуоресцентный, возбуждение: 325 нм, эмиссия: 475 нм.


Рисунок А.1 - Высокоэффективные жидкостные хроматограммы стандартного раствора витамина А а), витамина А в маргарине Ь) и сухого молока с)


СТБ EN 12823-1-2012

Приложение В

(справочное)

Данные прецизионности

В соответствии с Руководством по анализу сертификации EU МАТ данные, приведенные в таблице В.1, были получены в результате межлабораторных исследований [3]. Исследования проводились Institute of Food Research, Norwich, United Kingdom.

Таблица B.1

Маргарин (CRM 122)*

Сухое молоко (CRM 421) *

Проба

полный

транс

ретинол

13-цис-ретинол

полный

транс

ретинол

13-цис-ретинол

Год межлабораторного испытания

1994

1994

1994

1994

Количество лабораторий

9

5

8

5

Количество проб

2

2

2

2

Количество лабораторий, оставшихся после исключения резко отклоняющихся значений

9

5

6

5

Количество резко отклоняющихся значений (лабораторий)

0

0

2

0

Количество полученных результатов

45

25

40

21

Среднее значение х, мкг/100 г

729

39

653

30

Стандартное отклонение повторяемости sr, мкг/100 г

28

3

14

1,5

Относительное стандартное отклонение повторяемости RSDf, %

3,8

7,7

2,1

5,0

Предел повторяемости при г, мкг/100 г

78,4

8,4

39,2

4,2

Стандартное отклонение воспроизводимости Sr, мкг/100 Г

73

12

22

7,2

Относительное стандартное отклонение воспроизводимости RSDr, %

10,0

30,8

3,4

24,0

Предел воспроизводимости R, мкг/100 г

204,4

33,6

61,6

20,2

* CRM = Сертифицированный стандартный материал.

9

Приложение С

(справочное)

Альтернативные системы высокоэффективной жидкостной хроматографии

Разделение и количественное определение полного транс-ретинола и 13-цис-ретинола оказывались удовлетворительными, если соблюдались хроматографические условия, приведенные в таблице С.1 [3].

Таблица С.1

Колонка (размер частиц)

Параметры (длина х диаметр)

Подвижная фаза (объемные доли)

Детектирование

(Х/нм)

LiChrospher® Si 60 (5 мкм),

250 х 4 мм

л-гексан + 2-пропанол (98 : 2)

Ф (325/480)

LiChrosorb® Si 60 (5 мкм),

250 х 4 мм

л-гексан + л-бутанол (98 : 2)

Ф (325/475)

LiChrosorb® Si 60 (5 мкм),

250 х 4 мм

лзо-пропанол:

л-гептан, содержание градиентов от (0,5 : 99,5) до (8,5 :+ 91,5) за 12 мин

УФ 325

10

СТБ EN 12823-1-2012

Библиография

[1]    Bourgeois, C.F. and Ciba 1988. Disposal cartridge extraction of retinol and alpha-tocopherol from fatty samples. J.A.O.A.C 71 (1), 12- 15

(Удаление патронной экстракцией ретинола и альфа-токоферола из жирных образцов)

[2]    Leth, Т., 1993. Vitamin A in Danish pig, calf and ox liver. J. Food Composition & Analysis 6, 3 - 9 (Витамин А в печени датских свиней, телят и быков)

[3]    Finglas, Р.М., van der Berg, H. & de Froidmont-Gortz, I., 1997. The certification of the mass fractions of vitamins in three reference materials: margarine (CRM 122), milk powder (CRM 421), and lyophi-lized Brussels sprouts (CRM 431). EUR-Report 18039, Commission of the European Union, Luxembourg

(Сертификация массовых фракций витаминов в трех образцах маргарина (CRM 122), сухом молоке и лиофилизированной брокколи (CRM 431))

[4]    Untersuchung von Lebensmitteln: Bestimmung von Vitamin A in diatetischen Lebensmitteln L 49.00-3, Mai 1985 (Food Analysis: Determination of vitamin A in dietetic foodstuffs L 49.00-3, 1985-05) in: Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 35 LMBG: Verfahren zur Probenahme und Untersuchung von Lebensmitteln, Tabakerzeugnissen, kosmetischen Mitteln und Bedarfsgegen-standen/Bundesgesundheitsamt (In: Collection of official methods under article 35 of the German Federal Foods Act; Methods of sampling and analysis of foods, tobacco products, cosmetics and commodity goods/Federal Health Office) Loseblattausgabe, Stand Februar 1996 Bd. 1 (Loose leaf edition, as of 1996-02 Vol. I.) Berlin, Koln: Beuth Verlag GmbH

(Анализ кормов: Определение витамина А в диетических продуктах питания )

[5]    Takashima, Y. и др. Stability of retinol analogs. Chem. Pharm. Bull. 27, 1553 (Стабильность аналогов ретинола)

[6]    Bolliger, M.R. et al., 1977. The monograph of vitamin A in the European Pharmacopoeia. Pharm. Acta. Helv. 52 (8), 161-174

(Монография витамина А в Европейской Фармакопее)

[7]    Arens, М. and Gertz, Chr, 1996. Gehaltsbestimmung von Vitamin A-Standardsubstanzen - Deutsche Einheitsmethoden zur Untersuchung von Fetten, Fettprodukten, Tensiden und verwandten Stoffen, 124. Mitt.; (Determination of vitamin A content in standard substances - German methods for analysis of fats, fat products, tensids and related products, 124. ann) Fett/Lipid, VCH Verlag, Weinheim, 98, Nr. 5, S. 185-187

(Определение витамина А в стандартных веществах)

11

Приложение Д.А

(справочное)

Сведения о соответствии государственного стандарта ссылочному европейскому стандарту

Таблица Д.А.1 - Сведения о соответствии государственного стандарта ссылочному европейскому стандарту, который является идентичным международному стандарту

Обозначение и наименование ссылочного европейского стандарта

Обозначение и наименование международного стандарта

Степень

соответст

вия

Обозначение и наименование государственного стандарта

EN ISO 5555:2001 Масла и жиры животные и растительные. Отбор проб

ISO 5555:2001 Жиры и масла животные и растительные. Отбор проб

ют

СТБ ISO 5555:2009 Жиры и масла животные и растительные. Отбор проб (ISO 5555:2001, ЮТ)

12

Ответственный за выпуск В. Л. Гуревич

Сдано в набор 10.07.2012. Подписано в печать 15.08.2012. Формат бумаги 60x84/8. Бумага офсетная. Гарнитура Arial. Печать ризографическая. Уел. печ. л. 1,97 Уч.-изд. л. 0,83 Тираж экз. Заказ

Издатель и полиграфическое исполнение: Научно-производственное республиканское унитарное предприятие «Белорусский государственный институт стандартизации и сертификации» (БелГИСС) ЛИ № 02330/0552843 от 08.04.2009. ул. Мележа, 3, комн. 406, 220113, Минск.

СТБ EN 12823-1-2012

Содержание

Введение................................................................................................................................................IV

1    Область применения............................................................................................................................1

2    Нормативные ссылки...........................................................................................................................1

3    Сущность метода..................................................................................................................................1

4    Реактивы...............................................................................................................................................1

5    Аппаратура и приборы.........................................................................................................................4

6    Отбор проб............................................................................................................................................4

7    Проведение испытания........................................................................................................................4

8    Расчет...................................................................................................................................................6

9    Прецизионность результатов..............................................................................................................7

10 Протокол испытаний.............................................................................................................................7

Приложение А (справочное) Примеры высокоэффективных жидкостных хроматограмм.................8

Приложение В (справочное) Данные прецизионности...........................................................................9

Приложение С (справочное) Альтернативные системы высокоэффективной

жидкостной хроматографии.........................................................................................10

Библиография..........................................................................................................................................11

Приложение Д.А (справочное) Сведения о соответствии государственного стандарта

ссылочному европейскому стандарту......................................................................12

Введение

Настоящий стандарт «Продукты пищевые. Определение содержания витамина А методом высокоэффективной жидкостной хроматографии» состоит из двух частей:

-    часть 1: Измерение содержания полного транс-ретинола и 13-цис-ретинола.

-    часть 2: Измерение содержания р-каротина.

Настоящий стандарт представляет собой основу для аналитических методов. Он предназначен для использования в качестве основы, в которой аналитик может оценить свою собственную аналитическую работу в соответствии со стандартной процедурой.

IV

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ Определение содержания витамина А методом высокоэффективной жидкостной хроматографии Часть 1

Измерение количества полного транс-ретинола и 13-цис-ретинола

ПРАДУКТЫ ХАРЧОВЫЯ Вызначэнне змяшчэння в1тамшу А метадам высокаэфектыунай вадкаснай храматаграфМ Частка 1

Вымярэнне колькасщ поунага транс-рэтынолу i 13-цыс-рэтынолу

Foodstuffs

Determination of vitamin A by high performance liquid chromatography

Part 1

Measurement of all-trans-retinol and 13-cis-retinol

Дата введения 2013-01-01

1    Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод определения витамина А в пищевых продуктах с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Определение содержания витамина А осуществляется посредством измерения содержания полного транс-ретинола, 13-цис-ретинола и бета-каротина. В данную часть включено измерение содержания полного транс-ретинола и 13-цис-ретинола. Экстракт, полученный после омыления в данном методе, может быть использован для определения бета-каротина в соответствии с методом, установленным в EN 12823-2:2000 «Продукты пищевые. Определение содержания витамина А методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Часть 2. Определение содержания (3-каротина».

2    Нормативные ссылки

Для применения настоящего стандарта необходимы следующие ссылочные стандарты. Для недатированных ссылок применяют последнее издание ссылочного стандарта (включая все его изменения).

EN ISO 3696:1995 Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы испытаний

EN ISO 5555:2001 Масла и жиры животные и растительные. Отбор проб

3    Сущность метода

Ретинол омыляют с помощью метанольного или этанольного раствора гидроксида калия и экстрагируют посредством соответствующего растворителя. Определение проводят методом ВЭЖХ с флуорометрическим (Ф) или ультрафиолетовым (УФ) детектированием. Вещества идентифицируют на основании времени удерживания и количественно определяют с помощью метода внешнего стандарта с использованием площадей или высоты пиков [1] - [4].

4    Реактивы

В ходе анализа используют только реактивы признанной аналитической степени чистоты и воду не ниже 1-й степени в соответствии с EN ISO 3696, если нет иных указаний.

4.1    Метанол.

4.2    Этанол абсолютный, объемная доля, ср (С2Н5ОН) = 100 %.

Издание официальное

4.3    Этанол, Ф2Н5ОН) = 96 %.

4.4    Сульфат натрия, безводный.

4.5    Раствор гидроокиси калия (КОН) для омыления в соответствующих массовых концентрациях, например р (КОН) = 50 г/100 мл или 60 г/100 мл, или спиртовые растворы, например 28 г КОН в 100 мл смеси объемных частей этанола и воды 9:1.

4.6    Антиоксиданты, например аскорбиновая кислота (АК), аскорбат натрия, сульфид натрия (Na S), бутилгидрокситолуол (БГТ), пирогаллол или гидрохинон.

4.7    Растворители для экстракции, например диэтиловый эфир (без пероксида), ди-изопро-пиловый эфир, петролейный эфир (с диапазоном кипения 40 °С - 60 °С), л-гексан, бутанол или соответствующие смеси из веществ, перечисленных в настоящем пункте.

4.8    Подвижные фазы ВЭЖХ

Примеры соответствующих смесей (в объемных долях) включают в себя:

-    л-гексан + 2-пропанол (98 : 2);

-    изо-октан + 2-пропанол (98,5 : 1,5);

-    изо-октан + лзо-бутанол (98 : 2);

-    л-гексан + л-бутанол (98 : 2);

-    2-пропанол + л-гептан, градиент от (0,5 : 99,5) до (8,5 : 91,5) за 12 мин.

4.9    Стандартные вещества

4.9.1    Общие положения

Полный транс-ретинол (полный транс-витамин А, спиртовая форма) и 13-цис-ретинол существуют в нескольких формах и могут быть приобретены у различных поставщиков. Поэтому необходимо определить концентрацию калибровочного раствора спектрометрически (4.10.4). Если используются сложные эфиры витамина (например, ретинил-пальмитат или ацетат), то их концентрацию проверяют после омыления (см. 7.3.1).

Примечание - Особое внимание следует уделить информации о содержании витамина А в стандартных веществах, поставляемых различными производителями.

4.9.2    Полный транс-ретинол, спиртовая форма витамина А, М (С2оН300) = 286,5 г/моль, со степенью чистоты не менее 90 %.

4.9.3    Сложные эфиры витамина А.

4.9.3.1    Ретинил-пальмитат, витамин А, пальмитат, М (С3бН6о02) = 524,9 г/моль.

4.9.3.2    Ретинил-ацетат, витамин А, ацетат, М (С22Н3 02) = 328,5 г/моль, со степенью чистоты не менее 90 %.

4.9.4    13-цис-ретинол, М (С2оН300) = 286,5 г/моль, со степенью чистоты не менее 60 %, для качественного определения.

4.10    Основные и стандартные растворы

4.10.1    Основной раствор полного транс-ретинола

Взвешивают примерно 50 мг полного транс-ретинола (4.9.2) с точностью до 1 мг в мерной колбе с одной меткой вместимостью 100 мл, растворяют в л-гексане или другом соответствующем растворителе (4.7) и доводят раствор до отметки тем же растворителем. Основной раствор содержит приблизительно 0,5 мг/мл.

Взвешивают 100 мг ретинил-пальмитата (4.9.3.1) или 50 мг ретинил-ацетата (4.9.3.2) с точностью до 1 мг в мерной колбе с одной меткой вместимостью 100 мл и проводят манипуляции, как описано для полного транс-ретинола, кроме концентраций, которые будут определяться после омыления (7.3.1).

Альтернативные массы и объемы могут использоваться по 4.10.4 в соответствии с хроматографическим разделением и количественным определением.

Хранят основной раствор в защищенном от света месте при температуре не выше 4 °С.

4.10.2    Основной раствор 13-цис-ретинола

Взвешивают примерно от 1 до 2 мг 13-цис-ретинола (4.9.4) с точностью до 0,1 мг в мерную колбу с одной меткой вместимостью 100 мл, растворяют в абсолютном этаноле (4.2) или в другом соответствующем растворителе и доводят раствор до метки. Раствор содержит приблизительно от 10 до 20 мкг/мл, его используют только для идентификации. 1

СТБ EN 12823-1-2012


4.10.3    Стандартный раствор полного транс-ретинола

Пипеткой переносят 5 мл основного раствора полного транс-ретинола (4.10.1) в мерную колбу с одной меткой вместимостью 100 мл и доводят до метки л-гексаном (4.7) или другим соответствующим растворителем, совместимым с подвижной фазой. Пипеткой переносят 5 мл этого раствора в мерную колбу с одной меткой вместимостью 50 мл и доводят до метки тем же растворителем. Концентрация транс-ретинола в стандартном растворе приблизительно равна 2,5 мкг/мл. Затем проводят проверку его концентрации и чистоты в соответствии с 4.10.4.

Основные растворы ретинил-пальмитата или ретинил-ацетата (4.10.1) можно использовать для приготовления стандартного раствора. В этом случае омыляют растворы в условиях, описанных в 7.3.1. После экстракции и выпаривания повторно растворяют остаток в л-гексане или ином соответствующем растворителе и далее проводят манипуляции, как в случае с основным раствором полного транс-ретинола.

Хранят стандартный раствор в защищенном от света месте при температуре не выше 4 °С.

4.10.4    Проверка концентрации и чистоты

Готовят стандартный раствор полного транс-ретинола в этаноле и измеряют оптическую плотность в кварцевой кювете с длиной оптического пути 1 см при максимальной длине волны от 325 до 326 нм с этанолом в сравнительной кювете.

Вычисляют массовую концентрацию полного транс-ретинола рац.т, мкг/мл, по формуле


са11 Т -


А -104 с|И-Т 1 ц р

1830


(1)


Вычисляют массовую концентрацию pi3cis 13-цис-ретинола, мкг/мл, по формуле

с =Азс:84 р 13015 1686


(2)


где АаМ_т -

^13ds

1830-


1686-


Р -


значение абсорбции при максимальной длине волны от 325 до 326 нм; значение абсорбции при максимальной длине волны 328 нм;

значение Е1"7" для полного транс-ретинола, растворенного в этаноле. Это значение

может изменяться в зависимости от вида используемого растворителя;

значение Е|* для 13-цис-ретинола, растворенного в метаноле. Это значение может

изменяться в зависимости от вида используемого растворителя;

поправочный коэффициент для чистоты полного транс-ретинола или 13-цис-

ретинола, определенный с помощью ВЭЖХ, вычисляют по формуле


где В - площадь пика или высота стандартного раствора полного транс-ретинола или 13-цис-ретинола (4.10.3);

Btotai - суммарная площадь пиков или высот стандартного раствора полного транс-ретинола и 13-цис-ретинола (4.10.3).

При использовании стандартных веществ витамина А, вновь приобретенного или хранящегося в течение длительного периода, проверяют, находится ли значение максимальной абсорбции стандартного раствора полного транс-ретинола (4.10.3) в диапазоне длин волн между 325 и 326 нм, используя соответствующий спектрометр.

Для дальнейшей проверки показателей витамина А измеряют оптическую плотность стандартного раствора в кварцевой кювете при длине волны 300, 350 и 370 нм относительно 2-пропанола (или другого подходящего растворителя, см. 4.7). Определяют следующее соотношение для каждой длины волны:

Е

-для полного транс-ретинола.

^325

Если это соотношение не превышает 0,602 (300 нм), 0,452 (350 нм) и 0,093 (370 нм) для спиртовой формы витамина А, то стандартное вещество пригодно для использования [5], [6].

Для ретинил-пальмитата (4.9.3.1) определяют соотношение Е/Е326 при длине волн 300, 350 и 370 нм относительно 2-пропанола (или другого подходящего растворителя). Если соотношение не превосходит 0,593 (300 нм), 0,537 (350 нм) и 0,142 (370 нм), то стандартное вещество пригодно для использования по [5], [6], [7].


3


5    Аппаратура и приборы

Для проведения измерений используют стандартное лабораторное оборудование.

5.1    УФ-ВОС спектрометр, применяемый для измерения оптической плотности при определенной длине волны, с кварцевыми кюветами с длиной оптического пути 1 см.

5.2    Роторный испаритель, с водяной баней и вакуумным насосом.

Примечание - Рекомендуется использовать азот для восстановления атмосферного давления.

5.3    Система ВЭЖХ, состоящая из высокоэффективного жидкостного хроматографа, насоса, устройства для ввода пробы, УФ-ВОС детектора или флуоресцентного детектора и интегратора дан-ных/устройства обработки данных.

5.4    Колонки для ВЭЖХ

Применяют аналитические стандартные колонки, например LiChrospher® Si 60 2 (5 мкм, 250 х 4 мм) и LiChrosorb® Si 60    (5    мкм, 250 х 4 мм и 125 х 4 мм). Критерий выбора подходящей колонки основан

на разделении полного транс-ретинола и 13-цис-ретинола.

Допускается использовать колонки других типов и размеров, отличающиеся от установленных в настоящем стандарте. Условия для проведения хроматографии должны быть подобраны к таким колонкам с целью гарантии получения адекватных результатов.

5.5    Устройство для фильтрования

Чтобы отфильтровать подвижные фазы ВЭЖХ и растворы проб, используют устройства для фильтрации крупных и небольших размеров соответственно, например с размером пор 0,45 мкм.

Примечание - Фильтрация подвижной фазы, а также раствора анализируемой пробы через мембранный

фильтр перед использованием или введением увеличивает долговечность колонок.

5.6    Экстракционные колонки (дополнительные), например Extrelut®1).

5.7    Фильтры для разделения фаз (дополнительные).

6    Отбор проб

Отбор проб проводят в соответствии с EN ISO 5555.

7    Проведение испытания

7.1    Общие положения

Витамин А чувствителен к УФ-излучению и окислителям (например, атмосферному кислороду). Поэтому необходимо исключить воздействие УФ-света (используя посуду из темного стекла, алюминиевую фольгу или УФ-абсорбционные материалы) и кислорода (промывание азотом) при работе с ним. В частности, воздух над жидкостью при омылении должен быть вытеснен слоем азота. Испарение растворителей должно проводиться при пониженном давлении с использованием ротационного испарителя (5.2) при температуре не выше 50 °С.

7.2    Приготовление пробы

Анализируемую пробу гомогенизируют. Измельчают грубый материал при помощи мельницы и тщательно перемешивают. Чтобы предотвратить длительное воздействие на пробу высокой температуры, ее необходимо предварительно охладить.

7.3    Приготовление раствора пробы

7.3.1 Омыление

Омыляют от 2 до 10 г анализируемой пробы желательно в атмосфере азота, используя соответствующее количество метанола (4.1) или этанола (4.3), антиоксиданты (4.6) (необязательно) и один из растворов гидроксида калия (4.5). Если используют такие антиоксиданты, как аскорбиновая кислота (АК), пирогаллол или бугилгидрокситолуол, то их необходимо добавлять к пробе перед внесением раствора гидроксида калия. Можно также добавить сульфид натрия, чтобы устранить влияние окислительного каталитического воздействия следовых количеств металлов.

СТБ EN 12823-1-2012

Примеры подходящих соотношений реагентов приведены в таблице 1. Таблица 1

Масса пробы, г

Спирт

Антиоксидант

Гидроксид калия

2-5

50 мл метанола

0,25 г АК

5 мл раствора с концентрацией 50 г/100 мл

5-10

100 мл этанола

1 г АК + 0,04 г Na2S

20 мл раствора с концентрацией 60 г/100 мл

10-20

150 мл этанола

1 гАК

50 мл раствора с концентрацией 60 г/100 мл

Омыление обычно длится от 15 до 40 мин при температуре от 80 °С до 100 °С. Омыление также может быть проведено при комнатной температуре в течение ночи (приблизительно 16 ч) при тех же условиях.

Если после омыления и охлаждения на поверхности омыленной смеси присутствует жир или масло, добавляют дополнительное количество этанолового раствора гидроксида калия и увеличивают время омыления.

7.3.2    Экстрагирование

Во избежание образования эмульсии количество воды, которую добавляют в омыленный раствор пробы, должно быть таким, чтобы соотношение спирта к воде в конечном растворе было 1:1.

Экстрагирование ретинола из омыленного раствора пробы проводят соответствующим растворителем или соответствующей смесью растворителей (4.7) и процедуру повторяют 3-4 раза с объемами растворителя от 50 до 150 мл. Промывают комбинированные экстракты водой до нейтральной среды (2-4 раза, объем воды от 50 до 150 мл). Экстрагировать также можно с помощью системы жидкостной экстракции (например, Extrelut@ 2>), если содержание ретинола не очень низкое и содержание жира в пробе меньше 10 % [1].

7.3.3    Концентрирование

Экстракт отгоняют на ротационном испарителе (5.2) при пониженном давлении и температуре не более 50 °С. Удаляют следы воды высушиванием с сульфатом натрия (4.4) или посредством азеотропной перегонки с абсолютным этанолом (4.2) или используют фильтровальную бумагу для разделения фаз (5.5).

7.3.4    Разведение

Повторно растворяют остаток в подвижной фазе (4.8) или в другом совместимом с ВЭЖХ растворителе для получения соответствующей концентрации для ввода в колонку ВЭЖХ (5.4). Это раствор анализируемой пробы.

7.4    Приготовление стандартных растворов

Используя стандартные растворы (4.10.3), готовят градуировочные растворы для ВЭЖХ, используя соответствующие растворители, удовлетворяющие аналитическим требованиям.

7.5    Идентификация и проверка чистоты

Идентифицируют полный транс-ретинол и 13-цис-ретинол, сравнивая время удержания пробы с временем удержания стандартных растворов, полученным при тех же условиях хроматографирования. Также идентификацию пиков можно осуществить, добавляя стандартные вещества в раствор анализируемой пробы.

Примечание 1 - Разделение и количественное определение будут удовлетворительными, если будут выполняться следующие хроматографические условия (также рисунок А.1). Для альтернативных систем ВЭЖХ

Колонка:

Размер колонки: Подвижная фаза:

Поток:

Объем введенной пробы: Детектор:

см. таблицу С.1.

Merck LiChrosorb® Si 60,5 мкм 250 х 4 мм

гексан + л-бутанол (98 + 2) (объемные части)

2 мл/мин 50 цм

флуоресцентный, возбуждение: 325 нм, эмиссия: 475 нм УФ: 325 нм

2)См. сноску1).

5

Проверяют чистоту стандартных растворов полного транс-ретинола и 13-цис-ретинола посредством ввода соответствующего объема (например, 20 мкл) стандартного раствора (4.10.3), содержащего приблизительно 10 мкг полного транс-ретинола или 13-цис-ретинола в микролитре, в систему ВЭЖХ. Интегрируют площади или высоту пиков полного транс-ретинола и 13-цис-ретинола и, если необходимо, корректируют массовую концентрацию стандартного раствора полного транс-ретинола. Примечание 2 - Свежеприготовленный стандартный раствор полного транс-ретинола (4.10.3) обычно не содержит 13-цис-ретинола или других пиков, указывающих на присутствие примесей. Эфирная форма витамина А (ретинил-пальмитат или ацетат) может содержать некоторое количество 13-цис-ретинола после омыления.

7.6    Определение

Вводят соответствующий объем (например, 20 мкл) стандартного раствора (4.10.3) и раствора анализируемой пробы (7.3.4) в систему ВЭЖХ (5.3). Чтобы провести определение методом внешнего стандарта, интегрируют площади пиков или определяют высоту пиков, полученных при исследовании раствора анализируемой пробы, и сравнивают результаты с соответствующими значениями стандартных веществ, имеющих подобное время удержания, или строят калибровочную кривую.

Вводят равные объемы раствора анализируемой пробы и стандартных растворов, приготовленных с использованием растворителей, совместимых с ВЭЖХ-системой, или компенсируют в вычислениях результаты соответствующей поправкой (раздел 8). Проверяют линейность калибровочной кривой. Примечание - Метод внутреннего стандарта также может быть использован, если в результате соответствующих испытаний получены такие же характеристики внутреннего стандарта, как и самого анализируемого вещества. Кроме того, соответствующие вещества могут быть добавлены к раствору анализируемой пробы перед вводом в колонку ВЭЖХ для количественного определения [6].

7.7    Количество определений

Выполняют не менее двух независимых определений.

8 Расчет

Вычисления основывают либо на определении по калибровочному графику в линейной области или по следующей упрощенной процедуре.

Вычисляют массовую концентрацию paii-trans полного транс-ретинола в пробе, мг/100 г, по формуле

100

А.н.т-т уЮОО ’

где As - площадь пика или высота полного транс-ретинола, полученные при исследовании раствора анализируемой пробы (7.3.4), в единицах площади или высоты;

Can-т - концентрация полного транс-ретинола, измеренная УФ-спектрометром (5.1) в стандартном растворе (7.4), мкг/мл;

Vs - общий объем раствора анализируемой пробы (7.3.4), мл;

Vst - объем введенного стандартного раствора (7.4), мкл;

100 - коэффициент пересчета массовой концентрации на 100 г;

Aaii-т - площадь пика или высота, полученные при исследовании стандартного раствора полного транс-ретинола (7.4), в единицах площади или высоты;

т - масса навески пробы, г;

\4    - объем введенного раствора анализируемой пробы, мкл;

1000 - коэффициент пересчета микрограммов в милиграммы.

Вычисляют массовую концентрацию pi3-cis 13-цис-ретинола, мг/100 г, по формуле

(5)

где A13.s

Call-T

Уз

Vst

100

Аац-т

Аз-s ca„_T y5 yst юо А„-т Уту1000 ’

площадь пика или высота 13-цис-ретинола, полученные при исследовании раствора анализируемой пробы (7.3.4), в единицах площади или высоты; концентрация полного транс-ретинола, измеренная с помощью УФ-спекгрометра (5.1) в стандартном растворе (7.4), мкг/мл; общий объем раствора анализируемой пробы (7.3.4), мл; объем введенного стандартного раствора (7.4), мкл; коэффициент пересчета массовой концентрации на 100 г;

площадь пика или высота полного транс-ретинола, полученные при исследовании стандартного раствора (7.4), в единицах площади или высоты;

6

1

2

LiChrospher™ Si 60 - это пример продукта, имеющегося в продаже. Эта информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламой CEN указанного продукта.