Товары в корзине: 0 шт Оформить заказ
Стр. 1 

27 страниц

257.00 ₽

Купить МУ 3049-84 — бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль"

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

Способы доставки

  • Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
  • Курьерская доставка (7 дней)
  • Самовывоз из московского офиса
  • Почта РФ

 Скачать PDF

Консультация по подбору ГОСТабесплатно

Оглавление

Отбор проб, санитарный контроль и отчетность

     1. Аппаратура

     2. Компоненты питательных сред

     3. Реактивы

     4. Питательные среды

     5. Буферные растворы

     6. Выращивание тест-культур и приготовление рабочих концентраций

Стр. 1
стр. 1
Стр. 2
стр. 2
Стр. 3
стр. 3
Стр. 4
стр. 4
Стр. 5
стр. 5
Стр. 6
стр. 6
Стр. 7
стр. 7
Стр. 8
стр. 8
Стр. 9
стр. 9
Стр. 10
стр. 10
Стр. 11
стр. 11
Стр. 12
стр. 12
Стр. 13
стр. 13
Стр. 14
стр. 14
Стр. 15
стр. 15
Стр. 16
стр. 16
Стр. 17
стр. 17
Стр. 18
стр. 18
Стр. 19
стр. 19
Стр. 20
стр. 20
Стр. 21
стр. 21
Стр. 22
стр. 22
Стр. 23
стр. 23
Стр. 24
стр. 24
Стр. 25
стр. 25
Стр. 26
стр. 26
Стр. 27
стр. 27

ГОСУДАРСТВЕННОЕ

САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЕ НОРМИРОВАНИЕ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

т шшашвт

Часть 12

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Сборник

методических документов, необходимых для обеспечения применения Федерального закона от 12 июня 2008 г. № 88-ФЗ «Технический регламент на молоко и молочную продукцию»

Часть 12

4. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

Среда № 1 Дистиллированная вода - 10,0 мл Агар-агар    - 6,0 г ±    0,1

pH среды    -    8,0


Стерилизация автоклавированием при 121 °С±1°С 20 мин ± 3 мин


Среда № 2 Пептон

Хлористый натрий Агар-агар Мясная вода 1 : 2 pH среды

-    10,0 г    Стерилизация    автоклавированием

-5,0.г    при    121    °С    ±    1    °С

-    20,0 т    20    мин    ±    3    мин

-    до 1000 мл -7,0 ±0,1

Среда №3

Бульон Хоттингера с содержанием аминного азота 100 мг%- 1000 мл Агал-агар 20,0 ±0,1

Глюкоза /добавляют в расплавленный агар 40 % глюкозу в количестве 2,5 мл на 100 мл среды/

pH среды после стерилизации 6,4 ± 0,1 Стерилизация автоклавированием

при 121 °С± 1 °С 20 мин ± 3 мин

Среда № 4

Бульон Хоттингера с содержанием аминного азота 33 мг% - 1000 мл Агар-агар    - 25,0 ± 0,1 г Стерилизация автоклавированием

pH среды    - 6,1 ± 0,1    при 121 °С ± 1 °С

20 мин ± 3 мин

Среда № 5

- 20,0 ± 0,1 г    Стерилизация автоклавированием

- 2,5 ± 0,05 г    при 121 °С ± 1 °С

- 7,9 ± 0,1    20 мин ± 3 мин

Бульон Хоттингера с содержанием аминного азота 33 мг% - 1000 мл

Среда № 6 Пептон

Натрий, хлористый Агар-агар Мясная вода 1 : 2 pH среды

Агар-агар NaHP0pH среды

-10,0 ± 0,1 г    Стерилизация автоклавированием

-    5,0 ± 0,05 г при 121 °С ± 1 °С

-    20,0 ± 0,1 г 20 мин +3 мин

-    до 1000 мл -6,5 ±0,1

52

Среда № 7 Пептон    -6,0 ±0,1 г

Панкреатический гидролизат казеина, сухой - 4,0 ± 0,05 г, /или 40,0 ± 1 мл жидкого/

Дрожжевой экстракт, сухой - 3,0 ± 0,05 г /или 30,0 ± 1 мл жидкого/

Мясной экстракт, сухой - 1,5 ± 0,01 г /или 15,0 ± 0,5 мл мясной воды/ Глюкоза    - 1,0 ± 0,01 г Стерилизация автоклавированием

Агар-агар    - 20,0 ± 0,1 г при 115 °С ±3 °С- 20мин ± 3 мин

Вода дистиллированная - до 1000 мл pH среды    - 6,5 ± 0,1

Среда № 8

Мясная вода 1:2    - 500 ± 1 мл Стерилизация автоклавированием

Пептон    -5,0 ±0,05 г при 121 °С± 1 °С-20мин±3 мин

Хлористый натрий    - 2; 5 г

Фосфат калия двухзамещенный - 3,0г

Агар-агар    - 6,0

Вода дистиллированая до 1000 мл

pH среды    - 7,8—8,0

Стерилизация автоклавированием при 121 °С ± 1 °С - 20 мин ± 3 мин

5. БУФЕРНЫЕ РАСТВОРЫ для экстракции антибиотиков из исследуемого материала

1. Физиологический раствор NaCl - 8,5 г Н20 - до 1 л

Стерилизация автоклавированием при 121 °С ± 1 °С 20 мин ± 3 мин


2. Цитратно-солянокислый, pH 5,1 ± ОД лимонно-кислый натрий - 20,6 г НС1, уд. вес 1,19    -    1,81    мл

Н20    -    до    1    мл


3.2% раствор пепсина на цитратно-солянокислом буфере с pH 5,1 ± 0,1


/Асептично взвешенную навеску пепсина вносят в стерильный буфер перед проведением анализа/

Стерилизация автоклавированием при 121 °С ± 1 °С 20 мин ± 3 мин


пепсин медицинский    - 2 г

буфер    -100    мл


4. Фосфатный буфер, pH 6,0 КН2Р04 - 7,72 г или КН2Р04 - 2 г NaHP04 - 1,78 г    К2НР04 - 8 г

Н20-до1л    Н20-до1л


53


5.2 % раствор пепсина на фосфатном буфере с pH 6,0


пепсин медицинский - 2 г буфер    -100    мл

6. Фосфатный буфер pH 7,9 ± 0,1 К2НР04 -16,73 г КН2Р04 - 0,523 г Н20 - до 1 л

/Асегггично взвешенную навеску Пепсина вносят в стреильный буфф перед проведением анализа/

Стерилизация автоклавированием при 121 °С ± 1 °С - 20 мин ± 3 мин


7. Цитратно-солянокислый, pH 3,1 ± 0,1

I    раствор - 22,6 г лимоннокислого натрия растворяют в 1 л воды;

II    раствор - 8,2 мл конц. НС1 с уд* весом 1,19 растворяют в 1 л дистиллированной воды

Буфер готовят при смешивании двух растворов;

62 мл I раствора + 100 мл II раствора, pH буфера 3,0 ± ОД

Стерилизация - 121 °С ± I °С - 20 мин ± 3 мин.

6. ВЫРАЩИВАНИЕ ТЕСТ-КУЛЬТУР И ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАБОЧИХ КОНЦЕНТРАЦИЙ

Тест-культурами служат специально отобранные, образующие и необразующие опоры, непатогенные или условнопатогенные штаммы микроорганизмов, обладающие высокой чувствительностью к антибиотикам. Они должны хорошо расти на применяемых средах, образуя сплошной газон и четко очерченные зоны задержки роста в местах диффузии антибиотиков в агар,

6.1. Приготовление спор Вас. cereus АТСС 11778

Культуру высевают в пробирки со скошенный агаром /2 % МПА, pH 7,1 ± ОД/ и выращивают при 29,0 ± 1,0 °С в течение 20,0 ± 2,0 часов. Эту культуру смывают со скошенного агара 80 ± 2,0 мл стерильной дистиллированной воды. Весь объем образовавшейся суспензии вносят в матрацы с 200 ± 1,0 мл 2 % МПА и выращивают в течение 7 дней при температуре 30 °С. Через 7 суток из культуры готовят мазки, окрашивают по Граму и, если в поле зрения содержится 80—90 % спор, культуру смывают 50 мл стерильной дистиллированной вода. Взвесь спор прогревают на водяной бане при 65—70 °С в течение 30,0 ±1,0 мин, трижды центрифугируют при 3 тыс. оборотов в минуту в течение 10 мин, каждый раз промывая осадок стерильной дистиллированной водой до полу-

чения прозрачной надосадочной жидкости. Промытую взвесь спор прогревают вновь на водяной бане 30,0 + 1,0 мин при 65—70 °С. Полученную взвесь спор стерильно разливают в пробирки или ампулы, запаивают и хранят при температуре не выше 4 °С и используют до тех пор, пока споры образуют хороший газон и четко очерченные края зон.

6.2. Приготовление рабочей концентрации Вас cereus АТСС 11778.

Небольшое количество /0,2 мл/споровой взвеси Вас. сегеш вносят в стандартную пробирку с 5 мл стерильного физиологического раствора и хорошо перемешивают. По стандарту мутности на 5 ед полученную взвесь доводят до концентрации 5 х 108 микробных тел в 1 мл. Затем 0,2, мл данной взвеси вносят в 100 мл расплавленной и охлажденной до 60 ° питательной среды. В итоге нагрузка тест-культуры в питательной среде составляет 106 спор в 1 мл.

6.3. Выращивание спор Bac.micoidis 537.

Культуру пересевают на скошенный агар 12 % МПА, среда № 2, pH 7,9 ± 0,1/ и выращивают при 37 °С в течение 20 ± 2,0 часа. В мазках культуры должны быть обнаружены грамположительные палочки с закругленными концами, располагающиеся отдельно или цепочками. Затем эту культуру со скошенного агара смывают 7 ± 2,0 мл стерильной дистиллированной воды. Образовавшуюся суспензию вносят в матрацы с 2 % агаризированной средой, приготовленной на бульоне Хотгингера с содержанием 33 мг% аминного азота, pH 6,1 ±0,1 /среда №4/. Засеянные матрацы выдерживают при 37 °С в течение 7 дней, после чего готовят мазки и, если в мазках, окрашенных по Граму, имеется в поле зрения 85 ± 5,0 % спор, культуру смывают стерильной дистиллированной водой.

Полученную взвесь спор прогревают при 65—40 °С в течение 30 мин, а затем поступают также, как и при получении спор. Вас. АТСС 11778, п. 6.1.

55

Таблица 1

Тест-культуры, питательные среды, буферные растворы, рабочие концентрации стандартов антибиотиков, применяемые для определения антибиотиков в пищевых продуктах

Антибиотик

Тест-микроб

Ориентировочная посевная доза на 1 мл среды

Пита

тельные

среды

Буферные

растворы

Кол-во среды на чашку

Рабочая концентрация стандарта антибиотика в мкг/мл

Тетрациклины

Bac.cereus АТСС 11778

1 млн спор

№ 2, Ха 3

Ха 2, Ха 3

10мл

0,05

Стрептомицин

Вас. mycoidis 537

20 млн спор

№2,№4

Ха 4, Хаб

10 мл

2,0

Пенициллин

Sur. lutea АТСС 9341

15 млн микробных тел

№7

Ха 4, Ха 5

10 мл

0,05

Гризин

Вас. cubtilis АТСС 6633

5 млн спор

№5, №6, Ха 8,

Ха 1, Ха 7

10

0,4

Цинкбацитра-

цин

М. flavus АТСС 10240

10 млн микробных тел

Хаб

10

0,1

6.4. Приготовление рабочей концентрации Вас. mycoidis 537

В стандартную пробирку с 5 мл стерильной дистиллированной воды добавляют 0,1—0,2 мл взвеси спор Вас. mycoidis 537 и по стандарту мутности на 10 ед разводят споры до 1 млрд микробных тел в 1 мл. Взвесь спор вносят в охлажденную до 60 °С питательную среду из расчета 20 млн спор в 1 мл среды, т. е. 2 мл 1 млрд взвеси в 100 мл среды.

6.5. Выращивание S. lutea АТСС 9341 и приготовление микробной взвеси

Культуру выращивают в течение 20 ± 2,0 час. в пробирках со средой № 7, после чего её смывают стерильным физиологическим раствором и хранят при 4 °С, Микробную взвесь суточной культуры разводят до 1 млрд микробных тел также, как и Вас. mycoidis 537. Готовую взвесь засевают в расплавленную и остывшую до 50 °С питательную среду № 7 из расчета 30 млн микробных тел на 1 мл среды, т. е. 3 мл 1 млрд взвеси на 100 мл среды.

56

6.6. Выращивание спор Вас. cubtilis АТСС 6633.

Культуру высевают в пробирки со скошенным агаром / 2 % МПА, pH 6,5 ± 0,1/ и выращивают при 37 °С в течение 18—20 часов. Затем эту культуру со скошенного агара смывают 7 ± 2,0 мл стерильной дистиллированной воды и засевают матрацы с 2 % агаризированной средой, приготовленной на бульоне Хоттингера с содержанием 33 мг% аминного азота, pH 7,9 ± 0,1 /среда № 5/. Выращивают при 37 °С в течение 7 суток, а затем поступают также как при получении спор Вас. cereus АТСС 11778.

6.7. Приготовление взвеси спор Вас. cubtilis АТСС 6633.

В стандартную пробирку с 5 мл стерильной дистиллированной воды добавляют небольшое количество /0,1—0,2 мл/ споровой взвеси Вас. cubtilis АТСС 6633 и хорошо перемешивают. По стандарту мутности на 5 ед полученную взвесь доводят до концентрации 5 х 108 спор в 1 мл. Затем 1 мл данной взвеси вносят в 100 мл расплавленной и охлажденной до 60 °С ± 1 °С питательной среды.

6.8. Выращивание М. flavus АТСС 10240.

Культуру выращивают в пробирках со скошенным МПА с pH 6; 5 ± 0,1 / среда № 6 /. Используется суточная культура тест-микроба, выращенная на скошенном МПА pH 6,5 ±0,1 при 37 °С в течение 19 ± 1,0 час. Выращенную культуру смывают физиологическим раствором, разводят до 1 млрд микробных тел по стандарту мутности на 10 ед. Готовую взвесь засевают в расплавленную и остывшую до 50 °С питательную среду из расчета 1 мл 1 млрд взвеси на 100 мл среды.

7. ПРИГОТОВЛЕНИЕ КОНТРОЛЬНЫХ /РАБОЧИХ/ КОНЦЕНТРАЦИЙ СТАНДАРТНЫХ АНТИБИОТИКОВ.

При определении остаточных количеств антибиотиков для приготовления контрольных концентраций используют стандарты антибиотиков т. е. очищенные образцы препарата, содержащие строго определенное количество единиц действия в 1 мг.

7.1. Приготовление рабочей концентрации хлортетрациклина /ХТЦ/.

Произвольную навеску хлортетрациклина /5—15 мг/ растворяют в 0,1 н соляной кислоте в соотношении 1 :1 /1 мг антибиотика растворяют

57

в 1 мл кислоты/ и получают основной раствор. Далее по схеме № 1 на буфере № 2 готовят контрольное разведение антибиотика.

Пример: Стандарт ХТЦ содержит 930 ед/мг. Навеску в 10 ± 0,0001 мг растворяют в 10 ± 0,0001 мл 0,1 н НС1. Основной раствор содержит 930 ед/мл. Из основного раствора готовят контрольное разведение, равное 0,05 ед/мл.

Схема № 1

ш*

раствора

Соотношение растворов

Концентрация антибиотиков ед/мл

1

1 мл основного раствора + 8,3 буфера pH 5,2

100

2

1 мл раствора № 1 + 9 мл буфера pH 5,2

10

3

0,1 мл р-ра № 2 + 9,9 мл -м-

0,1

4

5 мл раствора № 3 + 5 мл -1'-

0,05

Основной раствор хранится в холодильнике 30 суток.

7.2. Приготовление контрольной концентрации стрептомицина.

Навеску стандарта растворяют в фосфатном буфере pH 6,0 /К« 4/ в соотношении 1 : 1 /1 мг антибиотика растворяют в 1 мл буфера/. Этот раствор является основным и хранится в холодильнике до 30 дн. Из основного раствора на фосфатном буфере pH 7,9 ± 0,1 /буф. № 6/ готовят рабочую концентрацию стрептомицина, равную 2 ед/мл.

Основной раствор хранится в холодильнике 30 суток.

Схема № 2

№№

раствора

Соотношение растворов

Концентрация антибиотика, ед/мл

1

1 мл основного раствора + 9 мл буфера pH 7,8 ±0,10

76

2

1 мл 1 раствора + 9 мл

7,6

3

1 мл 2 раствора + 3,8 мл - -

2,0

7.3. Приготовление контрольной концентрации пенициллина.

Навеску пенициллина растворяют в фосфатном буфере pH 6,0 /буф. № 4/ в соотношении 1 : 1, т. е.1 мг антибиотика в 1 мл буфера. Этот раствор является основным и хранится в холодильнике 7 дней. Из него на том буфере готовят контрольную концентрацию пенициллина -

0,05 ед/мл.

58

Схема Ns 3

Примерная схема приготовления растворов пенициллина из стандартного активностью 1586 ед/мл

Ш&

раствора

Соотношение растворов

Концентрация антибиотика, ед/мл

1

0,6 мл стандартного раствора + 0,4 мл буфера pH 6,0

1000

2

0,1 мл раствора + 9,9 мл буфера pH 6,0

10

3

1 мл 2 раствора + 9 мл ~и-

1

4

1 мл 3 раствора + 9 мл

0,1

5

1 мл4раствора + 1 мл

0,05

7.4. Приготовление контрольной концентрации гризина.

Для приготовления основного раствора берут произвольную навеску стандарта гризина / 5—15 иг/ и растворяют её в 0,01 н НС1 из, расчета 1 мг или 1000 ед/мг.

Основной раствор хранится в течение 30 дней. Дальнейшие разведения делают на буфере № 7 / pH 3,2/ по схеме № 4.

Схема Ns 4

раствора

Соотношение растворов

Концентрация антибиотика, ед/мл

1

1 мл основного раствора + 9 мл буфера

100

2

1 мл раствора № 1 + 9 мл - -

10

3

4 мл раствора №2 +6 мл

4

7.5. Приготовление контрольной концентрации бацитрацина.

Для приготовления основного раствора стандарта бацитрацина берут произвольную навеску стандарта бацитрацина /10—20мг/ и растворяют её в фосфатном буфере pH 6,0 /буфер № 4/ до получения концентрации 100 ед/мл.

Основной раствор стандарта бацитрацина можно хранить в течение 30 дней. Из основного раствора готовят /рабочее/ контрольное разведение, равное 0,2 ед/мл по схеме № 5.

Схема № 5

раствора

Соотношение растворов

Концентрация антибиотика, ед/мл

1

1 мл основного раствора + 9 мл буфера

10

2

2 мл раствора № 1 + 8 мл

2

3

1 мл раствора № 2 + 9 мл

0,2

59

8. ПОДГОТОВКА ЧАШЕК ПЕТРИ.

Колбы с агаром помещают в кипящую водяную баню. Дня определения тетрациклинов используется среда № 3, стрептомицина - №4, пенициллина Х° 7, гризина - № 8, цинкбацитрацина - Ха 6, Расплавленный агар охлаждают до определенной температуры и вносят в него необходимое количество взвеси тест-культуры: аспорогенные культуры /Sur. lutea, М. flavus/ засевают при температуре среды не выше 48 °С ± 2 °С, а споровые /Вас. cereus, Вас. cubtilis. Вас. mycoidis/ при 58°±2,0°С. Среду перемешивают круговыми движениями и разливают в чашки Петри по 10,0 ± ОД мл, установленные строго на горизонтальном столе.

После застывания сред под дно чашек подкладывают трафарет /рис. 1/ и пробочным сверлом Ха 3 /9 мм/ вырезают 6 лунок, вырезанные блоки вынимают скальпелем,

9. ХОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ.

9Д. Исследование молока, молочных продуктов, яиц.

Пробы молока и жидких молочных, продуктов по 10,0 ±0,1 мл, творога по 10,0 ± ОД г вносят в колбочки емкостью 50 мл и добавляют 10,0 ± ОД мл буферного раствора соответственно определяемому антибиотику, т. е. при определении тетрациклинов - буфер Ха 3; для стрептомицина - буфер Ха 6; пенициллина - буфер Ха 5 /см. раздел 5, Буферные растворы для экстрагирования антибиотиков/. Таким образом, получается разведение 1 :2.

Яйца, предназначенные для исследования, предварительно прогревают на водяной бане при 65,0 ± 5,0 °С в течение 10 ± ОД мин. Яйца освобождают от скорлупы, затем отвешивают по 10,0 ± 0,1 г смешанного содержимого каждого яйца в колбочки и приливают 10,0 + 0,1 мл буфера соответственно определяемому антибиотику, т. е. при определении тетрациклинов - буфер Ха 3, стрептомицина - буфер Ха 6.

Подготовленные пробы помещают в термостат для экстракции антибиотиков на 90,0 ± 1 мин. при 37 °С ± 0,1 °С, периодически встряхивая содержимое колбочек, после чего смесь прогревают на водяной бане при температуре 60,0 ± 1,0 °С в течение 20,0 ± ОД мин.

Пробы переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют при 3000 ± 100 об/мин в течение 10,0 ± ОД мин. Надосадочная жидкость является первым разведением /1 : 2/ и готова для внесения в лунки. Второе разведение /1 :4/ готовят в химических пробирках - 1,0 ±0,1 мл

надсадочной жидкости приливают к 1,0 ± 0,1 мл буфера соответственно определяемому антибиотику (без пепсина).

В подготовленные для исследований на соответствующий антибиотик чашки Петри, в три заранее отмеченные стеклографом лунки, вносят контрольное разведение стандарта, соответствующего определяемому антибиотику, по 0,05 ± 0,01 мл, а в три другие вносят такое же количество одного из разведений испытуемых растворов. Для каждого антибиотика на одну пробу необходимо 2—4 чашки Петри, т. е. на каждое раз-ведение по 1—2 чашки.

После внесения в лунки экстрактов и стандарта антибиотика с определяемой концентрацией чашки помещают в термостат на 20 ± 2 часа при температуре 29 ± 1,0 °С /при определении тетрациклинов и пенициллина/ или при 37 ± 1,0 °С /при определении стрептомицина/.

На следующий день замеряют зоны задержки роста тест-культуры и производят расчет содержания антибиотиков в исследуемых продуктах/п.п. 10.1/.

9.2. Исследование мяса и мясных продуктов.

Навески по 10,0 ±0,1 г. мышечной ткани, почки, печени, легкого и др. органов, вырезанные из средней части образца, измельчают режущим инструментом с последующим растиранием в ступке с кварцевым песком /предварительно простерилизованным/, приливая 20,0 ±0,1 мл буфера соответственно определяемому антибиотику, т. е. при определении тетрациклинов - буфер №3, цинкбацитрацина -№ 4, гризина-физиологический раствор /0,85 % NaCl/. При наличии микроразмельчи-теля тканей к измельченной ножницами пробе добавляют 20,0 ±0,1 мл буфера, тщательно перемешивают, переносят в стакан от микроразмель-чителя и гомогенизируют образец при максимальной скорости оборотов в течение 3 мин.

Экстракцию антибиотиков проводят в течение 1,5 ± 0,5 час.

При исследовании на гризин и цинкбацитрацин гомогенат прогревают на водяной бане при 65 ± 5 °С 30 мин для инактивации возможных ингибиторных веществ и лучшей десорбции антибиотика.

Центрифугируют пробы при 3000 об/мин в течение 20 ± 1 мин.

Затем поступают либо соответственно ходу определения, описанному в предыдущем п. 9.1 /когда надосадочную жидкость, являющуюся разведением 1:3, и приготовленное из неё разведение 1:6 вносят в лунки зараженной тест-микробом среде, далее по тексту п. 9.1, либо следующим образом;

61

ББК 51.23 С23

С23 Сборник методических документов, необходимых для обеспечения применения Федерального закона от 12 июня 2008 г. № 88-ФЗ «Технический регламент на молоко и молочную продукцию»,—М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009.—76 с.

ISBN 5-7508—0771—1

В сборник включены методические документы, содержащие правила и методы исследований (испытаний) и измерений, а также правила отбора образцов для проведения исследований (испытаний) и измерений, в соответствии с постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации Г. Г. Онищенко от 08.12.2008 № 67.

Настоящие «Методические указания» предназначены санитарно-эпидемиологических станций Минздрава СССР, а также ветеринарных, агрохимических, контрольно-токсикологических лабораторий Минсельхоза СССР к лабораторий других министерств и ведомств занижающихся анализом остаточных количеств пестицидов и биопрепаратов в продуктах питания, кормах и внешней среде.

«Методические указания» подготовлены Главным санитарно-эпидемиологическим управлением Министерства здравоохранения СССР, Государственной комиссией по химическим средствам борьбы с вредителями, болезнями растений и сорняками при Министерстве сельского хозяйства СССР, Всесоюзным научно-исследовательским институтом гигиены и токсикологии пестицидов (лаборатория аналитической химии пестицидов и лаборатория кибернетических исследований пестицидов в окружающей среде), Всесоюзным научно-исследовательским институтом химических средств защиты растений (сектор анализа пестицидов).

ББК 51.23

Технический редактор Г. И. Климова

Подписано в печать 16.12.09 Формат 60x88/16    Печ. л. 4,75

Т ираж 200 экз.    Заказ 100

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия чело вею 127994, Москва, Вадковский пер., д. 18, стр. 5,7

Оригинал-макет подготовлен к печати и тиражирован отделом издательского обеспечения Федерального центра гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора 117105, Москва, Варшавское ш., 19а Отделение реализации, телефакс 952-50-89

© Роспотребнадзор, 2009 © Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009

Надосадочиую жидкость в количестве 0,05 + 0,001 мл от каждого исследуемого образца вносят в 2—3 лунки на 2 параллельные чашки Петри. При определении гризина чашки ставят на 3 часа в холодильник при + 4 °С для преддиффузии.

Засеянные чашки с внесенной в лунки надосадочной жидкостью инкубируют в течение 18 ±0,5 час. при 29 ± 1 °С /определение тетра-циклинов/, либо при 37 ± 0,1 °С/ определение гризина и цинкбацитраци-на/, после чего измеряют диаметры зон задержки роста тест-культуры и производят расчет активности остаточных количеств антибиотиков в исследуемых субстратах /п.п. 10.1,10.2/.

10. УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Измеряют зоны задержки роста тест-культур и производят расчет содержания антибиотиков в исследуемых продуктах либо по таблицам, составленным В. С. Дмитриевой и С. М. Семеновым /Дмитриева В. С., Семенов С. М «Микробиологический контроль активности антибиотических препаратов», М., 1965 г./, /п. ЮЛ/ или по стандартным кривым /п. 10.2/.

10.1. Форма записи измерения зон задержки роста тест-микробов при расчете активности антибиотиков, содержащихся в виде остаточных количеств в пищевых продуктах, по таблицам Дмитриевой В. С.

/Примерный образец/

чашки

Диаметры зон задержки роста тесг-микробов в мм

испытуемое

разведение

/1 : 3/

стандартное разведение 0,05 ед/мл /контроль/

испытуемое

разведение

/1 : 6/

стандартное разведение 0,05 ед/мл /контроль/

1

20

16,5

16

16

20

16,5

16

16

19,5

16,5

16,5

16

среднее

19,8

16,5

16,1

16

2

19

16

17,5

16,5

19

16

17,0

16,5

19,5

16

16,5

16,5

среднее

19,1

16

17

16,5

В среднее зон стандарта каждой чашки вносят поправку по постоянной зоне таблиц, которая равна 17 мм, что соответствует контрольной концентрации стандарта 0,05 ед/мл, а затем поправку вносят в величину зон испытуемого препарата.

62

Содержание

Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей

среды для определения микроколичеств пестицидов...........................4

Методические указания по определению хлорорганических пестицидов в воде, продуктах питания, кормах и табачных

изделиях методом хроматографии в тонком слое................................29

Методические указания по определению остаточных количеств

антибиотиков в продуктах животноводства.........................................46

Методика определения афлатоксинов в пищевых продуктах с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии..............69

3

Утверждаю Заместитель Главного государственного санитарного врача СССР

А. И. ЗАЙЧЕНКО 29 июня 1984 г, № 3049—84

Методические указания по определению остаточных количеств антибиотиков в продуктах животноводства

В целях дальнейшей интенсификации животноводства и птицеводства, повышения производства мяса и других продуктов животного происхождения в сельском хозяйстве нашей страны применяются антибиотики для стимуляции роста, повышения эффективности откорма скота и птицы, а также в качестве лечебно-профилактических средств. Среди них препараты, содержащие тетрациклин, пенициллин, стрептомицин, немедицинские антибиотики гризин, цинкбацитрацин и прочие.

Условия применения антибиотиков для выращивания, откорма и лечения сельскохозяйственных животных и птицы регламентированы Инструкцией, утвержденной МСХ СССР в 1980 г. и Методическими указаниями по применению антибиотиков в ветеринарии (М., 1973 г.), соблюдение которых должно гарантировать безопасность для здоровья населения продуктов, полученных от леченных или стимулированных антибиотиками животных. Однако в силу различных причин в пищевых продуктах, полученных от этих животных в ряде случаев содержатся остатки антибиотиков.

Антибиотики тетрациклинового ряда могут попадать в продукты питания в результате неправильного использования их в качестве и лечебных средств. Наличие в молоке стрептомицина, пенициллина и др. обусловлено чаще всего использованием для лечения маститов коров препаратов длительного действия на масляной основе. Присутствие немедицинских антибиотиков (гризина и пр.) отмечено при включении в корма в экспериментальных условиях в превышенных количествах этих препаратов. Материалы научных исследований свидетельствуют о наличии остаточных количеств антибиотиков в мясных, молочных продуктах, яйцах. Вместе с тем, длительное использование в пищу продуктов, содержащих остаточные количества антибиотиков, может вызвать неблагоприятные для здоровья человека последствия - аллергические реакции, дисбактериоз, образование и передачу резистентных форм мик-

46

робов. Экспериментально установленные при этом уровни неблагоприятного действия антибиотиков на организм позволили обосновать величины максимально-допустимого суточного поступления их в организм человека с продуктами питания и сделать вывод, что при санитарном контроле продуктов питания остаточные количества антибиотиков в них не должны допускаться при использовании предлагаемых ниже утверждённых методов исследования в пределах их чувствительности /для хлортетрациклина пенициллина - 0,01, стрептомицина - 0,5, гризи-на и цинкбацитрина - 0,1 и 0,02 ЕД на г/мл/продукта).

Повышение эффективности санитарного надзора по предупреждению попадания в продукты питания антибиотиков должно осуществляться путем периодического отбора на мясокомбинатах, молочных заводах, в животноводческих и птицеводческих хозяйствах, торговой сети проб молока, молочных продуктов, мяса, субпродуктов, яиц для определения в них антибиотиков. Необходимо выявлять хозяйства, поставляющие пищевые продукты, загрязненные антибиотиками, выявлять причины попадания в них антибиотиков и принимать меры для устранения этих нарушений, не допускать снабжения пищевыми продуктами, содержащими остаточные количества антибиотиков, детских учреждений, больниц и т. л.

Реализация молока с наличием остаточных количеств антибиотиков решается в каждом конкретном случае представителями Государственного санитарного и ветеринарного надзора.

Молоко, содержащее остаточные количества любых антибиотиков, может использоваться в качестве дополнительного кормового средства при откорме молодняка сельскохозяйственных животных.

Творог, сметану, яйца содержащие остаточные количества антибиотиков тетрациклинового ряда, пенициллина, следует направлять на изготовление хлебобулочных и кондитерских изделий с расчетом, чтобы соотношение «загрязненных продуктов» с другими компонентами изделий было не меньшим, чем 1 :4 /при содержании остаточных количеств антибиотиков до 0,05 ЕД/г/, 1 :10 и 1 : 100 - при содержании остаточных количеств антибиотиков до 0,1 ЕД/г и до 1,0 ЕД/г и более, соответственно.

Мясо и субпродукты, содержащие остаточные количества антибиотиков, не следует в необработанном виде реализовывать населению. Такое мясо должно направляться на изготовление мясных, мясорастительных консервов, за исключением консервов для детского питания, концентратов I и II блюд, вареных и варено-копченых колбас при условии

47

обязательной подсортировки к мясу или компонентам блюд, не содержащих остаточных количеств антибиотиков. Средне-расчетная кратность разведения «загрязненного» антибиотиками мяса незагрязненным должна составлять 17 /по данным Института питания АМН СССР/. В каждом конкретном случае вопрос о реализации и использовании мяса с наличием остаточных количеств антибиотиков решается представителями Государственного санитарного и ветеринарного надзора с условием, что при подсортировке кратность соотношения «загрязненных» и незагрязненных продуктов должна зависеть от выявленной концентрации антибиотика, с тем, чтобы в конечном итоге содержание остаточного количества антибиотика было ниже уровня чувствительности утвержденных методов исследования.

Например, в образцах мышечной ткани от говяжьей туши № «    »,

поступившей на забой из с-х «... -окий», выявлено содержание хлортет-рациклина на уровне 0,2 ЕД/г. Следовательно, чтобы содержание антибиотика в продукте снизилось до менее 0,01 ЕД/г, мясо от этой туши должно быть направлено на приготовление колбас при условии введения в фарш в размере не более 5 % к общей массе продукта. В совхоз должно быть направлено предписание о нарушении инструкций по применению антибиотиков в ветеринарии или при откорме животных, а к руководителю хозяйства приняты административные меры.

При реализации продуктов питания, содержащих остаточные количества стрептомицина, гризина, цинкбацитрацина, должен использоваться такой же подход подсортировки к незагрязненному антибиотиками сырью с учетом выявленной концентрации антибиотика и соответствующей кратностью разведения.

Обеспечить полную безопасность продуктов, содержащих остаточные количества антибиотиков, для потребителей может только четкая организация проведения гигиенических мероприятий, строгий контроль за применением антибиотиков в животноводстве и ветеринарии и выявление их в продуктах питания животного происхождения с помощью чувствительных методов.

6 целях систематического контроля в стране за загрязнением продуктов животноводства антибиотиками предлагаются данные «Методические указания по определению остаточных количеств антибиотиков в продуктах животноводства». Наиболее широкое применение как в научных исследованиях, так и в практических учреждениях, нашли микробиологические методы, позволяющие определять минимальные концентрации антибиотиков в исследуемом материале. Они основаны на непо-

48

средственном биологическом действии антибиотиков на чувствительные штаммы микроорганизмов и поэтому наиболее специфичны и объективны. Ниже рекомендуются методы определения некоторых антибиотиков:

а)    тетрациклиновой группы - в молоке, молочных продуктах, яйцах, мясе, мясных продуктах, в т. ч. мясе и субпродуктах птицы;

б)    стрептомицина - в молоке и молочных продуктах, яйцах;

в)    пенициллина - в молоке и молочных продуктах;

г)    гризина - в мясе;

д)    цинкбацитрацина - в мясе.

Содержание антибиотиков выявляют микробиологическим методом диффузии в агар по величине торможения роста следующих тест-культур, внесенных в питательные среды:

-для тетрациклиновых антибиотиков - Вас. cereus АТСС 11778 /чувствительность-0,01 ЕД/г/мл/;

-    для стрепомицина - Вас. micoidis 537 /чувст. 0,5 ЕД/г/мл/;

-для пиницилина-5. lutea АТСС 9341 /чувст. 0,01 ЕД/г/мл/;

-    для гризина - Вас. cubtilis АТСС 6633/чувст. 0,5 ЕД/г/мл/;

-    для цинкбацитрацина - М. flavus АТСС 10240 /чувст. 0,02 ЕД/г/мл/.

Молоко рекомендуется исследовать на присутствие остаточных количеств антибиотиков в том случае, когда при предварительном исследовании по ГОСТ 23454-79 в нем обнаружены ингибирующие вещества и исключено наличие химических веществ.

ОТБОР ПРОБ, САНИТАРНЫЙ КОНТРОЛЬ И ОТЧЕТНОСТЬ

Отбор проб молока и молочных продуктов производится по ГОСТ 13928-68 и 9225-68, но не более 50 мл каждой пробы; мяса и мясных продуктов по ГОСТ 7269-79, но не более 50 гр. каждой пробы; яйца отбирают в пределах 0,5—1 % /в зависимости от объема партии/.

Санитарный контроль за содержанием антибиотиков в молочных, мясных продуктах, яйцах следует проводить не реже 1 раза в квартал. Количество проб для анализа и перечень антибиотиков определяют в зависимости от состояния вопроса в каждой местности. Органы ветнадзора должны информировать санитарно-эпидемиологическую службу о применяемых в данном районе, области в животноводческих хозяйствах антибиотиках в качестве кормовых или лечебных препаратов.

В случае обнаружения антибиотиков в пищевых продуктах необходимо применять административные меры к руководителям хозяйств за нарушение Инструкций по применению антибиотиков в ветеринарии и

49

при, выращивании скота. Врачам по гигиене питания, специалистам ведомственной санитарной службы, ветнадзора следует проводить разъяснительную работу о недопустимости загрязнения пищевых продуктов остаточными количествами антибиотиков.

Материалы по результатам исследований продуктов животноводства на загрязнение антибиотиками в целом по району, области, республике должны ежегодно обобщаться и анализироваться в целях принятие конкретных профилактических мер.

1. АППАРАТУРА

1.    Автоклав /стерилизатор паровой/, ГОСТ 19569-74.

2.    Бумага масштабно-координатная марки ПЛН ГОСТ 334-73 / полулогарифмическая сетка для расчета активности растворов антибиотиков/.

3.    Весы лабораторные равноплечие ВЛР-200 г ТУ 25.06.1131—75.

4.    Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания 1х10'3- 0,2 кг по ГОСТу 24104-80.

5.    Водяная баня лабораторная /Аппарат для инактивирования сыворотки крови МРТУ 42 Л091—63/.

6.    Горелка газовая или спиртовая по ГОСТу 10090—74.

7.    Ионометр универсальный /pH-метр/ ЭВ-74.

8.    Колбы стеклянные конические вместимостью 50, 100, 200, 1000 см3 по ГОСТу 10394—72.

9.    Линейка по ГОСТу 17435—72.

10.    Матрацы стеклянные лабораторные вместимостью 1000 см3.

11.    Мерные колбы и стаканы стеклянные лабораторные на 50, 100, 500 и 1000 ом3 по ГОСТу 23932—79.

12.    Микроскоп МБИ или МБР по ГОСТу 8284—78.

13.    Микроразмельчитель тканей типа РТ-2 МРТУ 04.1.1505—63 /или фарфоровая ступка с пестиком по ГОСТу 9147—73 и кварцевый песок/.

14.    Ножницы по ГОСТу 21239—77, скальпель ГОСТ 21240-77, пинцеты по ГОСТу 31241—77.

15.    Палочки стеклянные

16.    Петля бактериологическая

17.    Пробочное сверло 9 мм

18.    Пипетки измерительные градуированные вместимостью 1,0, 2,0, 5,0, 10,0 см3 по ГОСТу 20292—74.

19.    Пробирки стеклянные химические 16 мм по ГОСТу 23932—79.

20.    Пробирки центрифужные емкостью 10 см3.

50

21.    Стеклянный стандарт мутности для оптической стандартизации бактерийных взвесей.

22.    Сушильный шкаф круглый по ТУ 64-1-1411.

23.    Термостаты электрические с водяной рубашкой по МРТУ 421878—60.

24.    Трафарет для вырезания лунок.

25.    Уровень для установления горизонтальной поверхности.

26.    Холодильник бытовой по ГОСТу 16317—70.

27.    Центрифуга лабораторная стационарная ЦЛС-31М по ГОСТу 51107—71; центрифуга настольная ЦЛН-2 МРТУ 421742—63.

28.    Цилиндры мерные на 50,100,250,1000 см3 по ГОСТу 1770—74.

29.    Чашки биологические стеклянные тип Петри по ГОСТу 23932—79, а также чашки из полимерных материалов.

30.    Штативы для пробирок на 20—40 гнезд по ТУ 64-1-2669—78.

2. КОМПОНЕНТЫ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

1.    Агар-агар микроскопический по ГОСТу 17206—71

2.    Мясо-пептонный бульон по ГОСТу 20730—75

3.    Дрожжевой экстракт /экстракт кормовых дрожжей, сухой производство МНИИВС/

4.    Мясная вода по ГОСТу 20729—75

5.    Панкреатический гидролизат казеина

6.    Пепсин медицинский

7.    Пептон сухой ферментативный ГОСТ 13805-76

8.    Бульоны Хоттингера с содержанием аминного азота 33 мг%, 100 мг%, 130—140 мг% по ГОСТу 10444.1—75

3. РЕАКТИВЫ

1.    Глюкоза кристаллическая ХЧ по ГОСТу 975—76

2.    Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72

3.    Натрия гидрат окиси /натр едкий/ ГОСТ 4328-66,10 р-р

4.    Натрия лимоннокислый, х.ч. ГОСТ 22280-76

5.    Калия фосфат однозамещенный, х.ч. ГОСТ 4198-65

6.    Калия фосфат двухзамещенный, х.ч. ГОСТ 2493-65

7.    Натрия фосфат двухзамещенный, х.ч. ГОСТ 11773-66

8.    Спирт этиловый, ректификованный по ГОСТ 5262-67

9.    Кислота соляная, х.ч. уд. вес 1.18—1.19

10.    Натрий хлористый, х.ч. по ГОСТу 4233—77

11.    Стандарты антибиотиков производства ГИСК им. ЛА.Тарасевича

51